As a basic building block in many biological molecules, the element nitrogen (N) is essential for life. Dinitrogen (N2) is abundant in Earth’s atmosphere, but this form is biologically unavailable. To be biologically available, N2 must undergo a reduction reaction to the fixed form, ammonia (NH3). The industrial Haber-Bosch process, which accounts for approximately 50% of the worlds fixed nitrogen, uses energy from fossil fuels to achieve high pressures and temperatures to catalyze the reaction. The energy used by Haber-Bosch accounts for approximately 2% of the world’s annual supply. The remainder of fixed nitrogen is produced biologically by nitrogen fixing microorganisms (diazotrophs), utilizing nitrogenase enzymes. Nitrogenase enzymes catalyze the reduction at ambient temperature and pressure, deriving the necessary energy from the energy rich molecule adenosine triphosphate (ATP). The focus of this dissertation is enriching our understanding of how nitrogenase enzymes can catalyze this crucial reaction under ambient conditions. This, of course, leads to a better understanding of biological nitrogen fixation, but also reveals the strategies that nature has evolved which can inform on the development of cleaner more efficient industrial processes.

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The nitrogenase enzyme is the biochemical machiner responsible for the conversion of the largely unavailable nitrogen to the easily assimilable ammonia for living organisms by the process termed as biological nitrogen fixation (BNF). This study was focused on understanding the various structural and functional aspects of the nitrogenase enzyme related to maturation and assembly of the FeMo-cofactor (FeMoco) metallocluster of the MoFe protein (the site for final substrate reduction), development of a dimeric MoFe protein and the structural homology of nitrogenase with other metalloenzymes. This research was specifically directed towards the NifHDKX proteins in which the nifHDK genes are the major structural genes that encode the nitrogenase enzyme and nifX is an accessory gene that encodes the NifX protein, indicated to be involved in the formation of the FeMoco. The overall objective of this study was to gain structural and functional information on the nitrogenase enzyme through the study of the NifHDKX proteins. A major part of our study included the detection of protein-protein interactions between the NifD, NifK and a fused NifDK protein. The results of this study could prove to be useful for further studies that are directed towards condensing the nif genes so as to facilitate transfer of nitrogen fixing genes to plants for their improved nutrition. We also determined protein-protein interactions between NifX and other proteins involved in the FeMoco biosynthetic pathway. Based on the results, we were able to describe the role of NifX and propose a modified model for the FeMoco biosynthesis pathway. Apart from this, a comparative structural and evolutionary study was performed on the NifH similar proteins such as ChlL, CompA, MinD and ArsA and the NifDK similar proteins known as ChlBN. Based on the conservation of similar structural domains in NifH and ArsA, NifH was found to complement the function of ArsA1. Also the comparison between NifDK and the homology modeled ChlBN protein structure suggested a potential site for the presence of a FeMoco in ChlN. Thus, these studies helped us to derive meaningful conclusions on the structure and evolution of the nitrogenase enzyme and its homologs in nature.

Nitrogenase catalyzes the biological reduction of N2 to ammonia (nitrogen fixation). The metalloclusters associated with the nitrogenase components include the [4Fe-4S] cluster of the Fe protein, and the P-cluster [8Fe7S] and FeMo-cofactor [7Fe-9S-Mo-X-homocitrate], both contained within the MoFe protein. These metal-complexes play a vital role in enzyme activity during electron transport and substrate reduction. It is known that the FeMo-cofactor provides the site of substrate reduction, but the exact site of substrate binding remains a topic of intense debate. Some models for the substrate binding location favor the molybdenum atom, while other models favor one or more iron atoms within FeMo-cofactor. We have shown that the a-70 residue of the MoFe protein plays a significant role in defining substrate access to the active site: a-70 approaches one 4Fe-4S face of the FeMo-cofactor. Substitutions at this position alter enzyme specificity for reduction of alternative alkyne substrates. These altered MoFe proteins and alternative alkyne substrates, such as propargyl alcohol, were used to trap an intermediate during substrate reduction. Further studies involving the effect of pH on substrate reduction of these altered MoFe proteins pinpointed the location of the bound substrate-derived intermediate on the FeMo-cofactor to a specific Fe atom, designated Fe6. In addition to understanding how substrates are bound and reduced at the active site, understanding how these clusters are biologically assembled is a second point of interest. Inactivation of NifU or NifS has been shown to affect the activity of both nitrogenase components. NifS is a cysteine desulfurase that provides the sulfur for cluster formation and NifU serves as a molecular scaffold during [Fe-S] cluster assembly. Genetic and biochemical experiments involving amino acid substitutions within the N-terminal and C-terminal domains of NifU indicate that both domains can separately participate in nitrogenase-specific [Fe-S] cluster formation. Furthermore, the NifU and NifS protein appear to have specialized functions in the maturation of metalloclusters of nitrogenase and cannot functionally replace the isc [Fe-S] cluster system used for the maturation of other [Fe-S] proteins. These results indicate that, in certain cases, [Fe-S] cluster biosynthetic machineries have evolved to perform only specialized functions. / Ph. D.

O uso intensificado de combustíveis fósseis como fonte de energia, vê-se a necessidade do desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente as renováveis, como o hidrogênio, que possui vantagens por ser elemento abundante no universo, ser renovável e não poluente. A utilização de microalgas e cianobactérias é uma alternativa para a produção de biohidrogênio a partir da quebra da água e de compostos orgânicos. De acordo com isso, nesta pesquisa foram testados diversos fatores físico-químicos e nutricionais nas condições de cultivo de cepas de Chlamydomonas spp. e Anabaena spp. Para tanto, cepas selecionadas foram cultivadas em duas fases experimentais, a primeira aeróbia e a segunda anaeróbia, para proporcionar produção de hidrogênio por biofotólise direta anaeróbia, via hidrogenase, sob privação de enxofre para a clorofícea, e de nitrogênio para a cianobactéria, estimulando para esta também a produção por biofotólise indireta, via nitrogenase. A cepa com melhor produtividade de hidrogênio, de cada gênero, foi selecionada para a etapa de otimização das fases experimentais de cultivo. Durante os ensaios foram realizadas análises de produção máxima, velocidade de produção, volume e produtividade de hidrogênio, além de análises de concentração de biomassa, físico-químicas, bioquímicas e geração de subprodutos. O método utilizado foi eficiente para produção de hidrogênio e ficou comprovada a diferença de produção de hidrogênio entre diferentes cepas. Anabaena sp. obteve produtividade média de hidrogênio quatro vezes maior, aproximadamente de 76,8 µmol.L-1.h-1, comparada a C. reinhardtii, com média de 18,6 µmol.L-1.h-1. / The intensifying use of fossil fuels as energy source, one sees the need to develop new technologies, especially renewable, such as hydrogen. This has advantages because hydrogen is an abundant element in the universe, be renewable and non-polluting. The use of microalgae and cyanobacteria is an alternative for the production of bio-hydrogen of breaking water and organic compounds. Accordingly, in this study were tested several physic-chemical factors and nutrition in growing conditions of Chlamydomonas spp. and Anabaena spp. strains. For this purpose, strains selected were cultured in two experimental phases, first aerobic and second anaerobic, to hydrogen production by direct biofotolise anaerobic, via hydrogenase, under sulfur deprived to chlorofycea, and nitrogen to cyanobacterium, for this also to production by indirect biofotolise, via nitrogenase. The strain with highest productivity of hydrogen, of each gender, was selected for the optimization of the experimental stages of cultivation. During the tests were analyzes of maximum production, velocity, volume and productivity of hydrogen, and analysis of biomass concentration, physic-chemical, biochemical and generation of by-products. The method used was efficient for the production of hydrogen and was different between strains. Anabaena sp. obtained average yield four times highest, approximately 76.8 µmol. L-1.h-1compared to C. reinhardtii, averaging 18.6 µmol. L-1.h-1.

O glifosato é o herbicida mais usado mundialmente em aplicações após a emergência das plantas daninhas, antes da semeadura ou emergência das culturas. Muitos trabalhos têm sido realizados para entender seu modo de ação, mas poucos com a finalidade de estudar seu efeito sobre as populações microbianas do solo, como a população de Bradyrhizobium japonicum e a conseqüente ação do produto sobre taxas de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN). Pouca ênfase também tem sido dada aos efeitos do produto sobre o acúmulo de macronutrientes em variedades de soja. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a ação do herbicida glifosato sobre a nutrição nitrogenada em soja convencional e transgênica, avaliando, para tanto, acúmulo de nutrientes, nodulação e taxas de FBN, fotossíntese e transpiração. Foram utilizadas as variedades de soja convencional, BRS Conquista e a transgênica, BRS Valiosa. Foram utilizadas as doses 0, 2, 4, 8, 16 e 32\'mü\'M L-1 do herbicida glifosato em solução nutritiva e aplicação foliar. As plantas foram coletadas no estádio R3, época do florescimento pleno e R8, após o enchimento dos grãos e os seguintes parâmetros foram analisados: produção de massa seca, taxas de fotossíntese e transpiração, acúmulo de macro e micronutrientes, nodulação, atividade da enzima nitrogenase e taxa de FBN. Observou-se que a variedade Conquista foi severamente afetada em todos os parâmetros estudados, com exceção das taxas de fotossíntese e transpiração. Na variedade Valiosa observou-se que a produção de massa seca e taxas de fotossíntese e transpiração não foram afetadas; o acúmulo de Cu e Zn sofreu redução com as doses aplicadas do produto em solução, no entanto, não houve resposta para o acúmulo dos demais nutirentes analisados: N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe e Mn. Houve redução na atividade da enzima nitrogenase no tratamento 32\'mü\'M L-1, entretanto as taxas de FBN não foram prejudicadas na Valiosa. Concluiu-se que o herbicida glifosato afetou negativamente a variedade Conquista, mas teve pouca ação sobre os parâmetros analisados para a variedade Valiosa / Glyphosate is the most used herbicide throughout the world in post-emergent applications of weed species, before sowing or emergence of the cultures. Many works have been performed to understand the way of action of this herbicide, but few with the purpose to study its effect on the microbial populations of the soil, as the Bradyrhizobium japonicum population and the consequent action of the product on Biological Nitrogen Fixation rates (BNF). Little emphasis also has been given to the effect of this product on the macronutrients accumulation in soybean varieties. Thus, the present work aimed to study the action of the ghyphosate on the nitrogenous nutrition in conventional and tolerant soybean, though the nutrients accumulation, nodulation and BNF rates. Two contrast varieties of soybean were tested, one sensitive (BRS Conquista) and one tolerant (BRS Valiosa), in six different doses o the herbicide (0, 2, 4, 8, 16 and 32\'mü\'M L-1) in nutritional solution and foliar application. The plants were collected in the R3 soybean developmental stage (full bloom) and R8, after grains filing and the following parameters were analyzed: dry mass production, photosynthesis and transpiration rates, accumulation of nutrients, nodulation, nitrogenase activity and BNF rates. It was observed that the variety Conquista was severely affected in all the parameters studied, excepted for photosynthesis and transpiration rates. It was also observed that in the Valiosa variety the dry mass production, photosynthesis and transpiration rates were not affected; the Cu and Zn accumulation was reduced with the application of higher doses of the product in solution, however, the other nutrients (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn) did not show any difference in accumulation. There was a reduction in the nitrogenase activity in the 32\'mü\'M L-1 treatment, however the BNF rates were not affected in the Valiosa variety. It was concluded that the herbicide ghyphosate had a negative effect in the variety Conquista, but it had little action on the parameters analyzed for the variety Valiosa

Nos avaliamos o efeito da adubação (orgânica e convencional) sobre a fisiologia de rizobactérias da cana-de-açúcar. Para isto, selecionamos cinco gêneros (Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella e Pseudomonas) prevalentes em canaviais. As bactérias foram isoladas e identificadas e os parâmetros investigados foram: redução de acetileno, produção de AIA, etileno, solubilização de fosfato, excreção de aminoácidos, e antagonismo a fungos. As linhagens do gênero Burkholderia se destacaram para a solubilização de PO4 e antagonismo a fungos. As Pseudomonas se destacaram na produção de etileno e as linhagens de Beijerinckia na redução do acetileno, evidenciando capacidade de fixação de N2. Os gêneros Enterobacter, Klebsiella e Pseudomonas foram os melhores produtores de AIA. In vitro não detectamos a influência da adubação (tratamento de origem), exceto para a solubilização de PO4 inorgânico, pois nossos resultados mostraram que as bactérias oriundas do tratamento orgânico onde o P era abundante não evidenciaram potencial para solubilização de P inorgânico. / We evaluated the fertilization effect (organic and conventional) on the sugarcane rhizobacteria physiology. We isolated and identified bacteria of five genera (Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella and Pseudomonas) prevalent in sugarcane crops. The parameters investigated were: acetylene reduction, IAA and ethylene production, phosphate solubilization, amino acid release, and antifungal activity. Burkholderia strains showed the better results in phosphate solubilization and antifungal activity. The Pseudomonas were prominent in the production of ethylene and Beijerinckia strains showed a greater N2 fixation capacity. The strains from Enterobacter, Klebsiella and Pseudomonas were the better IAA producers. In vitro, our results showed that bacteria isolated from plants submitted to organic treatment with an excess of phosphate, did not show potential for inorganic phosphate solubilization.

O glifosato é o herbicida mais usado mundialmente em aplicações após a emergência das plantas daninhas, antes da semeadura ou emergência das culturas. Muitos trabalhos têm sido realizados para entender seu modo de ação, mas poucos com a finalidade de estudar seu efeito sobre as populações microbianas do solo, como a população de Bradyrhizobium japonicum e a conseqüente ação do produto sobre taxas de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN). Pouca ênfase também tem sido dada aos efeitos do produto sobre o acúmulo de macronutrientes em variedades de soja. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a ação do herbicida glifosato sobre a nutrição nitrogenada em soja convencional e transgênica, avaliando, para tanto, acúmulo de nutrientes, nodulação e taxas de FBN, fotossíntese e transpiração. Foram utilizadas as variedades de soja convencional, BRS Conquista e a transgênica, BRS Valiosa. Foram utilizadas as doses 0, 2, 4, 8, 16 e 32\'mü\'M L-1 do herbicida glifosato em solução nutritiva e aplicação foliar. As plantas foram coletadas no estádio R3, época do florescimento pleno e R8, após o enchimento dos grãos e os seguintes parâmetros foram analisados: produção de massa seca, taxas de fotossíntese e transpiração, acúmulo de macro e micronutrientes, nodulação, atividade da enzima nitrogenase e taxa de FBN. Observou-se que a variedade Conquista foi severamente afetada em todos os parâmetros estudados, com exceção das taxas de fotossíntese e transpiração. Na variedade Valiosa observou-se que a produção de massa seca e taxas de fotossíntese e transpiração não foram afetadas; o acúmulo de Cu e Zn sofreu redução com as doses aplicadas do produto em solução, no entanto, não houve resposta para o acúmulo dos demais nutirentes analisados: N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe e Mn. Houve redução na atividade da enzima nitrogenase no tratamento 32\'mü\'M L-1, entretanto as taxas de FBN não foram prejudicadas na Valiosa. Concluiu-se que o herbicida glifosato afetou negativamente a variedade Conquista, mas teve pouca ação sobre os parâmetros analisados para a variedade Valiosa / Glyphosate is the most used herbicide throughout the world in post-emergent applications of weed species, before sowing or emergence of the cultures. Many works have been performed to understand the way of action of this herbicide, but few with the purpose to study its effect on the microbial populations of the soil, as the Bradyrhizobium japonicum population and the consequent action of the product on Biological Nitrogen Fixation rates (BNF). Little emphasis also has been given to the effect of this product on the macronutrients accumulation in soybean varieties. Thus, the present work aimed to study the action of the ghyphosate on the nitrogenous nutrition in conventional and tolerant soybean, though the nutrients accumulation, nodulation and BNF rates. Two contrast varieties of soybean were tested, one sensitive (BRS Conquista) and one tolerant (BRS Valiosa), in six different doses o the herbicide (0, 2, 4, 8, 16 and 32\'mü\'M L-1) in nutritional solution and foliar application. The plants were collected in the R3 soybean developmental stage (full bloom) and R8, after grains filing and the following parameters were analyzed: dry mass production, photosynthesis and transpiration rates, accumulation of nutrients, nodulation, nitrogenase activity and BNF rates. It was observed that the variety Conquista was severely affected in all the parameters studied, excepted for photosynthesis and transpiration rates. It was also observed that in the Valiosa variety the dry mass production, photosynthesis and transpiration rates were not affected; the Cu and Zn accumulation was reduced with the application of higher doses of the product in solution, however, the other nutrients (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn) did not show any difference in accumulation. There was a reduction in the nitrogenase activity in the 32\'mü\'M L-1 treatment, however the BNF rates were not affected in the Valiosa variety. It was concluded that the herbicide ghyphosate had a negative effect in the variety Conquista, but it had little action on the parameters analyzed for the variety Valiosa

Nos avaliamos o efeito da adubação (orgânica e convencional) sobre a fisiologia de rizobactérias da cana-de-açúcar. Para isto, selecionamos cinco gêneros (Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella e Pseudomonas) prevalentes em canaviais. As bactérias foram isoladas e identificadas e os parâmetros investigados foram: redução de acetileno, produção de AIA, etileno, solubilização de fosfato, excreção de aminoácidos, e antagonismo a fungos. As linhagens do gênero Burkholderia se destacaram para a solubilização de PO4 e antagonismo a fungos. As Pseudomonas se destacaram na produção de etileno e as linhagens de Beijerinckia na redução do acetileno, evidenciando capacidade de fixação de N2. Os gêneros Enterobacter, Klebsiella e Pseudomonas foram os melhores produtores de AIA. In vitro não detectamos a influência da adubação (tratamento de origem), exceto para a solubilização de PO4 inorgânico, pois nossos resultados mostraram que as bactérias oriundas do tratamento orgânico onde o P era abundante não evidenciaram potencial para solubilização de P inorgânico. / We evaluated the fertilization effect (organic and conventional) on the sugarcane rhizobacteria physiology. We isolated and identified bacteria of five genera (Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella and Pseudomonas) prevalent in sugarcane crops. The parameters investigated were: acetylene reduction, IAA and ethylene production, phosphate solubilization, amino acid release, and antifungal activity. Burkholderia strains showed the better results in phosphate solubilization and antifungal activity. The Pseudomonas were prominent in the production of ethylene and Beijerinckia strains showed a greater N2 fixation capacity. The strains from Enterobacter, Klebsiella and Pseudomonas were the better IAA producers. In vitro, our results showed that bacteria isolated from plants submitted to organic treatment with an excess of phosphate, did not show potential for inorganic phosphate solubilization.

O uso intensificado de combustíveis fósseis como fonte de energia, vê-se a necessidade do desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente as renováveis, como o hidrogênio, que possui vantagens por ser elemento abundante no universo, ser renovável e não poluente. A utilização de microalgas e cianobactérias é uma alternativa para a produção de biohidrogênio a partir da quebra da água e de compostos orgânicos. De acordo com isso, nesta pesquisa foram testados diversos fatores físico-químicos e nutricionais nas condições de cultivo de cepas de Chlamydomonas spp. e Anabaena spp. Para tanto, cepas selecionadas foram cultivadas em duas fases experimentais, a primeira aeróbia e a segunda anaeróbia, para proporcionar produção de hidrogênio por biofotólise direta anaeróbia, via hidrogenase, sob privação de enxofre para a clorofícea, e de nitrogênio para a cianobactéria, estimulando para esta também a produção por biofotólise indireta, via nitrogenase. A cepa com melhor produtividade de hidrogênio, de cada gênero, foi selecionada para a etapa de otimização das fases experimentais de cultivo. Durante os ensaios foram realizadas análises de produção máxima, velocidade de produção, volume e produtividade de hidrogênio, além de análises de concentração de biomassa, físico-químicas, bioquímicas e geração de subprodutos. O método utilizado foi eficiente para produção de hidrogênio e ficou comprovada a diferença de produção de hidrogênio entre diferentes cepas. Anabaena sp. obteve produtividade média de hidrogênio quatro vezes maior, aproximadamente de 76,8 µmol.L-1.h-1, comparada a C. reinhardtii, com média de 18,6 µmol.L-1.h-1. / The intensifying use of fossil fuels as energy source, one sees the need to develop new technologies, especially renewable, such as hydrogen. This has advantages because hydrogen is an abundant element in the universe, be renewable and non-polluting. The use of microalgae and cyanobacteria is an alternative for the production of bio-hydrogen of breaking water and organic compounds. Accordingly, in this study were tested several physic-chemical factors and nutrition in growing conditions of Chlamydomonas spp. and Anabaena spp. strains. For this purpose, strains selected were cultured in two experimental phases, first aerobic and second anaerobic, to hydrogen production by direct biofotolise anaerobic, via hydrogenase, under sulfur deprived to chlorofycea, and nitrogen to cyanobacterium, for this also to production by indirect biofotolise, via nitrogenase. The strain with highest productivity of hydrogen, of each gender, was selected for the optimization of the experimental stages of cultivation. During the tests were analyzes of maximum production, velocity, volume and productivity of hydrogen, and analysis of biomass concentration, physic-chemical, biochemical and generation of by-products. The method used was efficient for the production of hydrogen and was different between strains. Anabaena sp. obtained average yield four times highest, approximately 76.8 µmol. L-1.h-1compared to C. reinhardtii, averaging 18.6 µmol. L-1.h-1.