Lipids are important for structural and physiological functions of neuronal cell membranes. They exhibit a range of biological effects many are bioactive lipid mediators derived from polyunsaturated fatty acids such as sphingolipids, fatty acid ethanolamides (FA-EA) and endocannabinoids (EC). These lipid mediators and oxysterols elicit potent bioactive functions in many physiological and pathological processes of the brain and neuronal tissues. They have been investigated for biomarker discovery of ageing, neuroinflammation and neurodegenerative disorders. The n-3 fatty acids EPA and DPA are thought to exhibit a range of neuroprotective effects many of which are mediated through production of such lipid mediators. The aims of this study were to evaluate the effects of n-3 EPA and n-3 DPA supplementation on RBC membranes and in this way assess dietary compliance and to investigate brain sphingomyelin species of adult and aged rats supplemented with n-3 EPA and n-3 DPA to evaluate the effects and benefits on age-related changes in the brain. Furthermore, to study the effects of lithium on the brain FA-EAs and ECs to further understand the neuroprotective effects of lithium neuroprotective action on neuroinflammation as induced by LPS. Finally to examine if circulating oxysterols are linked to the prevalence of ALS and whether RBC fatty acids are markers of this action in relation to age and disease stages. These analytes were extracted from tissue samples and analysed with GC, LC/ESI-MS/MS and GC-MS. It was found that aged rats exhibited a significant increase in brain AA and decrease in Σn-3 and Σn-6 PUFAs when compared to adult animals. The observed increase of brain AA was reversed following n-3 EPA and n-3 DPA supplementation. Sphingomyelin was significantly increased when aged animals were supplemented with n-3 DPA. LPS treatment following lithium supplementation increased LA-EA and ALA-EA, while it decreased DHA-EA. Both oxysterols 24-OH and 27-OH increased in ALS patients and SOD1-mice. Eicosadienoic acid was different in ASL-patients compared to aged SOD1-mice. These studies demonstrated that dietary intake of n-3 EPA and n-3DPA significantly altered RBC fatty acids and sphingolipids in rat brain. They suggest that n-3 DPA can be a potential storage form for EPA, as shown by retro-conversion of n-3 DPA into EPA in erythrocyte membranes, ensuring supply of n-3 EPA. Also, n-3 EPA and n-3 DPA supplementation can contribute to an increase in brain sphingomyelin species with implications for age effects and regulation of brain development. Effects of lithium highlight novel anti-neuroinflammatory treatment pathways. Both 24-hydroxycholesterol and eicosadienoic acid may be used as biomarkers in ALS thereby possibly helping to manage the progressive stages of disease.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT. / Excitotoxicity has been implicated as a major pathophysiological mechanism in the pathogenesis of thiamine deficiency (TD). Excitotoxic-mediated cell death is localized in areas of focal vulnerability in TD and may occur as a consequence of impairment in mitochondrial energy metabolism, sustained cell membrane depolarization and decreased uptake of glutamate by astrocytes due to the loss of excitatory amino acid transporters, (EAAT1 and EAAT2). Over the years, a number of studies have identified glutamate as being a major contributor to excitotoxicity in the pathophysiology of TD. Thus, downregulation of astrocytic glutamate transporters resulting in excitotoxicity is a key feature of TD and understanding the regulation of these transporters is essential to understanding the pathophysiology of the disorder. The objective of the present thesis project was to examine the underlying basis of astrocytic glutamate transporter regulation during TD encephalopathy. Major findings of the studies presented in this thesis project provide evidence for glutamate transporter abnormalities in TD animal models and astrocyte cultures exposed to TD. TD results in the loss of the glutamate transporter splice variant-1b (GLT-1b) in vulnerable areas of brain, i.e. thalamus and inferior colliculus, with no significant alteration in the mRNA levels of the transporters, suggesting that glutamate transporter regulation under conditions of TD is a posttranscriptional event. Studies using a specific inhibitor of the transcription factor, Nuclear factor-kappa B (NF-κB) and a nuclear enzyme poly (ADP)ribose polymerase-1 (PARP-1) provided evidence for the regulation of GLT-1 by PARP-1 dependent NF-κB signalling pathways. The major findings of this study suggested an increase in the activation of PARP-1 and NF-κB molecule in the vulnerable areas of TD rat brain and TD astrocyte cultures. Pharmacological inhibition of NF-κB showed an increase in the levels of GLT-1, while inhibition of PARP-1 using a specific PARP-1 inhibitor, DPQ inhibited the increased activation of NF-κB that was observed during TD. Overall results of this finding provided evidence for a mechanism involving PARP-1 activation in the regulation of glutamate transporters. Given the increased lactate accumulation as a classical feature of TD, we studied the effect of soluble factors produced by astrocytes on glutamate transporter function. Treatment of naïve astrocyte cultures with TD conditioned media resulted in decreased levels of GLT-1 and inhibition of glutamate uptake capacity concomitant with a loss of mitochondrial membrane potential. Administration of exogenous lactic acid produced a similar reduction in glutamate uptake to that resulting from conditioned media. However, lactic acid treatment did not result in a change in GLT-1 protein levels. In addition, the pro-inflammatory cytokine TNF-α was shown to be increased in astrocytes treated with TD along with elevated levels of the phospho-IκB fragment, indicative of increased activation of NFκB. Inhibition of NFκB led to an amelioration of the decrease in GLT-1 that occurs in TD, along with recovery of glutamate uptake. Thus, soluble factors released from astrocytes under conditions of metabolic impairment such as lactate and TNF-α impairment appear to exert a regulatory influence on glutamate transporter function. Ceftriaxone, a β-lactam antibiotic, has the ability to differentially stimulate GLT-1b (splice-variant) expression in the inferior colliculus in TD rats and under in vitro conditions with TD astrocyte cultures. Thus, ceftriaxone may be a potential therapeutic strategy in the regulation of glutamate transporter function during TD. In summary, excitotoxic cell death in TD occurs as a consequence of mitochondrial dysfunction associated with cerebral energy impairment and abnormal glutamate transporter status. A major underlying mechanism for glutamate transporter abnormalities is mediated by PARP-1 dependent NF-κB signaling pathways. In addition, metabolic inhibition with substantial production of lactate and TNF-α may be perhaps another mechanism responsible for glutamate transporter downregulation in TD.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2001. / Härtill 4 uppsatser.

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Synuclein, Parkinson's disease, network activity, neuron, tau protein, neurodegeneration, connectivity, cAMP,

Lipids are important for structural and physiological functions of neuronal cell membranes. They exhibit a range of biological effects many are bioactive lipid mediators derived from polyunsaturated fatty acids such as sphingolipids, fatty acid ethanolamides (FA-EA) and endocannabinoids (EC). These lipid mediators and oxysterols elicit potent bioactive functions in many physiological and pathological processes of the brain and neuronal tissues. They have been investigated for biomarker discovery of ageing, neuroinflammation and neurodegenerative disorders. The n-3 fatty acids EPA and DPA are thought to exhibit a range of neuroprotective effects many of which are mediated through production of such lipid mediators. The aims of this study were to evaluate the effects of n-3 EPA and n-3 DPA supplementation on RBC membranes and in this way assess dietary compliance and to investigate brain sphingomyelin species of adult and aged rats supplemented with n-3 EPA and n-3 DPA to evaluate the effects and benefits on age-related changes in the brain. Furthermore, to study the effects of lithium on the brain FA-EAs and ECs to further understand the neuroprotective effects of lithium neuroprotective action on neuroinflammation as induced by LPS. Finally to examine if circulating oxysterols are linked to the prevalence of ALS and whether RBC fatty acids are markers of this action in relation to age and disease stages. These analytes were extracted from tissue samples and analysed with GC, LC/ESI-MS/MS and GC-MS. It was found that aged rats exhibited a significant increase in brain AA and decrease in ¿n-3 and ¿n-6 PUFAs when compared to adult animals. The observed increase of brain AA was reversed following n-3 EPA and n-3 DPA supplementation. Sphingomyelin was significantly increased when aged animals were supplemented with n-3 DPA. LPS treatment following lithium supplementation increased LA-EA and ALA-EA, while it decreased DHA-EA. Both oxysterols 24-OH and 27-OH increased in ALS patients and SOD1-mice. Eicosadienoic acid was different in ASL-patients compared to aged SOD1-mice. These studies demonstrated that dietary intake of n-3 EPA and n-3DPA significantly altered RBC fatty acids and sphingolipids in rat brain. They suggest that n-3 DPA can be a potential storage form for EPA, as shown by retro-conversion of n-3 DPA into EPA in erythrocyte membranes, ensuring supply of n-3 EPA. Also, n-3 EPA and n-3 DPA supplementation can contribute to an increase in brain sphingomyelin species with implications for age effects and regulation of brain development. Effects of lithium highlight novel anti-neuroinflammatory treatment pathways. Both 24-hydroxycholesterol and eicosadienoic acid may be used as biomarkers in ALS thereby possibly helping to manage the progressive stages of disease. / Libyan Government

Contexte: L'encéphalopathie hépatique (EH) est une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC) caractérisée par des symptômes débilitants, notamment des troubles cognitifs, psychiatriques et moteurs. Il est cru que l’EH, définie comme étant un syndrome métabolique, disparaît après une transplantation hépatique (TH). Cependant, des complications neurologiques persistantes ont été signalées chez jusqu'à 47 % des receveurs de TH. Plusieurs études rétrospectives ont démontré une association entre des antécédents d'épisodes d'EH pré-TH et une mauvaise condition neurologique après la TH. D’autre part, l’alcool est un facteur étiologique fréquent à l’origine de la MHC. Cependant, une consommation excessive d’alcool a également un impact sur le cerveau. À ce jour, l’impact des épisodes d’EH ainsi que de l’alcool sur le développement de l’EH et l’intégrité cérébrale reste indéfini. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d’évaluer l'impact de plusieurs épisodes d’EH (induits par l'ammoniac) et 2) d'évaluer l'effet d'une consommation constante d'alcool sur le déclin neurologique, l'intégrité et les lésions cérébrales chez les rats atteints de MHC induite par la ligature des voies biliaires (LVB). Méthodes: Pour le premier objectif, des rats LVB ont reçu une injection (s.c.) d'acétate d'ammonium (LVB-Ammoniac), précipitant un épisode sévère d'EH réversible (perte du réflexe de redressement) tous les 4 jours à partir de la semaine 3 post-chirurgie LVB ( total ; 4 épisodes). Des rats SHAM ont également reçu une injection d'ammoniaque et des rats témoins BDL/SHAM ont reçu une injection de solution saline. La coordination motrice (rotarod) et la mémoire à court et à long-terme (test de reconnaissance d'objets nouveaux) ont été évaluées une semaine après la dernière injection. Pour évaluer l'intégrité neuronale, une analyse d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence a été réalisée dans le cortex frontal, le cervelet et l'hippocampe. Pour le deuxième objectif, des rats LVB ont reçu de l'alcool (LVB-Alcool) deux fois par jour (51 % v/v, dose de 3 g/kg, par gavage) pendant 4 semaines. Les rats SHAM ont également reçu de l'alcool et les rats LVB/SHAM servant de contrôles ont reçu une solution saline. La coordination motrice (rotarod) et le comportement anxieux (champ ouvert et labyrinthe surélevé) ont été évalués une semaine après la dernière administration d'alcool. Des analyses d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence ont été effectuées pour étudier l'intégrité neuronale du cortex frontal et du cervelet. Résultats: Chez les LVB-Ammoniac, des niveaux protéiques plus élevés d’un marqueur astrocytaire (GFAP) et apoptotique (caspase-3 et Bax/Bcl2) ont été trouvés dans l'hippocampe, alors que les niveaux de marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) ont été réduits par rapport à tous les autres groupes expérimentaux. Les rats LVB-Ammoniac ont présenté des niveaux accrus de stress oxydatif plasmatique par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Une diminution des niveaux de capacité antioxydante totale (CAT) et une augmentation des protéines modifiées par le 4-HNE ont été observées dans l'hippocampe (et non dans le cortex frontal ou le cervelet) du groupe LVB-Ammoniac par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) avec un marqueur neuronal (NeuN) dans la région CA1 de l'hippocampe des rats LVB-Ammoniac. Chez les rats LVB-alcool, il a été démontré une altération de la coordination motrice aux semaines 2, 3, 4 et 5 ainsi qu'une augmentation du comportement anxieux par rapport aux rats SHAM respectifs. Chez les rats BDL-alcool, il a été démontré une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311), une augmentation de l'activité enzymatique apoptotique (caspase-3 clivée), une augmentation des marqueurs de nécroptose (pRIP3 et pMLKL), une diminution de la CAT et une augmentation des protéines modifiées par 4-HNE dans le cervelet par rapport à tous les groupes. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) et du marqueur de nécroptose (pMLKL) dans les neurones de la couche granulaire du cervelet de rats LVB-alcool. Conclusion: De multiples épisodes d'EH sévère ont entraîné une perte de cellules neuronales dans l'hippocampe des rats LVB et qui est associée à une augmentation du stress oxydatif, à l'apoptose et à une diminution des cellules neuronales. Des niveaux élevés du marqueur astrocytaire (GFAP) dans l'hippocampe insinuent une gliose, pouvant être le résultat d'une perte neuronale. De plus, l'administration d'alcool aggrave les troubles de la coordination chez les rats LVB et qui ont été associés à une augmentation du stress oxydatif, à une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) avec l’apoptose et la nécroptose dans le cervelet des rats LVB-alcool. Globalement, de multiples épisodes d’EH sévère ainsi qu'une consommation constante d'alcool, via le stress oxydatif, déclenchent une perte/lésion neuronale qui entraînera par conséquent une mauvaise condition neurologique après la TH. / Background: Hepatic encephalopathy (HE) is a major complication of chronic liver disease (CLD) characterized by debilitating symptoms, including cognitive, psychiatric, and motor disturbances. HE, defined as a metabolic syndrome, is believed to resolve following liver transplantation (LT). However, persisting neurological complications have been reported in up to 47% of LT recipients. Several retrospective studies have demonstrated an association between a history of HE episodes pre-LT and poor neurological outcome following LT. Furthermore, alcohol is a common etiological factor which causes CLD. However, excessive alcohol consumption also impacts the brain. To date, the impact of HE episodes as well as of alcohol on the development of HE and brain integrity remains undefined. Therefore, our aims were to 1) evaluate the impact of multiple episodes (induced by ammonia) and 2) evaluate the effect of constant alcohol consumption on neurological decline, brain integrity and injury in rats with CLD induced via bile-duct ligation (BDL). Methods: In the first aim, BDL rats were injected (s.c.) with ammonium acetate (BDLAmmonia), precipitating a reversible overt episode of HE (loss of righting reflex) every 4 days from week 3 post-BDL surgery (total; 4 episodes). SHAM rats were also injected with ammonia and BDL/SHAM rats were injected with saline as controls. To assess the neuronal integrity, western blot and immunofluorescence analysis were performed for frontal cortex, cerebellum, and hippocampus. Motor coordination (rotarod) and short- and long-memory (novel object recognition test) were assessed one week following last injection. In the second aim, BDL rats were administered alcohol (BDL-Alcohol) twice a day (51% v/v, dose of 3g/kg, via gavage) for 4 weeks. SHAM rats also received alcohol and BDL/SHAM rats received saline as controls. Motor coordination (rotarod) and anxiety-like behavior (open field and elevated plus maze) were assessed one week following last alcohol administration. Western blot and immunofluorescence analyses were performed to investigate neuronal integrity in frontal cortex and cerebellum. Results: In BDL-Ammonia, higher protein levels of astrocytic marker (GFAP) and apoptotic markers (caspase-3 and Bax/Bcl2) were found in the hippocampus, whereas neuronal markers (NeuN and SMI311) levels were reduced compared to all other experimental groups. BDLAmmonia rats showed increased levels of plasma oxidative stress compared to respective SHAM/BDL rats. Decreased levels of total antioxidant capacity (TAC) and increased 4-HNE modified proteins were found in the hippocampus (not in frontal cortex or cerebellum) of the BDL-Ammonia group compared to respective SHAM/BDL rats. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase-3) with neuronal marker (NeuN) in the CA1 region of the hippocampus of BDL-Ammonia rats. BDL-Alcohol rats demonstrated impaired motor coordination at weeks 2, 3, 4, and 5 as well as an increase in anxiety-like behavior compared to respective SHAM rats. BDL-Alcohol rats showed a decrease in neuronal markers (NeuN and SMI311), an increase in apoptotic enzyme activity (cleaved caspase-3), an increase in necroptosis markers (pRIP3 and pMLKL), a decrease in TAC and an increase in 4-HNE modified proteins in the cerebellum compared to all groups. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase3) and necroptosis marker (pMLKL) in granular layer neurons of the cerebellum of BDLAlcohol rats. Conclusion: Multiple episodes of overt HE led to neuronal cell loss in the hippocampus of BDL rats which was associated with increased oxidative stress, apoptosis and decreased neuronal count. Elevated levels of astrocytic marker (GFAP) in the hippocampus insinuate gliosis, possibly a result of neuronal loss. Moreover, alcohol administration worsens coordination impairments in BDL rats which were associated with increased oxidative stress, decreased neuronal markers (NeuN and SMI311) with apoptosis and necroptosis in the cerebellum of BDL-Alcohol rats. Overall, both multiple episodes of overt HE as well as continuous alcohol consumption, via oxidative stress, triggers neuronal loss/injury which consequently will lead to poor neurological outcome post-LT.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.

Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.