La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne à progression rapide, qui se caractérise par une expansion clonale de précurseurs myéloïdes présentant un contrôle défectueux de leur prolifération et de leur différenciation. Une rémission complète peut être obtenue chez environ 80% à 85% des patients en associant cytarabine et anthracycline qui sont respectivement un inhibiteur de la synthèse d’ADN et un agent intercalant. Néanmoins, les résultats globaux pour les patients atteints de LAM restent médiocres et le taux de survie à 5 ans des patients âgés de plus de 60 ans, est inférieur à 10%. Le paradigme bien accepté de la leucémogenèse est que la leucémie résulte de la transformation d'une cellule unique appelée cellule souche leucémique (SCL) ou cellule initiatrice de leucémie (LIC) qui se développe par autorenouvellement et engendre par division asymétrique les blastes leucémiques bloqués dans leur différentiation. Les LIC vont être responsables du maintien et de la rechute de la maladie après le traitement chimiothérapeutique car si les traitements actuels sont relativement efficaces contre les blastes leucémiques, ils échouent au niveau des LIC. Un autre facteur important impliqué dans la résistance aux traitements est le microenvironnement de la moelle osseuse qui forme la niche hématopoïétique. Des études ont montré que différents composants cellulaires de la niche peuvent transférer des mitochondries à des cellules normales soumises à un stress métabolique ou dans un contexte pathologique, vers des cellules cancéreuses. Durant ma thèse, j'ai pu montrer que les cellules murines de la lignée MS-5 et/ou des cellules stromales primaires humaines dérivées de la moelle osseuse, utilisées comme cellules nourricières dans des expériences de co-culture, sont capables de transférer des mitochondries fonctionnelles aux cellules leucémiques. En utilisant différentes approches moléculaires et d'imagerie, nous avons pu montrer que les cellules de LAM peuvent, par ce transfert, augmenter leur masse mitochondriale jusqu'à 14%. Dans la co-culture, les cellules LAM receveuses ont montré une augmentation de 1,5 fois de la production d'adénosine triphosphate (ATP) mitochondriale et se sont révélées moins sujettes à une dépolarisation mitochondriale après chimiothérapie, affichant une survie plus élevée. Ce transfert unidirectionnel, renforcé par certains agents chimiothérapeutiques, nécessite des contacts cellule-cellule et semble se dérouler par une voie endocytaire qui reste à déterminer. Enfin, nous démontrons que le transfert mitochondrial est observé in vivo dans un modèle de xénogreffe de souris immunodéficientes NSG et se produit également dans les cellules et les progéniteurs initiateurs de la leucémie humaine et leur conférant une capacité plus élevée à initier des cultures leucémiques à long terme. Nous avons ainsi apporté la preuve qu'un transfert horizontal de mitochondries provenant des cellules stromales de la niche hématopoïétique participe aux phénomènes de chimiorésistance des cellules leucémiques receveuses. De ce fait, cibler ce transfert mitochondrial pourrait représenter une future cible thérapeutique originale pour un traitement adjuvant des LAM visant à interférer avec le soutien de leur microenvironnement. / Acute myelogenous leukemia (AML) is a heterogeneous group of hematopoietic malignancies arising from hematopoietic stem and/or progenitor cells that display defective control of their proliferation, differentiation, and maturation. Complete remission is achieved using anthracycline and cytarabine combination therapy in 80% to 85% of older patients. Nevertheless, the overall outcomes for AML patients remain poor, and the 5-year survival rate for patients over 60 is less than 10%. The well-accepted paradigm of leukemogenesis is that leukemia arises from the transformation of a single cell and is maintained by a small population of leukemic stem cells (LSC) or leukemia initiating cells (LICs). It is theorized that current treatments, although highly effective against the leukemic bulk, fail to eradicate the LICs that are therefore responsible for leukemia relapse. Another important factor involved in resistance to treatments is the microenvironment of the bone marrow, which is called the hematopoietic niche. Studies have shown that different niche cell components can transfer mitochondria to normal cells that undergo a metabolic stress and in a pathological context, to cancer cells. During my PhD we demonstrate that in an ex vivo niche-like coculture system, cells both primary and cultured AML cells take up functional mitochondria from murine or human bone marrow stromal cells. Using different molecular and imaging approaches, we show that AML cells can increase their mitochondrial mass by up to 14%. After coculture, recipient AML cells showed a 1.5-fold increase in mitochondrial ATP production and were less prone to mitochondrial depolarization after chemotherapy, displaying a higher survival. This unidirectional transfer enhanced by some chemotherapeutic agents required cell–cell contacts and proceed through an ill-defined endocytic pathway. Transfer was greater in AML blasts compared with normal cord blood CD34+ cells. Finally, we demonstrate that mitochondrial transfer was observed in vivo in an NSG immunodeficient mouse xenograft model and also occurred in human leukemia initiating cells and progenitors. As mitochondrial transfer provides a clear survival advantage following chemotherapy and a higher leukemic long-term culture initiating cell potential, targeting mitochondrial transfer could represent a future therapeutic target for AML treatment.

Les cellules sanguines proviennent d’une cellule souche hématopoïétique (CSE), présente dans la moelle osseuse chez l’homme adulte, qui nécessite d’être en contact étroit avec une zone particulière du microenvironnement médullaire (appelée niche hématopoïétique) pour sa différenciation et son autorenouvellement. La nature exacte des cellules qui composent cette niche (appelée cellules stromales) n’est pas encore bien connue, en particulier concernant sa relation avec les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Le but de cette thèse a été d’étudier le rôle des CSM dans la régulation de l’hématopoïèse en fonction de leur type et leur stade de différenciation mésenchymateuse et d’évaluer leur rôle dans la migration des progéniteurs hématopoïétique (PH). Nous montrons que les CSM non différenciées possèdent la capacité de soutien de l’hématopoïèse primitive la plus importante (par culture à long terme pendant 5 semaines) et que cette capacité est rapidement perdue dès 3 jours de différenciation adipogénique, otéogénique et vasculaire musculaire lisse. Par ailleurs, nous montrons que le G-CSP agit directement sur les CSM pour augmenter la migration des CSH/PH hors de la niche (par un test de migration trans-stromale) via un mécanisme MMP-2 dépendant. / Blood cells arise from a hematopoietic stem cell (HSC), present into bone marrow (3M) in adult humans, which needs close contacts with a special zone of 3M micro environment (named hematopoietic niche) for its differentiation and self’-renewal. The precise nature of the niche-forming cells (named stromale cells) are not yet well known, particularly in their relationship with mesenchymal stem cells (MSCs). The aim of the study was to investigate further the role of the MSCs in the hematopoiesis control according to their differentiation pathway and state and to evaluate their role in the migration process of hematopoietic progenitor cells (HPÇ,[ We show that non-differentiated MSCs display the best hematopoietic supporting activity (using 5-week long term cultures) that is completely lost after in vitro differentiation into adipocytes, osteoblasts and vascular smooth muscle cells. In addition, we show that G-CSP stimulation of 3M MSCs promotes HSC/HPC migration (using trans-stromal migration assay) via a MMP-2-dependent mechanism.

L'hématopoïèse est un processus finement régulé pour permettre sa pérennité et son adaptation aux contraintes physiologiques et pathologiques. Ce potentiel repose en grande partie sur les capacités de quiescence, auto-renouvellement, division asymétrique et multipotence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont principalement régulés de façon extrinsèque au sein des niches hématopoïétiques médullaires et cette régulation fait intervenir, des contacts intercellulaires et des facteurs diffusibles. Le phénotype " side-population " (SP), secondaire à l'efflux actif d'un colorant fluorescent (Hoechst 33342) par des pompes de type multidrugresistance, est une caractéristique des cellules souches de la plupart des tissus. Au sein de l'hématopoïèse, le phénotype SP est un excellent moyen pour identifier les CSH murines et est associé à leur quiescence et à leur adhésion à la niche endostéale, mais sa valeur comme marqueur des CSH est plus discutée chez l'homme. Les cellules SP, de par leur nature, sont également étudiées en oncologie, et sont associées aux cellules tumorales les plus résistantes et les plus tumorogènes. La compréhension des mécanismes régulant la fonctionnalité SP devrait permettre d'ouvrir des pistes en physiologie quand à la compréhension de la régulation des CSPH par les niches mésenchymateuses et en pathologie pour cibler les mécanismes de chimiorésistance.Dans ce travail nous montrons pour la première fois chez l'homme que l'acquisition du phénotype SP est un phénomène dynamique et versatile sous le contrôle du stroma médullaire. Le stroma médullaire est en effet capable de maintenir le phénotype SP de CSPH médullaires et d'induire le phénotype SP de CSPH circulants. L'acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes nécessite à la fois un " nichage " au sein du stroma et des facteurs diffusibles. Les cellules circulantes capables d'acquérir le phénotype SP contiennent des CSPH au regard de (i) leur expression du CD34, (ii) leur richesse en cellules quiescentes, (iii) leur capacité clonogénique et proliférative en cultures secondaires, (iv) leur expression des gènes de " nichage " et de " souchitude ", (v) leur capacité de migration en réponse à un gradient de CXCL12, (vi) leur activité LT-SRC in vivo. De plus nous avons mis en évidence, au sein de ces CSPH SP+CD34+ révélés par le stroma médullaire, une sous-population CD44-/faible qui pourrait contenir les cellules plus immatures en raison de sa quiescence et de l'intensité de son efflux du Hoechst 33342. Les études mécanistiques montrent que l'acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes est sous la dépendance de l'intégrine VLA-4 et du CD44. La transduction du signal implique des protéines G et la famille des Src-kinases. Nous montrons également que le stroma médullaire peut induire/maintenir/amplifier la fonctionnalité SP de blastes circulants de leucémie aigüe myéloblastique de façon ß1-intégrine dépendante et que cette fonctionnalité est associée à une capacité d'efflux de Mitoxantrone. Ce mécanisme de modulation de l'activité d'ABC-transporteurs par l'adhésion au stroma correspond à un mécanisme encore jamais décrit de CAM-DR.

L’hématopoïèse est un processus finement régulé pour permettre sa pérennité et son adaptation aux contraintes physiologiques et pathologiques. Ce potentiel repose en grande partie sur les capacités de quiescence, auto-renouvellement, division asymétrique et multipotence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont principalement régulés de façon extrinsèque au sein des niches hématopoïétiques médullaires et cette régulation fait intervenir, des contacts intercellulaires et des facteurs diffusibles. Le phénotype « side-population » (SP), secondaire à l’efflux actif d’un colorant fluorescent (Hoechst 33342) par des pompes de type multidrugresistance, est une caractéristique des cellules souches de la plupart des tissus. Au sein de l’hématopoïèse, le phénotype SP est un excellent moyen pour identifier les CSH murines et est associé à leur quiescence et à leur adhésion à la niche endostéale, mais sa valeur comme marqueur des CSH est plus discutée chez l’homme. Les cellules SP, de par leur nature, sont également étudiées en oncologie, et sont associées aux cellules tumorales les plus résistantes et les plus tumorogènes. La compréhension des mécanismes régulant la fonctionnalité SP devrait permettre d’ouvrir des pistes en physiologie quand à la compréhension de la régulation des CSPH par les niches mésenchymateuses et en pathologie pour cibler les mécanismes de chimiorésistance.Dans ce travail nous montrons pour la première fois chez l’homme que l’acquisition du phénotype SP est un phénomène dynamique et versatile sous le contrôle du stroma médullaire. Le stroma médullaire est en effet capable de maintenir le phénotype SP de CSPH médullaires et d’induire le phénotype SP de CSPH circulants. L’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes nécessite à la fois un « nichage » au sein du stroma et des facteurs diffusibles. Les cellules circulantes capables d’acquérir le phénotype SP contiennent des CSPH au regard de (i) leur expression du CD34, (ii) leur richesse en cellules quiescentes, (iii) leur capacité clonogénique et proliférative en cultures secondaires, (iv) leur expression des gènes de « nichage » et de « souchitude », (v) leur capacité de migration en réponse à un gradient de CXCL12, (vi) leur activité LT-SRC in vivo. De plus nous avons mis en évidence, au sein de ces CSPH SP+CD34+ révélés par le stroma médullaire, une sous-population CD44-/faible qui pourrait contenir les cellules plus immatures en raison de sa quiescence et de l’intensité de son efflux du Hoechst 33342. Les études mécanistiques montrent que l’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes est sous la dépendance de l’intégrine VLA-4 et du CD44. La transduction du signal implique des protéines G et la famille des Src-kinases. Nous montrons également que le stroma médullaire peut induire/maintenir/amplifier la fonctionnalité SP de blastes circulants de leucémie aigüe myéloblastique de façon ß1-intégrine dépendante et que cette fonctionnalité est associée à une capacité d’efflux de Mitoxantrone. Ce mécanisme de modulation de l’activité d’ABC-transporteurs par l’adhésion au stroma correspond à un mécanisme encore jamais décrit de CAM-DR. / Hematopoiesis is a finely tuned process to allow its long-term efficiency and its adaptation to various physiological and pathological stresses. Hematopoietic stem cell (HSC) is the keystone of hematopoiesis through its multipotency, quiescence, asymmetrical division and self-renewing properties. HSC bone marrow (BM) niches mainly regulate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) through intercellular contacts and diffusible factors. Side-population (SP) cells are characterized by their capability to actively efflux Hoechst 33342 dye through multidrug resistance-like pumps. SP phenotype is a characteristic of stem cells in many tissues and especially, it is a stringent criterion to purify murine HSCs. In mice, this phenotype has been demonstrated to be related to quiescence and resistance to drugs/environmental stresses and to be controlled by endosteal niche adhesion. SP cells are also studied in oncology and are associated to chemo-resistance and tumor initiating capacity. At steady state, SP cells are mainly present in the BM and are mostly absent from the circulation except in stress conditions, raising the hypothesis of the versatility of the SP functionality. Therefore, studying SP phenotype regulation is of importance to understand how BM niches regulate HSPC and how to interfere with cancer cells chemo-resistance.In this work, we demonstrate for the first time and in human that SP phenotype acquisition is a dynamic phenomenon under control of stromal BM cells. Stromal cells from healthy donors maintain SP phenotype of BM HSPC and promote SP phenotype acquisition in circulating ones. SP phenotype promotion depends of stroma nesting and of diffusible factors secretion. This stroma-induced circulating SP cell fraction contains HSPC, as ascertained by (i) CD34 expression, (ii) proportion of cells in G0, (iii) clonogenic and proliferative potential, (iv) nesting and “stemness” gene expression, (v) CXCL12-related migration capability and (vi) LT-SRC activity. Moreover, we describe an SP+CD34+CD44-/low sub-population that could contain most immature HSPCs with regards to their quiescence and Hoechst efflux intensity. Mechanistic studies show that the stoma-mediated SP promoting effect is VLA-4/4ß1-integrin and CD44 dependent, and implicate G-protein and Src-kinase pathways. We also demonstrate that BM stroma from healthy donors can induce/maintain/amplify in a ß1-integrin dependent manner an SP sub-population with mitoxantrone efflux capability in blast cells from acute myeloid leukemia. The existence of a similar mechanism in circulating leukemic blasts suggests the possibility to interfere with the chemo-resistant phenotype of blast cells through integrin/CD44 axis blockade.