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Étude de la relation entre structure, dynamique et fonction de l’ARN par l’ingénierie du ribozyme VS de NeurosporaGirard, Nicolas 08 1900 (has links)
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Études d'ingénierie du ribozyme VS de NeurosporaLacroix-Labonté, Julie 31 December 2015 (has links)
Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le
développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement
intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou
d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le
développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui
permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures
secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et
tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait
intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la
tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour
accomplir des fonctions biologiques.
Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle
de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité
pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des
travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité
nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat
naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents
substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces
modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été
modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs
de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de
tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans
modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a
été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut
reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel.
L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR*
de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de
iii
clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours
observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de
ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec
une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec
une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de
clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être
modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en
conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel
d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du
ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents
du substrat naturel du ribozyme VS. / Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of
biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene
inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the
most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead
and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded
RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs
can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures.
It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop
structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they
can perform important biological functions.
The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific
kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very
different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to
determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering
ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS
ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were
performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first
study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib
lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths
with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study,
the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the
VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its
natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR*
and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop
interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new
interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable
more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled
v
the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that
of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in
this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific
recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results
demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further
engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA
completely different from its natural VS ribozyme substrate.
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Études Structurales par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du Site Actif du Ribozyme VS de Neurospora.Desjardins-Séguin, Geneviève 11 1900 (has links)
Nous étudions le ribozyme VS de Neurospora, en tant que système modèle, pour
augmenter nos connaissances sur la relation entre la structure et la fonction chez les ARNs,
ainsi que pour mieux comprendre le mécanisme de clivage de ce ribozyme. Il a été proposé
précédemment que la boucle interne A730 dans la tige-boucle VI (SLVI) contient le site actif
du ribozyme et lie un ou plusieurs ions métalliques qui pourraient participer au mécanisme
réactionnel. Nous avons déterminé par spectroscopie RMN la structure de la tige-boucle SLVI
contenant la boucle A730 afin d’éclaircir ce mécanisme. La structure obtenue est en accord
avec les études biochimiques antérieures et présente un ou plusieurs sites de liaison au
magnésium associé à la boucle interne. Suite à des études de cinétique et de mutagenèse, il
a été proposé qu’une adénine localisée dans le site actif, A756, participe à la catalyse par
acide/base générale. Des études de pH effectuées précédemment ont identifié un pKa
catalytique (5.2-5.8) qui correspond probablement à l’équilibre de protonation du A756. À
l’aide de méthodes utilisant le carbone-13, nous avons identifié un pKa modifié appartenant au
A756, ce qui supporte le rôle de ce résidu dans la catalyse par acide/base générale. Les
études structurales présentées ici aident donc à augmenter notre compréhension du
mécanisme de clivage chez le ribozyme VS. / We are studying the Neurospora VS ribozyme as a model system to increase our
knowledge of the structure-function relationship in RNA and to better understand the
mechanism of the cleavage reaction. It has been previously postulated that the A730 internal
loop of stem-loop VI (SLVI) forms the active site of the VS ribozyme and binds magnesium
ion(s) that may participate in catalysis. To get insights into the catalytic mechanism, we have
determined by NMR spectroscopy the structure of a SLVI fragment containing the A730 loop.
The structure we obtained is in agreement with previous biochemical studies and contains one
or more magnesium-ion binding sites in the active site. Based on kinetic and mutagenesis
studies, it has been proposed that an adenine in the A730 loop, A756, is important for catalysis
and may participate in general acid/base catalysis. Previous pH-dependent enzymatic studies
identified a catalytic pKa of 5.2-5.8, which likely corresponds to the protonation equilibrium of
this A756 adenine in the A730 loop. Using 13C NMR methods, we have identified a shifted pKa
for A756, which gives additional support to the role of this residue in the general acid/base
mechanism. The NMR studies presented here therefore increase our understanding of the
cleavage reaction in the VS ribozyme.
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Études Structurales par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du Site Actif du Ribozyme VS de NeurosporaDesjardins-Séguin, Geneviève 11 1900 (has links)
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Caractérisation structurale et thermodynamique de la reconnaissance du substrat par le ribozyme VS de NeurosporaBouchard, Patricia 08 1900 (has links)
Les interactions ARN/ARN de type kissing-loop sont des éléments de structure tertiaire qui jouent souvent des rôles clés chez les ARN, tant au niveau fonctionnel que structural. En effet, ce type d’interaction est crucial pour plusieurs processus dépendant des ARN, notamment pour l’initiation de la traduction, la reconnaissance des ARN antisens et la dimérisation de génome rétroviral. Les interactions kissing-loop sont également importantes pour le repliement des ARN, puisqu’elles permettent d’établir des contacts à longue distance entre différents ARN ou encore entre les domaines éloignés d’un même ARN. Ce type d’interaction stabilise aussi les structures complexes des ARN fonctionnels tels que les ARNt, les riborégulateurs et les ribozymes.
Comme d’autres ARN fonctionnels, le ribozyme VS de Neurospora contient une interaction kissing-loop importante. Celle-ci est impliquée dans la reconnaissance du substrat et se forme entre la tige-boucle I (stem-loop I, SLI) du substrat et la tige-boucle V (stem-loop V, SLV) du domaine catalytique. Des études biochimiques ont démontré que l’interaction kissing-loop I/V, dépendante du magnésium, implique trois paires de bases Watson-Crick (W-C). De plus, cette interaction est associée à un réarrangement de la structure du substrat, le faisant passer d’une conformation inactive dite unshifted à une conformation active dite shifted. Les travaux présentés dans cette thèse consistent en une caractérisation structurale et thermodynamique de l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme VS, laquelle est formée de fragments d’ARN représentant les tige-boucles I et V dérivées du ribozyme VS (SLI et SLV). Cette caractérisation a été réalisée principalement par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et par titrage calorimétrique isotherme (isothermal titration calorimetry, ITC) en utilisant différents complexes SLI/SLV dans lesquels l’ARN SLV est commun à tous les complexes, alors que différentes variations de l’ARN SLI ont été utilisées, soit en conformation shiftable ou preshifted. Les données d’ITC ont permis de démontrer qu’en présence d’une concentration saturante de magnésium, l’affinité d’un substrat SLI preshifted pour SLV est extrêmement élevée, rendant cette interaction plus stable que ce qui est prédit pour un duplexe d’ARN équivalent. De plus, l’étude effectuée par ITC montre que des ARN SLI preshifted présentent une meilleure affinité pour SLV que des ARN SLI shiftable, ce qui a permis de calculer le coût énergétique associé au réarrangement de structure du substrat. En plus de confirmer la formation des trois paires de bases W-C prédites à la jonction I/V, les études de RMN ont permis d’obtenir une preuve structurale directe du réarrangement structural des substrats SLI shiftable en présence de magnésium et de l’ARN SLV. La structure RMN d’un complexe SLI/SLV de grande affinité démontre que les boucles terminales de SLI et SLV forment chacune un motif U-turn, ce qui facilite l’appariement W-C intermoléculaire. Plusieurs autres interactions ont été définies à l’interface I/V, notamment des triplets de bases, ainsi que des empilements de bases. Ces interactions contribuent d’ailleurs à la création d’une structure présentant un empilement continu, c’est-à-dire qui se propage du centre de l’interaction jusqu’aux bouts des tiges de SLI et SLV. Ces études de RMN permettent donc de mieux comprendre la stabilité exceptionnelle de l’interaction kissing-loop I/V au niveau structural et mènent à l’élaboration d’un modèle cinétique de l’activation du substrat par le ribozyme VS. En considérant l’ensemble des données d’ITC et de RMN, l’étonnante stabilité de l’interaction I/V s’explique probablement par une combinaison de facteurs, dont les motifs U-turn, la présence d’un nucléotide exclu de la boucle de SLV (U700), la liaison de cations magnésium et l’empilement de bases continu à la jonction I/V. / Kissing loops are tertiary structure elements that often play key roles in functional RNAs. Their formation is central to many RNA-mediated processes, such as translation initiation, antisense recognition and retroviral dimerization. Kissing loops are also involved in RNA folding as they form long-range interactions between different RNAs or remote domains within the same RNA and stabilize the complex architecture of functional RNA, such as tRNA, riboswitch aptamers and ribozymes.
Like several other functional RNAs, the Neurospora VS ribozyme contains an important kissing-loop interaction. The substrate recognition by the VS ribozyme depends largely on the formation of a magnesium-dependent kissing-loop interaction between stem-loop V (SLV) of the catalytic domain and stem-loop I (SLI) that defines the substrate domain. It has been shown from biochemical studies that the I/V kissing-loop interaction involves three Watson-Crick base pairs and is associated with a structural rearrangement of the SLI substrate from an unshifted and inactive to a shifted and active conformation. Here, we present a thermodynamic and structural characterization of the VS ribozyme I/V kissing-loop interaction using isolated stem-loop fragments (SLI and SLV). Both isothermal titration calorimetry (ITC) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy studies were conducted with several SLI/SLV complexes using a common SLV, but either shiftable or preshifted SLI variants. From the ITC studies, we show that, under saturating amount of magnesium ions, the affinity of the preshifted SLI variants for SLV is remarkably high, the interaction being more stable than predicted for a comparable duplex. In addition, these ITC studies demonstrate that preshifted SLI variants have higher affinity for SLV than shiftable SLI variants, and these results allow us to evaluate the energetic cost of the conformational shift in SLI. From the NMR studies, we confirm formation of three Watson-Crick base pairs at the kissing-loop junction and provide direct evidence on the structural rearrangement of shiftable SLI variants in the presence of magnesium and SLV. The NMR structure of a high-affinity SLI/SLV complex demonstrates that both the SLI and SLV loops adopt U-turn structures, which facilitate intermolecular Watson-Crick base pairing. Several other interactions at the I/V interface, including base triples and base stacking help create a continuously stacked structure. These NMR studies provide a structural basis for the high stability of the kissing-loop interaction and lead us to propose a kinetic model for substrate activation by the VS ribozyme. Taken together, our ITC and NMR data suggest that the remarkable stability of the I/V interaction is likely provided by a combination of several elements, especially the presence of the U-turn motif, the presence of an extruded nucleotide in SLV (U700), the binding of magnesium ions and the extensive base stacking interactions at the junction.
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Études structurales par résonance magnétique nucléaire du ribozyme VS de NeurosporaBonneau, Éric 01 1900 (has links)
Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée.
Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie. / The Neurospora VS ribozyme catalyzes the cleavage and the ligation of a specific phosphodiester bond, which is essential for its replication cycle. It is formed of six helical regions (I to VI) that are divided in two domains: the substrate (SLI) and the catalytic domain (stems II-VI). The latter contains two three-way junctions that allow recognition of the stem-loop substrate in a specific manner. This unique mode of substrate recognition could be exploited to target folded RNAs for diverse applications. Even though the VS ribozyme has been extensively characterized biochemically, no high-resolution structure of the complete ribozyme has been published yet and this limits our mechanistic understanding. A divide-and-conquer approach was previously initiated to study the structure of the important subdomains of the VS ribozyme by nuclear magnetic resonance (NMR), but this approach needs to be completed.
In this thesis, the structures of the A730 loop, the III-IV-V junction and the II-III-VI junction were determined by heteronuclear NMR spectroscopy. Moreover, a unique NMR approach was developed for localizing divalent metal ions, whereas several isotope-labeling strategies were implemented to facilitate the study or large RNA molecules. The NMR structures of the A730 loop and the two three-way junctions reveal that these subdomains are well defined, that they are formed by several recurrent structural elements (U-turn and S-turn motifs, base triples and coaxial stacking) and that they contain several metal-binding sites. Interestingly, structural similarities were identified between the VS and hairpin ribozymes, which allowed the modeling of the VS ribozyme active site. In summary, these studies significantly contribute to a better understanding of the global architecture of the VS ribozyme. In addition, they will allow the construction of a high-resolution model of the complete VS ribozyme and facilitate future engineering studies.
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