The Mo-nitrogenase complex is composed of two components, Fe-protein and MoFe-protein. This complex is able to catalyze the reduction of N2 through the MgATP dependent transfer of electrons from the Fe-protein Fe4S4 cluster to the MoFe-protein P-cluster and, subsequently, to the iron-molybdenum cofactor (FeMoco). FeMo-co is a Fe7S9MoC-(R)-homocitrate cluster and has two biosynthetic precursors, NifB-co and L-cluster, of unknown structure and composition. The biosynthesis of FeMo-co is an enigmatic process that minimally requires NifB, NifEN, Fe-protein, MoO4 2- , (R)-homocitrate and S-adenolsylmethionine. A means to isolate the NifB enzyme for characterization has been developed through use of a GST-fusion tag. Double recombination of A. vinelandii strains with a constructed vector has yielded strains capable of nif promoter regulated expression of GST-NifB. Extracts of strains containing GST-NifB were shown to activate the Monitrogenase complex in biochemical complementation assays. Mass spectroscopy was then used to verify successful isolation of GST-NifB by GSH-Sepharose affinity purification. The number of NifB-co ligand binding sites and ligand types were examined by EXAFS analysis of samples containing selenol and thiol ligands. A Fe6S9C model for NifB-co was optimized to best fit the EXAFS data, where a 2-fold discrepancy in binding sites implied by thiol or selenol only ligand samples suggests Fe-(μ2S)-Fe binding in the absence of Se. Samples containing heterogeneous ligand types indicated that NifX bound NifB-co ligates to four cysteine residues and one molecule of DTT.

No description available.

Mo-nitrogenase consists of two component proteins, the Fe protein and the MoFe protein. The site of substrate binding and reduction within the Mo-nitrogenase is provided by a metallocluster, the FeMo cofactor, located in the a-subunit of the MoFe protein. The FeMo cofactor's polypeptide environment appears to be intimately involved in the delicate control of the MoFe protein's interactions with its substrates and inhibitors (Fisher K et al., 2000c). In this work, the a-subunit 278-serine residue of the MoFe protein was targeted because (i) a serine residue at this position is conserved both in the Mo-nitrogenase from all organisms examined and in the alternative nitrogenases (Dean, DR and Jacobson MR, 1992); (ii) its hydroxyl group hydrogen bonds to the Sg of the a-subunit 275-cysteine residue that directly ligates the FeMo cofactor; and (iii) its proximity to the a-subunit 277-arginine residue, which may be involved in providing the entry/exit route for substrates and products (Shen J et al., 1997). Altered MoFe proteins of A. vinelandii nitrogenase, with the a278Thr, a278Cys, a278Ala and a278Leu substitutions, were used to study the interactions of H+, C2H2, N2 and CO with the enzyme. All strains, except the a278Leu mutant strain, were Nif+. From measurement of the Km for C2H2 (C2H4 formation) for the altered MoFe proteins, the a278Ala and a278Cys MoFe proteins apparently bind C2H2 similarly to the wild type, whereas the a278Thr and the a278Leu MoFe proteins both have a Km ten-times higher than that of the wild type. Unlike wild type, these last two altered MoFe proteins both produce C2H6. These results suggest that C2H2 binding is affected by substitution at the a-278 position. Moreover, when reducing C2H2, the a278Ala and a278Cys MoFe proteins respond to the inhibitor CO similarly to the wild type, whereas C2H2 reduction catalyzed by the a278Thr MoFe protein is much more sensitive to CO. Under nonsaturating concentrations of CO, the a278Leu MoFe protein catalyzes the reduction of C2H2 with sigmoidal kinetics, which is consistent with inhibitor-induced cooperativity between at least two C2H4-evolving sites. This phenomenon was previously observed with the a277His MoFe protein, in which the a-subunit 277-arginine residue had been substituted (Shen J et al., 1997). Together, these data suggest that the MoFe protein has at least two C2H2-binding sites, one of which may be located near the a277-278 residues and, therefore, most likely on the Fe4S3 sub-cluster of the FeMo cofactor. Like the wild type, N2 is a competitive inhibitor of the reduction of C2H2 by the a278Thr, a278Cys and a278Ala MoFe proteins. Apparently, the binding of N2 in these altered MoFe proteins is similar to that with the wild type MoFe protein, suggesting that the aSer278 residue is not directly involved in N2 binding and reduction. Previous work suggested that both a high-affinity and low-affinity C2H2-binding site were present on the MoFe protein (Davis LC et al., 1979; Christiansen J et al., 2000). Our results are generally consistent with this suggestion. Currently, there is not much information about the proton donors and how the protons necessary to complete all substrate-to-product transformations are transferred. The dependence of activity on pH (activity-pH profiles) has provided useful information about the nature of the groups involved in proton transfer to the FeMo cofactor and the bound substrate. Approximately bell-shaped activity-pH profiles were seen for all products from catalysis by all the MoFe proteins tested whether under Ar, in the presence of C2H2 as a substrate, or with CO as an inhibitor. The profiles suggested that at least two acid-base groups were required for catalytic activity. The pKa values of the deprotonated group and protonated group were determined from the pH that gave 50% maximum specific activity. These pKa values for the altered a278-substituted MoFe proteins and the a195Gln MoFe protein under various assay atmospheres were compared to those determined for the wild type. It was found that the pKa value of the deprotonated group was not affected by either substitution or changing the assay atmosphere. The wild type MoFe protein has a pKa (about 8.3) for the protonated group under 100% argon that was not affected very much by the substitution by Cys, Ala and Leu, whereas the Thr substitution shifted the pKa to about 8, which was the same as that of the wild type MoFe protein in the presence 10% CO. The pKa values for the protonated group for all the altered MoFe proteins were not changed with the addition of 10% CO. These results suggest that the aSer278 residue, through hydrogen bonding to a direct ligand of the FeMo cofactor, is not one of the acid-base groups required for activity. However, this residue may "fine-tune" the pKa of the responsible acid-base group(s) through interaction with the aHis195 residue, which has been suggested (Dilworth MJ et al., 1998; Fisher K et al., 2000b) to be involved in proton transfer to substrates, especially for N2 reduction. The activity-pH profiles under different atmospheres also support the idea that more than one proton pathway appears to be involved in catalysis, and specific pathway(s) may be used by individual substrates. / Ph. D.

O Níquel (Ni) é um micronutriente para as plantas, por ser componente estrutural das enzimas urease e hidrogenase, que desempenham função no metabolismo do nitrogênio (N) nas plantas leguminosas. A aplicação de Ni via tratamento de semente em soja pode potencializar o processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) com a finalidade de proporcionar maior produção de biomassa da parte aérea e de grãos. Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito da aplicação de doses de Ni, via tratamento de semente, no processo de FBN em plantas de soja, por meio da atividade de nitrogenase (ANase) e da abundância natural de 15N (? 15N?). Foi realizado um experimento em casa de vegetação, em condições controladas. O genótipo de soja BMX POTÊNCIA RR foi cultivado em solo arenoso e submetido à aplicação de 0; 45; 90; 135; 180; 360; e 540 mg kg-1 de Ni aplicado via tratamento de semente. As plantas de soja foram conduzidas até o estádio fenológico R7 (maturação dos grãos). Foram avaliadas a concentração de macro e micronutrientes nas folhas utilizadas para diagnose, determinou-se o teor de clorofila, a atividade enzimática da urease, bem como se quantificou a massa seca de nódulos, no estádio fenológico R1 (Início da floração: até 50% das plantas com flor). Foram ainda determinados: as produções de massa seca de parte aérea e de grãos, o índice de colheita, os acúmulos de Ni e de N na semente e a contribuição da fixação biológica de nitrogênio, por meio da técnica de abundância natural de 15N e indiretamente através da técnica da redução do acetileno (atividade da nitrogenase). Observou-se que as doses de Ni exerceram efeitos em todos os parâmetros avaliados. A aplicação de Ni na dose de 45 mg kg-1 aumentou a fixação biológica de N na ordem de 12% em relação ao tratamento controle (sem adição de Ni) e incrementou o acúmulo de Ni e de N no grão, com efeito na atividade da enzima urease. A aplicação de 45 e 90 mg kg-1 de níquel via semente resultou, respectivamente, no aumento de 67% e 77% da atividade da NAase em relação ao controle. Pela análise da abundância natural de 15N no grão (?15N?) observou-se que houve diferença na FBN entre os tratamentos e que a aplicação da dose de 45 mg kg-1, de Ni via semente, revelou que 99% do N acumulado no grão foi proveniente da FBN, enquanto que no tratamento sem adição de Ni via semente, a contribuição da FBN foi de apenas 77%. Nas condições do experimento, a aplicação de Ni na semente refletiu em maior produção de massa seca de parte aérea e na produção de grãos de soja / Nickel (Ni) is an essential micronutrient for plants due to its role on structural component of the enzymes urease and hydrogenase, which perform nitrogen (N) metabolism in legumes plants. Seed treatment with Ni in soybean might improve the symbiotic or biological nitrogen fixation (BNF) process, by increasing biomass production and grain yield. The objective of this study was to evaluate the effect of soybean seed treatment with Ni rates on the biological nitrogen fixation (BNF) process by evaluating the nitrogenase activity (NAase), the natural 15N abundance (? 15N ?) and urease activity in soybean plants, as well. The experiment was carried out in greenhouse with controlled conditions. The soybean cultivar used was BMX POTÊNCIA RR, which was grown in sandy soil, and submitted to application of 0, 45, 90,135, 180, 360 and 540 mg kg-1 of Ni on the seed treatment. Soybean plants were grown up to the R7 developmental stage (grain maturity). Macro and micronutrients concentration in the leaves used for diagnosis, as well as the chlorophyll content and urease activity have been determined on these tissues, and dry weight of nodules were evaluated in developmental stage R1 (flowering stage). The following measurements also were made: dry matter yield of plant top, dry matter yield of grains, the harvest index, uptake of Ni and N in the seed and the contribution of biological nitrogen fixation by 15N natural abundance and to indirectly way by the reduction of acetylene technique (nitrogenase activity), as well. It was observed that Ni rates influenced all parameters. Application of Ni rate of 45 mg kg-1 increased biological nitrogen fixation in the order of 12% as compared to the control. Ni rates of 45 and 90 mg kg-1 via seed treatment increased the NAase activity, respectively, in 67% and 77% compared to the control. Other benefits of Ni-soybean seeds treatment were the increased accumulation of Ni and N on the grain and its positive influence on the urease activity. By analyzing the natural abundance of 15N on the grain (?15N ?) it was observed that there were differences between treatments in the symbiotic nitrogen fixation. Around 99% of total N taken up in the seeds came from biological nitrogen fixation by supplying Ni-seed application rate of 45 mg kg-1, whereas in the control, the contribution of BNF was only 77%. In these experimental conditions, seed treatment with Ni reflected in higher dry matter production of plant top and grain yield

A fixação biológica de nitrogênio (FBN) consiste na principal fonte de obtenção de nitrogênio (N) pela cultura da soja [Glycine max (L.) Merrill]. A aplicação de fertilizantes nitrogenados pode comprometer a eficiência da nodulação e não ser traduzida em ganhos significativos de produtividade, representando assim um custo dispensável ao produtor. Objetivou-se com esse trabalho avaliar o efeito exclusivo da FBN, da aplicação de nitrogênio mineral (ureia) no estádio fenológico V1, no florescimento e em ambos os momentos para avaliar a quantidade de 15N na planta proveniente do solo, do fertilizante e da fixação biológica de nitrogênio (FBN) - por meio da técnica de diluição isotópica -, avaliar a nodulação, a atividade da nitrogenase e nitrato redutase, a concentração e o acúmulo de N, a redistribuição de N, o crescimento e a produção de grãos das plantas. As plantas de soja não responderam à aplicação de N na maioria das variáveis. A massa de matéria seca das raízes, parte aérea e grãos, os componentes de produtividade, a atividade da nitrato redutase, a taxa de assimilação de CO2, a concentração e o acúmulo de N nas partes da planta, no fim do ciclo, não diferiram entre as formas de aplicação de N. Quando foi aplicada ureia em V1, houve redução no número de nódulos avaliados em V4 e redução na atividade da nitrogenase no florescimento. As folhas e a haste foram responsáveis pela maior parte da remobilização de N aos grãos. Mais de 50% do N-total das partes da planta, em todos os tratamentos, vieram da FBN, exceto para as folhas nos tratamentos com aplicação de N via solo. Nos grãos, a FBN contribuiu com aproximadamente 80% do N-total acumulado quando houve aplicação de ureia em V1, 96% no tratamento com ureia via foliar no florescimento e 75% com ambas as aplicações / Biological nitrogen fixation (BNF) is the main source of nitrogen (N) uptake and assimilation by soybean [Glycine max (L.) Merrill] crop. The hypothesis to be verified is whether the mineral-N supply as fertilizer can decrease nodulation and N-metabolism as well as reduce grains yield and shoot biomass. The aims of this work were to evaluate the main effect of BNF, the application of mineral nitrogen (urea) at V1 phenological stage, flowering and both times and quantify the soil-N supply in order to evaluate the amount of 15N taken up by plants from soil, fertilizer and the contribution of BNF, by means of the isotope dilution technique. We have evaluated plant nodulation, nitrogenase and nitrate reductase activity, quantification of N concentration and accumulation, N redistribution (retranslocation), growth, biomass and grains yield. Soybean plants did not respond to N application for the most of variables. The root, shoot and grain dry weight, yield components, nitrate reductase activity, CO2 assimilation rate, N-concentration and N-accumulation at R8 phenological stage did not differ, regardless N application. When applied at V1, urea reduced the number of nodules accounted at V4 phenological stage and the nitrogenase activity at flowering. Leaves and stem were the main source for most of N redistributed to grains (sink). BNF provided more than 50% of the total plant N in all treatments, except for leaves of plants that received N application to soil. Nearly 80% of grains N derived from BNF when urea was applied at V1, 96% for the foliar N treatment at flowering and 75% for both N applications

O Níquel (Ni) é um micronutriente para as plantas, por ser componente estrutural das enzimas urease e hidrogenase, que desempenham função no metabolismo do nitrogênio (N) nas plantas leguminosas. A aplicação de Ni via tratamento de semente em soja pode potencializar o processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) com a finalidade de proporcionar maior produção de biomassa da parte aérea e de grãos. Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito da aplicação de doses de Ni, via tratamento de semente, no processo de FBN em plantas de soja, por meio da atividade de nitrogenase (ANase) e da abundância natural de 15N (? 15N?). Foi realizado um experimento em casa de vegetação, em condições controladas. O genótipo de soja BMX POTÊNCIA RR foi cultivado em solo arenoso e submetido à aplicação de 0; 45; 90; 135; 180; 360; e 540 mg kg-1 de Ni aplicado via tratamento de semente. As plantas de soja foram conduzidas até o estádio fenológico R7 (maturação dos grãos). Foram avaliadas a concentração de macro e micronutrientes nas folhas utilizadas para diagnose, determinou-se o teor de clorofila, a atividade enzimática da urease, bem como se quantificou a massa seca de nódulos, no estádio fenológico R1 (Início da floração: até 50% das plantas com flor). Foram ainda determinados: as produções de massa seca de parte aérea e de grãos, o índice de colheita, os acúmulos de Ni e de N na semente e a contribuição da fixação biológica de nitrogênio, por meio da técnica de abundância natural de 15N e indiretamente através da técnica da redução do acetileno (atividade da nitrogenase). Observou-se que as doses de Ni exerceram efeitos em todos os parâmetros avaliados. A aplicação de Ni na dose de 45 mg kg-1 aumentou a fixação biológica de N na ordem de 12% em relação ao tratamento controle (sem adição de Ni) e incrementou o acúmulo de Ni e de N no grão, com efeito na atividade da enzima urease. A aplicação de 45 e 90 mg kg-1 de níquel via semente resultou, respectivamente, no aumento de 67% e 77% da atividade da NAase em relação ao controle. Pela análise da abundância natural de 15N no grão (?15N?) observou-se que houve diferença na FBN entre os tratamentos e que a aplicação da dose de 45 mg kg-1, de Ni via semente, revelou que 99% do N acumulado no grão foi proveniente da FBN, enquanto que no tratamento sem adição de Ni via semente, a contribuição da FBN foi de apenas 77%. Nas condições do experimento, a aplicação de Ni na semente refletiu em maior produção de massa seca de parte aérea e na produção de grãos de soja / Nickel (Ni) is an essential micronutrient for plants due to its role on structural component of the enzymes urease and hydrogenase, which perform nitrogen (N) metabolism in legumes plants. Seed treatment with Ni in soybean might improve the symbiotic or biological nitrogen fixation (BNF) process, by increasing biomass production and grain yield. The objective of this study was to evaluate the effect of soybean seed treatment with Ni rates on the biological nitrogen fixation (BNF) process by evaluating the nitrogenase activity (NAase), the natural 15N abundance (? 15N ?) and urease activity in soybean plants, as well. The experiment was carried out in greenhouse with controlled conditions. The soybean cultivar used was BMX POTÊNCIA RR, which was grown in sandy soil, and submitted to application of 0, 45, 90,135, 180, 360 and 540 mg kg-1 of Ni on the seed treatment. Soybean plants were grown up to the R7 developmental stage (grain maturity). Macro and micronutrients concentration in the leaves used for diagnosis, as well as the chlorophyll content and urease activity have been determined on these tissues, and dry weight of nodules were evaluated in developmental stage R1 (flowering stage). The following measurements also were made: dry matter yield of plant top, dry matter yield of grains, the harvest index, uptake of Ni and N in the seed and the contribution of biological nitrogen fixation by 15N natural abundance and to indirectly way by the reduction of acetylene technique (nitrogenase activity), as well. It was observed that Ni rates influenced all parameters. Application of Ni rate of 45 mg kg-1 increased biological nitrogen fixation in the order of 12% as compared to the control. Ni rates of 45 and 90 mg kg-1 via seed treatment increased the NAase activity, respectively, in 67% and 77% compared to the control. Other benefits of Ni-soybean seeds treatment were the increased accumulation of Ni and N on the grain and its positive influence on the urease activity. By analyzing the natural abundance of 15N on the grain (?15N ?) it was observed that there were differences between treatments in the symbiotic nitrogen fixation. Around 99% of total N taken up in the seeds came from biological nitrogen fixation by supplying Ni-seed application rate of 45 mg kg-1, whereas in the control, the contribution of BNF was only 77%. In these experimental conditions, seed treatment with Ni reflected in higher dry matter production of plant top and grain yield

Orientadores: Marlene Aparecida Schiavinato, Claudia Baptista Haddad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:06:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_AnaLuciadaSilva_D.pdf: 355483 bytes, checksum: 9ce9e116731fc53ab23c70ac20c5cf48 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A duração do ciclo de vida foliar determina características distintas nas folhas, que são relevantes para a sobrevivência da planta em diferentes habitats. Tem sido verificado que as espécies perenifólias apresentam mecanismos mais eficientes de conservação de nitrogênio (N) em relação às espécies decíduas. Esses mecanismos são: eficiência de reaproveitamento de nitrogênio (ERN), proficiência de reaproveitamento de nitrogênio (PRN) e eficiência do uso de nitrogênio (EUN). Segundo um dos paradigmas da ecologia vegetal, as espécies crescendo em ambientes oligotróficos têm maior eficiência de reaproveitamento de nutrientes em relação a espécies características de ambientes eutróficos. A PRN em espécies adaptadas a solos poço férteis é maior do que a de espécies de solos mais férteis. Plantas com longo ciclo de vida foliar possuem maior EUN do que plantas com folhas menos longevas e esta eficiência aumenta com o decréscimo da concentração de nutriente no solo. Espécies perenifólias apresentam maior longevidade foliar do que as decíduas e maior concentração de fenóis. Por outro lado, a concentração de taninos costuma ser maior nas folhas de espécies decíduas. É visto também que as espécies com folhas mais longevas possuem menor concentração de N total, menor concentração de compostos nitrogenados e maior massa foliar específica (MFE). O objetivo deste trabalho foi verificar se as observações encontradas na literatura, comparando espécies perenifólias e decíduas, aplicam-se também às espécies semidecíduas (Hymenaea courbaril - sem FSN e Lonchocarpus guilleminianus ¿ com FSN) e decíduas (Enterolobium contortisiliquum ¿ com FSN e Peltophorum dubium - sem FSN) encontrada em uma Mata Estacional Semidecídua remanescente da Mata Atlântica. As plantas foram cultivadas em casa de vegetação, em vasos contendo solo de local onde as espécies são encontradas na mata, enriquecido ou não com N. Plantas de H. courbaril e P. dubium também foram cultivadas em areia. Houve decréscimo na concentração de clorofila total com o avanço da idade foliar nas quatro espécies. As ERN, PRN e EUN decresceram com o aumento da concentração de N no solo. Espécies com FSN apresentaram menor ERN, PRN e EUN em relação às espécies sem FSN. Plantas cultivadas em areia tiveram maiores ERN, PRN e EUN. Os resultados mostraram uma relação inversa entre os parâmetros de ERN, PRN, EUN e presença de FSN e fertilidade do solo. Os resultados obtidos corroboram os da literatura, já que as espécies com folhas mais longevas apresentaram concentrações maiores de fenóis e maior MFE, menores de taninos, nitrato, proteínas, aminoácidos, clorofila e N total / Abstract: Depending on the leaf life span, the leaves show distinct characteristics, which are relevant to the survival of the plant in different habitats. It has been noticed that the evergreen species show more efficient mechanisms of Nitrogen (N) conservation. These mechanisms are related to N Resorption Efficiency (NRE), N Resorption Proficiency (NRP) and N Use Efficiency (NUE). According to one of the paradigms of plant ecology, species growing in oligotrophic environments are more efficient in nutrient resorption than species from eutrophic environments. It is well known that the NRP in species adapted to soils which are not very fertile, is higher than in species of fertile soils. Plants with long leaf life span have higher NUE than plants with shorter leaf life span and the NUE increases with the decrease of nutrient in the soil. Since the evergreen species present longer leaf life span than the deciduous, their leaves present higher concentration of phenolic compound. On the other hand, the concentration of tannins is usually higher in leaves of deciduous species. It is also known that the long leaf life species have lower concentration of nitrogen compounds and higher Specific Leaf Mass (SLM). The objective of this study was to verify if the observations found in literature, comparing evergreen species to deciduous species, are also applied to the semi deciduous species (Hymenaea courbaril - without SNF and Lonchocarpus guilleminianus ¿ with SNF) and deciduous species, (Enterolobium contortisiliquum ¿ with SNF and Peltophorum dubium - without SNF) of a semi deciduous tropical forest, remnant of the Atlantic Forest. The plants were grown in a greenhouse; in pots filled with soil from their natural environment, enriched or not with N. Plants of H. courbaril and P. dubium were also grown in sand. The results obtained confirm the observations cited in the literature, since the species with longer leaf life span presented higher SLM and concentrations of phenolic compounds, lower concentrations of tannins, nitrate, total proteins, total free amino acids, chlorophyll total), total N. There was a fall in the concentration of total chlorophyll with the advance of leaf age in the four species. The NRE, NRP and NUE decreased with the increase of N concentration in the soil. Species with SNF presented lower NRE, NRP and NUE if compared to species without SNF / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

A Brachiaria brizantha é considerada uma das forrageiras preferidas entre os agropecuaristas por possuir elevada produção de forragem, tolerância ao calor e ao déficit hídrico, alta resposta à aplicação de fertilizantes, produção em grande massa de raízes e sementes, resistência à cigarrinha das pastagens (exceto as pertencentes ao gênero Mahanarva) e boa competição com plantas invasoras. É considerada a principal fonte de alimento para bovinos, sendo utilizada tanto na cria, recria, como na engorda dos animais. As bactérias fixadoras de nitrogênio ou diazotróficas são procariotos capazes de reduzir o N2 a NH3, forma assimilável pelos organismos, e também podem produzir hormônios vegetais, como ácido-indol-acético, que estimulam o crescimento radicular da planta. Estes micro-organismos apresentam grande importância para a manutenção dos ecossistemas. Sua associação com as raízes de plantas e seu efeito promotor quando associados à Brachiaria brizantha possibilitaria a recuperação de áreas de pastagens que apresentam deficiência de nitrogênio, o que é um mecanismo ainda pouco explorado. Com o objetivo de estudar esta possibilidade, foram escolhidas três áreas (Nova Odessa-SP, São Carlos- SP e Campo Verde-MT), preferencialmente onde o nitrogênio era limitante, constituídas por pastagem de Brachiaria brizantha para a amostragem de solo e raiz. Os três locais demonstraram a ocorrência de diazotróficos, após o isolamento e cultivo das bactérias em meio de cultivo semisólido sem adição de nitrogênio na forma combinada (JNFb). Foram obtidas 110 estirpes bacterianas e, após sorteio aleatório, 72 isolados foram mantidos para realização de testes a fim de se avaliar o potencial biotecnológico das bactérias. Destes, 10 demonstraram atividade da nitrogenase quando submetidos ao método de aumento na concentração de nitrogênio total (Ntotal) em meio de cultura. 57 isolados foram capazes de reduzir o gás acetileno a etileno quando submetidos à técnica de redução de acetileno. As estirpes bacterianas C4 (Pseudomonas sp.) e C7 (Azospirillum sp.), isoladas da rizosfera de Brachiaria brizantha da área de Campo Verde-MT, se destacaram das demais por apresentar atividade da nitrogenase muito superior até a de bactérias diazotróficas que foram incluídas na avaliação como testemunhas positivas. Outros 68 isolados produziram o hormônio vegetal ácido-indol-acético quando cultivados em meio de cultivo LB, na presença de triptofano. A produção variou de 0,39µg/mL a 195 µg/mL de AIA. Todos os 72 isolados foram utilizados em experimento em casa de vegetação para avaliar o efeito de inoculação em B. brizantha quando com eles inoculada. Avaliaram-se a matéria seca da parte aérea e raiz e o teor de nitrogênio total da parte aérea através do método micro-Kjeldhal. Nenhum isolado diferiu significativamente do controle sem inoculação bacteriana que continha a mesma dose de nitrogênio fornecido às plantas. O seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA dos 72 isolados permitiu a caracterização de sete grupos genotípicos: Stenotrophomonas sp, Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Bacillus sp., Rhizobium sp, Sphingomonas sp. e Azospirillum sp. O gênero Stenotrophomonas sp. predominou (69%) nas três áreas de estudo. / Brachiaria brizantha is considered one of preferred fodders among farmers for having high forage yield, tolerance to heat and drought, high response to fertilizer application, large production of root mass and seeds, resistance to grassland leafhopper (except those belonging to the genus Mahanarva) and good competition with weeds. It is considered the main source of food for cattle, being used in the raising, breeding, and fattening of animals. The nitrogen fixing bacteria or diazotrophs are prokaryotes able to reduce N2 to NH3, which is assimilated by organisms, and may also produce plant hormones such as indole-acetic acid, which stimulates root growth. These micro-organisms have great importance for the maintenance of ecosystems. Their association with plant roots and their promoting effect when combined with Brachiaria brizantha enable recovery of nitrogen-deficient grazing areas, which is a mechanism still little explored. Therefore, three areas were chosen (Nova Odessa-SP, Sao Carlos-SP and Campo Verde-MT), preferably where nitrogen was limiting, consisting of Brachiaria brizantha from which samples of soil and roots were collected. The three sites showed the occurrence of diazotrophs after the isolation and cultivation of bacteria in semi-solid culture medium with no nitrogen added in the combined form (JNFb). It was obtained 110 bacterial strains and, after the raffle random, 72 were kept isolated for testing in order to assess the biotechnological potential of bacteria. From which, 10 showed nitrogenase activity when subjected to the method of total nitrogen concentration increase (N-total) in the culture medium. 57 isolates were able to reduce acetylene to ethylene when subjected to the acetylene reduction technique. The strains C4 (Pseudomonas sp.) and C7 (Azospirillum sp.), isolated from the rhizosphere of Brachiaria brizantha in the area of Campo Verde-MT, stood out from the others by presenting nitrogenase activity far superior to that of diazotrophs recommended as positive controls. Other 68 isolates produced the plant hormone indole-acetic acid when grown in LB culture medium in the presence of tryptophan. Production ranged from 0.39 g/mL to 195 g/mL of IAA. All 72 isolates were used in an experiment in a greenhouse to evaluate the effect of inoculation on B. brizantha. Evaluations were carried out on dry matter of shoot and root and total nitrogen content of the shoot through the micro-Kjeldahl method. None of the isolates differed significantly from the control without bacterial inoculation which contained the same amount of nitrogen supplied to plants. Partial sequencing of the 16S rRNA of the 72 isolates allowed the characterization of seven genotype groups: Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Bacillus sp., Rhizobium, Sphingomonas sp. and Azospirillum sp. The genus Stenotrophomonas sp. predominated (69%) in the three study areas.

As cianobactérias caracterizam-se como o grupo de micro-organismos fotoautotrófico mais abundante encontrado nas regiões polares. Representantes deste grupo realizam a fotossíntese oxigênica e também podem fixar o nitrogênio atmosférico. A maioria dos levantamentos da comunidade de cianobactérias na Antártica tem sido realizada apenas por meio de observações microscópicas de amostras ambientais. O isolamento de linhagens e consequentes estudos fisiológicos, bem como, análises independentes de cultivo ainda são escassos. Neste estudo a comunidade de cianobactérias de duas ilhas oceânicas da Antártica foi investigada utilizando abordagens moleculares dependentes e independentes de cultivo. O papel ecológico das cianobactérias como fornecedoras de formas assimiláveis de nitrogênio e o potencial genético para biossíntese de produtos naturais também foi avaliado. Sessenta e oito linhagens de cianobactérias foram isoladas a partir de diferentes substratos coletados. Elas pertencem às ordens Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales e Nostocales, famílias Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae e Rivulariaceae. Análises filogenéticas baseadas nas sequências de RNAr 16S dessas cianobactérias revelou a existência de agrupamentos: formado exclusivamente por sequência de linhagem isolada nesse trabalho; composto por sequências antárticas oriundas desse e de outros trabalhos desenvolvidos em outras regiões antárticas; e por sequências originárias de diversas regiões do mundo. Quarenta e uma linhagens apresentaram fragmento do gene nifH, responsável pela codificação do complexo enzimático da nitrogenase, o qual está envolvido na fixação biológica do nitrogênio (FBN). Formas unicelulares (Chroococcales), homocitadas (Pseudanabaenales e Oscillatoriales) e heterocitadas (Nostocales) apresentaram potencial genético para realização da FBN, e 18 delas foram submetidas aos testes de redução de acetileno (ARA) com alta sensibilidade de detecção. Todas as linhagens testadas exibiram alguma atividade em resposta a diferentes concentrações de oxigênio e/ou a luminosidade em diferentes condições de temperatura. Filogeneticamente, as sequências do gene nifH apresentaram três padrões distintos de agrupamento, o que pode estar relacionado aos eventos evolutivos envolvidos na distribuição e ou manutenção deste gene. A presença de genes e ou regiões intergênicas evidenciaram o elevado potencial genético dessas linhagens para sintetizar produtos naturais com interesse biotecnológico. A abundância no número de cópias do gene nifH relacionado às cianobactérias nas amostras de biofilme reforça a importância desse grupo de microorganismos como fornecedor de formas reduzidas de N para o ambiente antártico. A análise da comunidade de cianobactérias por meio do sequenciamento do RNAr 16S de DNA metagenômico evidenciou predominância de UTOs relacionadas às ordens Nostocales, Oscillatoriales e Pseudanabaenales, famílias Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae e Rivulariaceae. A árvore filogenética contendo as sequências de cianobactérias cultivadas e não-cultivadas mostrou que somente parte da comunidade presente em biofilmes foi acessada por isolamento, indicando a complementariedade entre as duas abordagens utilizadas na análise da comunidade de cianobactérias / Cyanobacteria are characterized as the most abundant group of photoautotrophic microorganisms found in the polar regions. Members of this group perform oxygenic photosynthesis and many of them can also fix atmospheric nitrogen. Investigations on the cyanobacterial community have been made mainly applying microscopic observations of environmental samples. Cyanobacterial isolation, physiological studies and cultureindependent analyses are scarce. In this study the cyanobacterial community from two oceanic islands in Antarctica was investigated using culture-dependent and independent approaches. Also, the ecological role of this group of microorganisms as nitrogen-fixing organisms and the genetic potential for biosynthesis of natural products were evaluated. Sixty-eight cyanobacterial strains were isolated from different environmental samples. They belong to the orders Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales and Nostocales, families Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae and Rivulariaceae. Phylogenetic analyses based on 16S rRNA sequences of these cyanobacteria revealed the existence of groups: exclusively formed by sequence of strain isolated in this work; intermixed sequences from this and other studies developed in other Antarctic regions; and sequences originated from different regions of the world. Fortyone cultured strains possess the nifH gene fragment encoding the nitrogenase enzyme complex, which is related to the biological nitrogen fixation (BNF). Unicellular (Chroococcales), homocytous (Pseudanabaenales and Oscillatoriales) and heterocytous forms (Nostocales) showed genetic potential for BNF, and 18 of them were subjected to acetylene reduction assay (ARA) coupled with a sensitive laser photoacoustic ethylene detector. All strains tested exhibited some nitrogenase activity in response to different concentrations of oxygen and or irradiance under different temperature conditions. Phylogenetically, the nifH gene sequences showed three distinct grouping patterns that may be related to the evolutionary events involved in the distribution and or maintenance of this gene. The presence of genes and or intergenic regions in these cyanobacterial strains underscores the genetic potential of them to synthesize natural products with biotechnological interest.The abundance of nifH gene copies related to cyanobacteria in biofilm samples highlights the importance of this group of microorganisms as suppliers of N reduced forms for Antarctic environment. The analysis of the cyanobacteria community revealed by 16S rRNA sequencing of metagenomic DNA showed a predominance of OTUs related to orders Nostocales, Oscillatoriales and Pseudanabaenales, families Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae and Rivulariaceae. The phylogenetic tree containing Antarctic sequences from cultivated and uncultivated cyanobacteria showed that only part of this community in biofilms has been accessed by isolation, indicating the complementarity between the two approaches used in the analysis of cyanobacterial community

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