La neurofibromatose de type 1 (NF1) est un syndrome de prédisposition tumorale causée par une mutation perte-de-fonction du gène suppresseur de tumeurs NF1. Près de la moitié des patients atteints de NF1 développent un type de tumeurs bénignes des gaines des nerfs périphériques appelés neurofibromes plexiformes. Ces tumeurs sont majoritairement constituées de cellules de Schwann présentant une inactivation somatique du deuxième allèle NF1. Les neurofibromes plexiformes peuvent se transformer en tumeurs malignes dénommées MPNST (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor) qui sont des sarcomes extrêmement agressifs, résistants aux thérapies actuelles et représentant la première cause de mortalité des patients NF1. A ce jour, les acteurs à l’origine de cette transformation maligne ne sont pas clairement établis. Leur identification représente donc un enjeu majeur pour une prise en charge appropriée des patients et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques. Dans ce contexte, le travail mené au cours de ma thèse a eu pour objectifs la recherche et la caractérisation de nouvelles voies de signalisations impliquées dans la tumorigenèse NF1. D’une part, une approche orientée par les travaux antérieurs au laboratoire a permis de montrer l’implication de la voie WNT dans la tumorigenèse NF1. D’autre part, une approche génomique plus large a conduit à la mise en évidence de l’inactivation du répresseur transcriptionnel PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) dans près de la moitié des MPNST. La génération de modèles cellulaires in vitro a facilité l’exploration des gènes surexprimés lors de la perte de fonction du PRC2. Elle a également permis d’entreprendre un crible lentiCRISPR pan-génomique à la recherche des gènes essentiels à la survie des cellules tumorales mutées pour le PRC2. / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a tumor predisposition syndrome caused by loss-offunction mutations in the NF1 tumor suppressor gene. Almost half of NF1 patients develop a specific type of benign peripheral nerve sheath tumor called plexiform neurofibromas. These tumors are mainly composed of Schwann cells in which the second NF1 allele is inactivated. Plexiform neurofibromas can give rise to malignant tumors called MPNST that are extremely aggressive sarcomas, resistant to therapy and which represents the first cause of early demise of NF1 patients. The molecular mechanisms underlying this malignant transformation remain enigmatic. Their identification is crucial for appropriate management of NF1 patients and development of new therapies. The goal of my PhD was to identify and characterize new signaling pathways involved in NF1 tumorigenesis. On the one hand, we highlighted the involvement of WNT pathway in NF1 tumorigenesis. On the other hand, a larger genomic approach led to the identification of the transcriptional repressor PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) inactivation in almost half of MPNST. We have generated various cell models, which facilitated the exploration of genes aberrantly expressed consequently to PRC2 loss-offunction. These models also allowed performing a pan-genomic lentiCRISPR screen searching for essential genes for PRC2-mutated tumor cells survival.

Les troubles neuropsychologiques constituant une complication commune associée à la Neurofibromatose de Type 1 (NF1), nous avons cherché à étayer l'hypothèse d'un dysfonctionnement exécutif chez les enfants porteurs de cette pathologie neurogénétique. Vingt-deux tâches exécutives ont été adaptées et proposées à 36 patients de 7 à 12 ans et 120 contrôles en les confrontant aux plaintes parentales à l'aide de 2 questionnaires. Les résultats valident l'idée d'un trouble exécutif spécifique (indépendant du fléchissement intellectuel et visuo-spatial retrouvé par ailleurs), hétérogène (plusieurs profils dissociés identifiés selon le(s) processus concerné(s) : planification, inhibition, flexibilité) et durable, malgré une régression partielle corroborée par les questionnaires. De plus, les symptômes exécutifs contribuent aux déficits instrumentaux et potentiellement à l'abaissement du niveau général. En outre, des difficultés accrues caractérisent les formes familiales, sans que le niveau scolaire parental inférieur soit le seul facteur explicatif. Enfin, l'absence de lien entre profil dysexécutif et localisation préférentielle d'objets brillants non identifiés dans les circuits fronto-sous-corticaux du cerveau pourrait provenir du manque de visibilité longitudinale des mesures radiologiques. L'hypothèse d'un syndrome dysexécutif neurodéveloppemental constitue une piste explicative inédite dans la NF1 et laisse entrevoir de nouvelles perspectives de remédiation. Les données favorisent au plan théorique l'hypothèse d'une indépendance des fonctions exécutives et justifient une démarche d'évaluation clinique orientée vers la décomposition des processus impliqués dans chaque tâche.

Thèse de doctorat : Psychologie : Angers : 2007. / Bibliogr. p. 257-293.

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L'autisme et la déficience mentale (DM) sont des pathologies neurodéveloppementales fréquentes qui partagent des facteurs génétiques communs. Afin de mieux comprendre leur étiologie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de la neurofibromatose de type 1 (NF1), qui est souvent associée à l'autisme et à la DM. La neurofibromine, dont le gène est muté dans la NF1 interagit avec LIMK2. Cette protéine fait partie de la voie des Rho-GTPases dont des mutations de plusieurs membres ont été trouvés mutés dans des cas d'autisme et de DM. Chez le rat, nous avons montré que l’expression de Limk2d, une isoforme sans domaine kinase, augmente la croissance des neurites des cellules neuronales NSC-34. Chez l'homme, LIMK2-1 est la seule isoforme qui comporte un domaine inhibiteur de la phosphatase 1 (PP1i). Nous avons montré que l’expression de cette protéine diminue la longueur des neurites des cellules NSC-34 in vitro. Nous avons observé l'association de la variation située dans le domaine PP1i à la DM (p.S668P, rs151191437) (p=0,04, test de Fisher, OR = 3,29). Elle abolit l’effet inhibiteur de croissance des neurites de l'isoforme LIMK2-1 diminue l'interaction de LIMK2-1 avec la neurofibromine. La fréquence de l'autisme est plus élevée chez les patients atteints ayant des délétions de 14 gènes du locus NF1. Nous avons observé une association entre la variation R115K (rs111902263) du gène RNF135 de ce locus et l'autisme (p=0,00014, test de Fisher) ainsi qu’une anomalie du nombre de copies située dans l'intron 2 de ce gène chez un d’entre eux. Ce travail souligne la spécificité de deux isoformes de LIMK2 sur la croissance des neurites. Il renforce l’intérêt d’étudier l’implication du gène RNF135 dans l’autisme. Des études fonctionnelles seront entreprises afin de confirmer le rôle de LIMK2 et de RNF135 dans l'étiologie de l'autisme et de la DM. / Autism and mental deficiency (MD) are two neurodevelopemental diseases which share genetic factors in common. To better understand their etiologies, we studied the molecular mechanisms of neurofibromatosis type 1, a pathology frequently associated with autism and MD. Neurofibromatosis type 1 is due to deletions or mutations of the NF1 gene which encodes neurofibromin. This protein interacts with several proteins such as LIMK2. This protein belongs to the Rho-GTPases pathway in wich mutations of numerous members have been associated with autism and MD. In our study, we showed that LIMK2 isoforms do not only have important structural differencies but have also functional specificities. Limk2d, which lacks the kinase domain, promotes neurite outgrowth of NSC-34 cells. On the contrary, LIMK2-1, which is primate specific and has a C-terminal PP1i domain, inhibits neurite outgrowth. Analysis of the LIMK2-1 coding sequence, revealed the association between MD and a variation located in the PP1i domain, S668P (rs151191437) (p=0.04, Fisher test, OR = 3.29). This variation abrogated the LIMK2-1 effect on neurite outgrowth and inhibited LIMK2-1 interaction with neurofibromin. Deletions occuring in neurofibromatosis type 1 which include the NF1 gene and 13 others are associated with a higher frequency of autism. Mutations of one of them, RNF135, have been identified in patients with MD and overgrowth syndrome. Two of these patients also presented autistic features. By analysing RNF135 gene in autistic patients, we showed the association of the variation R115K (rs111902263) with autism. We also identified a duplication of a region located in RNF135 gene intron 2 in one patient presenting autism and MD. Our results highlight the importance and specificity of LIMK2 isoforms on neurite outgrowth and strengthen the importance to analyze both the sequence and copy-number of RNF135 gene. Further functional experiments will be undertaken to confirm the implication of LIMK2 and RNF135 in autism and MD etiology.

LIMK1 et LIMK2 sont des sérines/thréonine kinases capables de phosphoryler et d’inactiver la cofiline, un facteur de dépolymérisation de l’actine. Elles sont régulées négativement par la neurofibromine, responsable de la neurofibromatose de type 1, et pourraient être impliquées à la fois dans les aspects tumoraux et cognitifs de cette maladie par leur rôle dans la dynamique de l’actine. Nous avons étudié l’isoforme LIMK2‐1 de LIMK2, spécifique des hominidés et précédemment associée à la déficience intellectuelle. Cette isoforme possède un domaine kinase tronqué et un domaine inhibiteur de la phosphatase 1 (PP1i) en C‐terminal. Nos résultats montrent, d’une part, que LIMK2‐1 existe sous forme de protéine et qu’elle est exprimée dans le système nerveux central chez l’homme, en particulier au cours du neurodéveloppement. D’autre part, il apparaît que cette isoforme favorise la polymérisation de l’actine. Cette action semble indépendant de l’activité kinase puisque LIMK2‐1 ne phosphoryle pas la cofiline. Nous avons également montré que le domaine PP1i interagissait spécifiquement avec la phosphatase 1 et des résultats complémentaires suggèrent un rôle de ce domaine dans l’inhibition de la dépolymérisation de l’actine. Ces données mettent en évidence un mécanisme moléculaire nouveau pour une protéine de la famille des LIMK et soulignent l’intérêt d’étudier ces protéines afin de mieux comprendre leur implication dans les troubles cognitifs et dans la neurofibromatose de type 1. / LIMK1 and LIMK2 are serine/threonine kinases that phosphorylate and subsequently inactivate cofilin, an actin-depolymerizing factor. Neurofibromin, the protein responsible for neurofibromatosis type 1, negatively regulates these proteins that may be involved in tumoral and cognitive aspects of the disease through their role in actin dynamics. We studied LIMK2-1, a hominidae-specific isoform previously involved in intellectual disability. This isoform possesses a truncated kinase domain and a protein phosphatase 1 inhibitory (PP1i) domain at its C-terminal extremity. Our results showed that LIMK2-1 exists at a protein level and that it is expressed in human central nervous system, especially during neurodevelopment. Moreover, LIMK2-1 promotes actin polymerization independently from a kinase activity, since this isoform does not phosphorylate cofiline. We also highlighted an interaction between the PP1i domain and protein phosphatase 1 and complementary results suggest a role of this domain in the inhibition of actin depolymerization. These data highlight a new molecular mechanism for a LIMK protein and emphasize the interest of studying these proteins to understand their involvement in cognitive disorders and in neurofibromatosis type 1.

Les données de la littérature concernant les difficultés cognitives et comportementales dans la Neurofibromatose de type 1 (NF1) sont nombreuses avec des résultats parfois contradictoires. Après une revue de la littérature, ce travail de recherche : (i) décrit les difficultés comportementales, cognitives et motrices chez 78 patients atteints de NF1, âgés de 5 à 18 ans, au moyen de questionnaires aux parents (qualité de vie, impact de la maladie, difficultés des parents eux-mêmes, Conners, BRIEF, CBCL), et d'une évaluation de l'efficience intellectuelle et neuropsychologique détaillée ; (ii) analyse les relations entre les aspects cliniques, comportementaux, neuropsychologiques et l'imagerie (présence ou non d'« Objets Brillants Non Identifiés » caractéristiques de la NF1). Les difficultés d'apprentissage, malgré une qualité de vie plutôt bonne et un faible impact de la maladie, les troubles attentionnels et l'anxiété de l'enfant constituaient les principales sources d'inquiétude des parents. Les questionnaires étaient corrélés entre eux, mais ils étaient peu liés aux tests neuropsychologiques. La présence de difficultés cognitives spécifiques, en particulier visuo-spatiales et en motricité fine, a été confirmée. Aucune relation n'a pu être établie entre la neuropsychologie et l'imagerie. Les difficultés neuropsychologiques étaient plus sévères dans les formes familiales que sporadiques. / Cognitive and behavioral difficulties are common in children with Neurofibromatosis type 1 (NF1), however findings concerning the specific neuropsychological and behavioral profile as well as the association of these difficulties with clinical manifestations and brain imagery abnormalities are often contradictory. After a literature review, the present study: (i) describes behavioral, cognitive, and motor difficulties in 78 patients with NF1, aged 5 to 18 years, using parental questionnaires (quality of life, impact of illness, parental difficulties, Conners, BRIEF, CBCL), and tests of intellectual efficiency and specific neuropsychological functions; (ii) examines the relationships between clinical, behavioral, neuropsychological and imaging findings (presence or absence of "Unidentified Bright Objects" UBOs, characteristic feature of NF1). Learning disabilities, despite relatively good report of quality of life, attention disorders and child anxiety were the main parental concerns. All parental questionnaires were strongly inter-correlated, and associated with an overall positive or negative parental attitude during the interview with the psychologist. Parental concerns were only weakly related to neuropsychological tests. The presence of specific cognitive difficulties, particularly in visuospatial and fine motor skills, was confirmed. Imaging data were not associated with neuropsychological scores. Cognitive difficulties were more important in familial than sporadic forms.

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une condition génétique entraînant des répercussions dans différents systèmes, y compris le système nerveux. Les enfants atteints de la NF1 sont à risque de rencontrer différents défis sur le plan cognitif et comportemental. Un chevauchement avec les symptômes associés à d’autres troubles neurodéveloppementaux, notamment le trouble déficitaire de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) et le trouble du spectre de l’autisme (TSA), est d’ailleurs présent dans cette condition génétique. Les études réalisées avec des modèles animaux de NF1 ont permis d’identifier des déséquilibres dans la neurotransmission qui pourraient sous-tendre les déficits cognitifs. Comment ces déséquilibres se traduisent sur le plan de l’activité cérébrale chez l’humain ayant la NF1 demeure peu compris à ce jour. L’objectif général de cette thèse est donc d’étudier, à l’aide de l’électroencéphalographie (EEG), les réponses neuronales lors du traitement sensoriel chez les enfants ayant la NF1 ainsi que les associations avec le fonctionnement cognitif et comportemental. Dans le premier article, nous avons étudié l’intégrité de la réponse de synchronisation neuronale lors de stimulations visuelles rythmiques à différentes fréquences. Considérant l’importance des déficits visuo-perceptifs ainsi que les indices de perturbations de la transmission GABAergique au niveau du cortex occipital dans la NF1, nous avons émis l’hypothèse d’une réduction de la synchronisation neuronale dans le groupe NF1 par rapport au groupe d’enfants neurotypiques. Une puissance réduite de la synchronisation neuronale a effectivement été trouvée dans la NF1, particulièrement en réponse à la plus haute fréquence de stimulation. Cette réponse neuronale affaiblie a été corrélée à une plus grande sévérité des symptômes comportementaux du TDAH. Cela soulève la possibilité d’une modulation de la réponse sensorielle par les réseaux attentionnels et soulève également des questions en lien avec l’impact du diagnostic de TDAH en comorbidité avec la NF1. L’impact de la médication psychostimulante, testé avec un sous-groupe de l’échantillon NF1, s’est d’ailleurs révélé par une amélioration de la réponse de synchronisation neuronale à la plus faible fréquence de stimulation. La réponse de synchronisation neuronale apparait donc comme un marqueur à investiguer davantage pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent les déficits cognitifs dans la NF1 et pour évaluer l’impact de traitements. Dans le deuxième article, nous avons étudié les oscillations cérébrales dans la réponse de suppression neuronale et de détection du changement, toujours en comparant un groupe d’enfants ayant la NF1 à un groupe d’enfants neurotypiques. Une modulation atypique des oscillations cérébrales était attendue dans la NF1 en réponse à la répétition et au changement dans la séquence de stimuli audio-visuels. Les résultats ont démontré une réponse de suppression neuronale préservée dans le groupe NF1, mais une puissance accrue des oscillation thêta dans la condition de détection du changement. Les symptômes comportementaux du TDAH ont été associés à une réduction de la puissance des oscillations dans la réponse de détection du changement et ne contribueraient donc pas à la réponse accrue identifiée dans le groupe NF1. En somme, les résultats de la thèse ont permis d’identifier des particularités dans les réponses électrophysiologiques du traitement sensoriel chez les enfants ayant la NF1 et de mettre de l’avant des mesures dont le potentiel translationnel pourrait faciliter le transfert des connaissances accumulées dans les modèles animaux de NF1. Les résultats soulignent la complexité d’établir les bases neuronales des déficits cognitifs dans la NF1 compte tenu de l’hétérogénéité du profil cognitif. Cela dit, les associations établies entre les réponses neuronales et les symptômes comportementaux du TDAH suggèrent la possibilité de considérer le profil électrophysiologique pour guider le développement de traitements et interventions visant à améliorer le fonctionnement cognitif chez les enfants ayant la NF1. / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a genetic condition that has implications across different systems, including the nervous system. Children with NF1 are at risk of facing various cognitive and behavioral challenges. An overlap with symptoms associated with other neurodevelopmental disorders, including attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder (ASD), is also present in this genetic condition. Studies conducted using animal models of NF1 have identified imbalances in neurotransmission that may underlie cognitive deficits. However, how these imbalances translate into human brain activity in individuals with NF1 remains poorly understood to date. The overall objective of this thesis is to investigate, using electroencephalography (EEG), neural responses during sensory processing in children with NF1 and their associations with cognitive and behavioral functioning. In the first article, we studied the integrity of the neural synchronization response during rhythmic visual stimulation at different frequencies. Given the significance of visuo-perceptual deficits as well as indications of disrupted GABAergic transmission in the occipital cortex of individuals with NF1, we hypothesized a reduction in neural synchronization in the NF1 group compared to neurotypical children. Reduced power of neural synchronization was indeed found in NF1, particularly in response to the highest stimulation frequency. This weakened neural response was correlated with greater severity of ADHD behavioral symptoms. These results suggest a possible modulation of this sensory response by attentional networks and raise questions regarding the impact of comorbid ADHD diagnosis on neural activity in NF1. The intake of psychostimulant medication, in a subgroup of the NF1 sample, resulted in an increased neural synchronization at the lowest stimulation frequency. Neural synchronization should be further investigated as a potential biomarker in NF1 and could help understand the underlying mechanisms of cognitive deficits and assess the impact of treatments. In the second article, we studied brain oscillations in the repetition suppression and change detection response, again comparing a group of children with NF1 to a group of neurotypical children. Atypical modulation of brain oscillations was expected in NF1 in response to repetition and change in the audio-visual stimuli sequence. Results showed preserved repetition suppression response in the NF1 group, but increased power of theta oscillations in the change detection condition. Behavioral symptoms of ADHD were associated with reduced oscillatory power in the change detection response, which suggest that the ADHD comorbidity did not contribute to the increased response identified in the NF1 group. In summary, results of this thesis have demonstrated distinct electrophysiological responses during sensory processing in children with NF1 and have highlighted measures with translational potential that could facilitate the transfer of knowledge gained from animal models of NF1. The results emphasize the complexity of establishing the neural basis of cognitive deficits in NF1, given the heterogeneity of the cognitive profile. However, the associations established between neural responses and ADHD behavioral symptoms suggest the possibility of considering the electrophysiological profile to guide the development of treatments and interventions aimed at improving cognitive functioning in children with NF1.