Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-31 / Objetivo: caracterizar farmacológicamente as respostas à bradicinina e outros agonistas no músculo liso não vascular (fundo do estômago) e vascular (aorta abdominal) isolados de animais nocaute B1 e B2 de cininas. Métodos: Foram isolados fundus de estômago e aorta abdominal de animais normais, nocaute B1 e animais nocaute B2; registros de contrações isométricas foram obtidos para determinação da potência e eficácia dos agonistas. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas e não-cumulativas dos agonistas peptídicos bradicinina (BK), Des-Arg9 bradicinina, angiotensina II (AII) e endotelina-1 (ET-1). Resultados: O estudo da potência em fundus de estômago isolado de animais nocautes revelou que a afinidade dos agonistas testados, não foi alterada. Quanto ao efeito máximo, verificou-se que a ausência do receptor B1 diminuiu a eficácia da BK, porém não da ET-1 e AII. No tecido vascular, a BK mostrou-se menos eficaz em animais nocaute B1 assim como a ET-1, enquanto a AII teve sua eficácia diminuída, tanto em animais nocaute B1 como B2. As respostas à ET-1 e AII apresentaram o Emax alterado nos animais nocautes o qual foi revertido em nocaute duplo B1 e B2. Conclusão: A verificação de que a afinidade relativa dos agonistas testados, no estômago isolado de camundongos nocautes B1 e B2 não foi alterada significativamente em relação à determinada em animais WT, sugeriu que neste tecido não ocorrem interações entre os receptores que afetariam a ligação dos agonistas ao seu receptor. Entretanto a redução na contração máxima induzida pela BK no animal nocaute B1 poderia estar relacionada com o elevado nível de óxido nítrico (NO) endógeno encontrado no fundus de estômago desse animal. Porém, L-NAME (inibidor da NO sintase) não afetou o Emax da BK, descartando essa hipótese. Considerando-se que heterodimerização entre os receptores B1 e B2 ocorre nas células do estômago, a falta de B1 teria favorecido a homodimerização do B2, que leva à ativação e dessensibilização, induzindo a taquifilaxia mais acentuada para a BK, e a redução do Emax. Para o caso da AII, que mostrou ter a afinidade e a eficácia mantidas nos nocautes, mas a taquifilaxia atenuada no KOB1 e no KOB2 poderia ser atribuída ou a heterodimerização entre os receptores B2 e AT1 no KOB1 ou a homodimerização entre os receptores AT1 no KOB2. Quanto à aorta abdominal, esta se mostrou sensível à BK, mas não a DBK que não induziu resposta no WT e nos nocautes, sugerindo que este receptor não seria expresso. Entretanto aorta isolada de KOB1 teve a sensibilidade drasticamente reduzida à BK que é mediada pelo receptor B2 indicando expressão funcional importante do receptor B1 nesta preparação. Quanto a ET-1, a eficácia diminuída somente no animal KOB1 poderia ser devida à interação cruzada do receptor da ET-1 com o B2, que deixaria de dimerizar com o B1. A AII teve sua eficácia diminuída nos animais KOB1 e KOB2, sugerindo que heterodimerização entre estes receptores e também destes com o AT1 da AII poderia ocorrer, favorecendo a ação da AII. Os resultados obtidos no fundus do estômago e na aorta abdominal sugerem importância na expressão funcional simultânea dos receptores B1 e B2 em ambas as preparações, e interferência nos mecanismos de transdução de sinais, afetando a contração e relaxamento de músculos lisos vascular e não-vascular. / Purpose: to pharmacologically characterize the responses to bradykinin (BK) and other agonists in non-vascular (stomach fundus) and vascular (aorta) smooth muscles isolated from kinin B1 and B2 receptor knockout mice. Methods: stomach fundus and aorta were isolated from normal , B1 knockout and B2 knockout animals; isometric contraction recordings were obtained for potency and efficacy determinations of agonists; cumulatively and non-cumulatively increasing doses of agonists such as BK, desArg9BK (DABK), angiotensin II (AII) and endothelin (ET-1) were applyied. Results: Potency (pD2) values determined in stomach fundus of WT and KO animals revealed that the affinity of agonists was maintained. Concerning the maximal effect induced by agonists, the efficacy of BK, but not AII and ET-1 was reduced in KOB1 animals. In the vascular tissue, BK was shown to be less efficient in KOB1 and KOB2 than in WT. The responses to AII and to ET-1 were reduced in KOB1 animals but it was reverted in KOB2 animals. In addition, stomach from KOB1 was found to be impaired to relax to sodium nitroprusside whereas the relaxant response was inaltered in KOB2, indicating that the deletion of B1 receptor led to important changes in the Ca regulation mechanism. Conclusions: The finding that the relative affinity of the agonists was not affected in stomach from knockout animals suggested that in this tissue there is no cross talking between kinin receptors and other agonist receptors. However the reduction in the maximal response to BK1 receptor might favoured the homodimerization of B2, which lead to activation and dessensitization, inducing an accentuated tachyphylaxis to BK and also the reduced maximal effect. In the case of AII, which showed a high affinity and efficacy, but the tachyphylaxis was attenuated in knockout animals, it can be suggested that there was formation of homodimers of B2 receptors rather than heterodimers between kinin B2 and AII AT1 receptors due to the absence of B1 receptors. Concerning BK- but not DABK induced effect in abdominal aorta in normal and knockout animals, indicated that B1 receptors would not express in this tissue. But the drastic reduction in change in sensitivity of the aorta towards BK-induced contraction suggested that B1 receptor should be mediating kinin mediated effect. The finding that the efficacy of ET-1 was reduced in KOB1 whereas that of AII was affected in aorta of the two knockout animals suggest that there must be cross talk between kinin receptors and of ET-1 and AII or between signal transduction activateed by these agonists. It is concluded that B1 and B2 receptors in stomach fundus and in abdominal aorta both receptors play important role for functional expression of kinins and that they are involved in the mechanisms of cell signaling, affecting the vascular and non-vascular smooth muscle contraction and relaxation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dentre os mecanismos relacionados à interação bactéria-planta, a biossíntese bacteriana de ácido indol acético (AIA) exerce um papel fundamental na promoção do crescimento vegetal, uma vez que é capaz de influenciar inúmeros processos fisiológicos nas plantas. Diferentes vias metabólicas são utilizadas pelas bactérias para a biossíntese do AIA, sendo a via do ácido indol-3-pirúvico (IPyA) a mais comumente descrita. Nesta via encontra-se o gene indol-3-piruvato descarboxilase (ipdC) com vital função na produção de AIA utilizando como precursor o aminoácido L-triptofano. Nesse contexto, estudos moleculares acerca das vias metabólicas e dos genes envolvidos nesse processo são preponderantes para o entendimento da inter-relação das vias regulatórias com a síntese do fitormônio. A rizobactéria Bacillus sp. (RZ2MS9) vem apresentando satisfatória atividade na promoção de crescimento vegetal. O sequenciamento do seu genoma apontou a presença de uma vasta gama de genes relacionados à promoção do crescimento, com destaque para genes codificadores de auxinas. Assim, o estudo teve por objetivo comprovar a função do gene ipdC na biossíntese do AIA pela via dpendente do L-triptofano através do nocaute sítio dirigido do gene ipdC na Rizobactéria Promotora do Crescimento em Plantas (RPCP) Bacillus sp. (RZ2MS9). Para tanto, foi realizado o nocaute sítio dirigido por meio da técnica de CRISPR-Cas9. O nocaute do gene ipdC foi eficiente, gerando mutantes disruptivos para o referido gene. A biossíntese do AIA pela linhagem ΔipdC apresentou reduções nas concentrações do fitormônio, de acordo com o tempo de crescimento, sendo 87,96% em 24 horas, 88,25% em 48 horas e 58,27% em 72 horas do crescimento em comparação à linhagem selvagem (WT). Além disso, a biossíntese do AIA na ausência do aminoácido L-triptofano também foi avaliada, não sendo constatada síntese do fitormônio em nenhum dos tempos crescimento, tanto na linhagem selvagem, quanto na linhagem ΔipdC. O presente estudo foi pioneiro no nocaute do gene ipdC em uma linhagem de Bacillus utilizando a técnica de CRISPR-Cas9. Os resultados obtidos contribuem para um melhor entendimento da influência do gene ipdC e da via IPyA na biossíntese do AIA pela linhagem RZ2MS9 e futuramente sera comprovado seu papel na promoção de crescimento vegetal. / Among the mechanisms related to the bacterium-plant interaction, the bacterial biosynthesis of indole acetic acid (AIA) plays a fundamental role in the promotion of plant growth, since it is capable of influencing innumerable physiological processes in plants. Different metabolic pathways are used by bacteria for the biosynthesis of IAA, with the indole-3-pyruvic acid (IPyA) pathway being the most commonly described. In this pathway, the indole-3-pyruvate decarboxylase (ipdC) gene has a vital role in the production of IAA using the amino acid L-tryptophan as a precursor. In this context, molecular studies about the metabolic pathways and the genes involved in this process are preponderant for the understanding of the interrelationship of the regulatory pathways with the phytormonium synthesis. The rhizobacterium Bacillus sp. (RZ2MS9) has been showing satisfactory activity in promoting plant growth. The sequencing of its genome pointed to the presence of a wide range of genes related to growth promotion, especially genes encoding auxins. Thus, the objective of the present study was to verify the function of the ipdC gene in the IAA biosynthesis L-tryptophan dependent through the knockout of the ipdC in the plant growth-promoting rhizobateria (PGPR) Bacillus sp. (RZ2MS9). Therefore, the knockout was realized using the CRISPR-Cas9. The knockout of the ipdC gene was efficient, generating disruptive mutants for the said gene. IAA biosynthesis by the ΔipdC strain showed reductions in phytormonium concentrations, according to the growth time, being 87.96% in 24 hours, 88.25% in 48 hours and 58.27% in 72 hours of growth compared to the Wild Type (WT). In addition, the biosynthesis of IAA in the absence of the amino acid L-tryptophan was also evaluated, with no phytormonium synthesis being observed at any growth time, both in the wild type and ΔipdC strain. The present study pioneered the knockout of the ipdC gene in a Bacillus strain using the CRISPR-Cas9. The results obtained contribute to a better understanding of the influence of the ipdC gene and the IPyA pathway in the IAA biosynthesis through the RZ2MS9 strain, and its role in plant growth promoting will be demonstrated in the future.

Dentre os mecanismos relacionados à interação bactéria-planta, a biossíntese bacteriana de ácido indol acético (AIA) exerce um papel fundamental na promoção do crescimento vegetal, uma vez que é capaz de influenciar inúmeros processos fisiológicos nas plantas. Diferentes vias metabólicas são utilizadas pelas bactérias para a biossíntese do AIA, sendo a via do ácido indol-3-pirúvico (IPyA) a mais comumente descrita. Nesta via encontra-se o gene indol-3-piruvato descarboxilase (ipdC) com vital função na produção de AIA utilizando como precursor o aminoácido L-triptofano. Nesse contexto, estudos moleculares acerca das vias metabólicas e dos genes envolvidos nesse processo são preponderantes para o entendimento da inter-relação das vias regulatórias com a síntese do fitormônio. A rizobactéria Bacillus sp. (RZ2MS9) vem apresentando satisfatória atividade na promoção de crescimento vegetal. O sequenciamento do seu genoma apontou a presença de uma vasta gama de genes relacionados à promoção do crescimento, com destaque para genes codificadores de auxinas. Assim, o estudo teve por objetivo comprovar a função do gene ipdC na biossíntese do AIA pela via dpendente do L-triptofano através do nocaute sítio dirigido do gene ipdC na Rizobactéria Promotora do Crescimento em Plantas (RPCP) Bacillus sp. (RZ2MS9). Para tanto, foi realizado o nocaute sítio dirigido por meio da técnica de CRISPR-Cas9. O nocaute do gene ipdC foi eficiente, gerando mutantes disruptivos para o referido gene. A biossíntese do AIA pela linhagem ΔipdC apresentou reduções nas concentrações do fitormônio, de acordo com o tempo de crescimento, sendo 87,96% em 24 horas, 88,25% em 48 horas e 58,27% em 72 horas do crescimento em comparação à linhagem selvagem (WT). Além disso, a biossíntese do AIA na ausência do aminoácido L-triptofano também foi avaliada, não sendo constatada síntese do fitormônio em nenhum dos tempos crescimento, tanto na linhagem selvagem, quanto na linhagem ΔipdC. O presente estudo foi pioneiro no nocaute do gene ipdC em uma linhagem de Bacillus utilizando a técnica de CRISPR-Cas9. Os resultados obtidos contribuem para um melhor entendimento da influência do gene ipdC e da via IPyA na biossíntese do AIA pela linhagem RZ2MS9 e futuramente sera comprovado seu papel na promoção de crescimento vegetal. / Among the mechanisms related to the bacterium-plant interaction, the bacterial biosynthesis of indole acetic acid (AIA) plays a fundamental role in the promotion of plant growth, since it is capable of influencing innumerable physiological processes in plants. Different metabolic pathways are used by bacteria for the biosynthesis of IAA, with the indole-3-pyruvic acid (IPyA) pathway being the most commonly described. In this pathway, the indole-3-pyruvate decarboxylase (ipdC) gene has a vital role in the production of IAA using the amino acid L-tryptophan as a precursor. In this context, molecular studies about the metabolic pathways and the genes involved in this process are preponderant for the understanding of the interrelationship of the regulatory pathways with the phytormonium synthesis. The rhizobacterium Bacillus sp. (RZ2MS9) has been showing satisfactory activity in promoting plant growth. The sequencing of its genome pointed to the presence of a wide range of genes related to growth promotion, especially genes encoding auxins. Thus, the objective of the present study was to verify the function of the ipdC gene in the IAA biosynthesis L-tryptophan dependent through the knockout of the ipdC in the plant growth-promoting rhizobateria (PGPR) Bacillus sp. (RZ2MS9). Therefore, the knockout was realized using the CRISPR-Cas9. The knockout of the ipdC gene was efficient, generating disruptive mutants for the said gene. IAA biosynthesis by the ΔipdC strain showed reductions in phytormonium concentrations, according to the growth time, being 87.96% in 24 hours, 88.25% in 48 hours and 58.27% in 72 hours of growth compared to the Wild Type (WT). In addition, the biosynthesis of IAA in the absence of the amino acid L-tryptophan was also evaluated, with no phytormonium synthesis being observed at any growth time, both in the wild type and ΔipdC strain. The present study pioneered the knockout of the ipdC gene in a Bacillus strain using the CRISPR-Cas9. The results obtained contribute to a better understanding of the influence of the ipdC gene and the IPyA pathway in the IAA biosynthesis through the RZ2MS9 strain, and its role in plant growth promoting will be demonstrated in the future.

O peso corporal dos animais tende a ser relativamente estável durante longos períodos de tempo. Situações de restrição calórica ou aumento na ingestão de calorias levam a alterações fisiológicas compensatórias que resistem aos efeitos destas perturbações. De fato, o gasto energético aumenta em animais submetidos à dieta hipercalórica, a chamada termogênese facultativa, de modo a manter os estoques energéticos constantes. É possível que defeitos na termogênese facultativa estejam envolvidos no desenvolvimento da obesidade. O BAT, o principal sítio de termogênese facultativa, é ativado pela liberação de NE pelo Sistema Nervoso Simpático, que se liga aos receptores adrenérgicos b1, b2 e b3 expressos nos adipócitos marrons. Diversos estudos demonstram que os receptores b são importantes na proteção contra a obesidade, mas ainda não é claro qual o papel de cada isoforma neste processo. Assim sendo, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel das isoformas b1 e b2 na mediação da termogênese facultativa induzida pela dieta. Para tanto, nós tratamos camundongos com nocaute para o receptor adrenérgico b1 (KOb1) e camundongos com nocaute para o receptor b2 (KOb2) com dieta hipercalórica por 22 semanas. O peso corporal foi medido diariamente e o consumo de oxigênio foi determinado usando-se um sistema de respirometria aberto ao final do experimento. A composição corporal foi determinada pela análise da carcaça. Animais foram expostos ao frio de 4ºC por 4h e sua temperatura corporal foi medida em vários tempos e a resposta térmica do iBAT foi determinada pela infusão de NE ou agonista b adrenérgico. Além disso, foram determinados os níveis de RNAm das isoformas de receptores adrenérgicos b nos animais nocaute. Os resultados obtidos em nosso estudo mostram que os animais KOb1 e KOb2 tratados com dieta hipercalórica não desenvolvem obesidade mais severa do que os animais selvagens mas não são capazes de aumentar o consumo de oxigênio induzido pela dieta, sugerindo que estes receptores não são relevantes na termogênese induzida pela dieta. Por outro lado, nossos dados indicam que a presença do receptor b1 é exigida para termogênese induzida pelo frio, uma vez que os camundongos KOb1 são sensíveis ao frio e a capacidade termogênica do BAT destes animais em reposta à NE é bastante reduzida quando comparados com animais selvagens. A ausência do receptor b2 não piora a resposta dos animais ao frio sugerindo que esta isoforma não esteja envolvida na termogênese induzida pela dieta ou pelo frio. Os nossos achados indicam que a isoforma do receptor adrenérgico b1 é fundamental na termogênese induzida pelo frio, mas não pela dieta. Além disso, é provável que a termogênese induzida pela dieta seja regulada por mecanismos distintos da termogênese induzida pelo frio. / The body weight of animals tends to be relatively stable over long periods of time. Situations of caloric restriction or increase in intake of calories lead to compensatory physiological changes that resist the effects of these disorders. In fact, the energy expenditure increases in animals treated with diet hypercaloric called facultative thermogenesis, in order to keep to energy stock constant. Defects in this facultative thermogenesis may be related to the development of obesity. Brown adipose tissue is the main site of facultative thermogenesis and is activated by signaling of b1, b2 e b3 adrenergic receptors by Norepinephrine released by Sympathetic Nervous System. Several studies showed that the isoforms b of adrenergic receptors are important in mechanisms involved in obesity and also in promoting cold tolerance. Nonetheless, it is unclear the role of each isoform in these process. Therefore, the purpose of our study was to evaluate the role of isoforms b1 and b2 in mediate the facultative thermogenesis. For that, we fed nocaute mice for the adrenergic receptor b1 (KOb1) and nocaute mice for the adrenergic receptor b2 (KOb2) with high fat diet for 22 weeks. During treatment body weight was determined daily. By the end of the experiment oxygen consumption was measured using a system of open respirometry and body composition was determined by analysis of the carcass. We also exposed KOb1 and KOb2 animals to cold (4C). The thermogenic response of iBAT was evaluated through i.v NE infusion. The results obtained in our study showed that the animals KOb1 and KOb2 treated with high fat diet did not gain more fat when compared to wild type animals, but are unable to increase the oxygen consumption, suggesting that these receptors are not relevant in development of obesity. Furthermore, our data indicate that the presence of the b1 receptor is required for cold-induced thermogenesis, since the KOb1 mice are sensitive to cold and BAT thermogenic response is significantly impaired when compared with animals wild type. The absence of b2 receptor does not worsen the response of animals to cold suggesting that this isoform is not involved in the diet- or cold- induced thermogenesis. In conclusion, our findings indicate that the b1 isoform of the adrenergic receptor is critical in the cold-induced thermogenesis, but not in diet induced thermogenesis. Moreover, it is likely that the diet-induced thermogenesis and cold-induced thermogenesis are regulated by different mechanisms.

O peso corporal dos animais tende a ser relativamente estável durante longos períodos de tempo. Situações de restrição calórica ou aumento na ingestão de calorias levam a alterações fisiológicas compensatórias que resistem aos efeitos destas perturbações. De fato, o gasto energético aumenta em animais submetidos à dieta hipercalórica, a chamada termogênese facultativa, de modo a manter os estoques energéticos constantes. É possível que defeitos na termogênese facultativa estejam envolvidos no desenvolvimento da obesidade. O BAT, o principal sítio de termogênese facultativa, é ativado pela liberação de NE pelo Sistema Nervoso Simpático, que se liga aos receptores adrenérgicos b1, b2 e b3 expressos nos adipócitos marrons. Diversos estudos demonstram que os receptores b são importantes na proteção contra a obesidade, mas ainda não é claro qual o papel de cada isoforma neste processo. Assim sendo, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel das isoformas b1 e b2 na mediação da termogênese facultativa induzida pela dieta. Para tanto, nós tratamos camundongos com nocaute para o receptor adrenérgico b1 (KOb1) e camundongos com nocaute para o receptor b2 (KOb2) com dieta hipercalórica por 22 semanas. O peso corporal foi medido diariamente e o consumo de oxigênio foi determinado usando-se um sistema de respirometria aberto ao final do experimento. A composição corporal foi determinada pela análise da carcaça. Animais foram expostos ao frio de 4ºC por 4h e sua temperatura corporal foi medida em vários tempos e a resposta térmica do iBAT foi determinada pela infusão de NE ou agonista b adrenérgico. Além disso, foram determinados os níveis de RNAm das isoformas de receptores adrenérgicos b nos animais nocaute. Os resultados obtidos em nosso estudo mostram que os animais KOb1 e KOb2 tratados com dieta hipercalórica não desenvolvem obesidade mais severa do que os animais selvagens mas não são capazes de aumentar o consumo de oxigênio induzido pela dieta, sugerindo que estes receptores não são relevantes na termogênese induzida pela dieta. Por outro lado, nossos dados indicam que a presença do receptor b1 é exigida para termogênese induzida pelo frio, uma vez que os camundongos KOb1 são sensíveis ao frio e a capacidade termogênica do BAT destes animais em reposta à NE é bastante reduzida quando comparados com animais selvagens. A ausência do receptor b2 não piora a resposta dos animais ao frio sugerindo que esta isoforma não esteja envolvida na termogênese induzida pela dieta ou pelo frio. Os nossos achados indicam que a isoforma do receptor adrenérgico b1 é fundamental na termogênese induzida pelo frio, mas não pela dieta. Além disso, é provável que a termogênese induzida pela dieta seja regulada por mecanismos distintos da termogênese induzida pelo frio. / The body weight of animals tends to be relatively stable over long periods of time. Situations of caloric restriction or increase in intake of calories lead to compensatory physiological changes that resist the effects of these disorders. In fact, the energy expenditure increases in animals treated with diet hypercaloric called facultative thermogenesis, in order to keep to energy stock constant. Defects in this facultative thermogenesis may be related to the development of obesity. Brown adipose tissue is the main site of facultative thermogenesis and is activated by signaling of b1, b2 e b3 adrenergic receptors by Norepinephrine released by Sympathetic Nervous System. Several studies showed that the isoforms b of adrenergic receptors are important in mechanisms involved in obesity and also in promoting cold tolerance. Nonetheless, it is unclear the role of each isoform in these process. Therefore, the purpose of our study was to evaluate the role of isoforms b1 and b2 in mediate the facultative thermogenesis. For that, we fed nocaute mice for the adrenergic receptor b1 (KOb1) and nocaute mice for the adrenergic receptor b2 (KOb2) with high fat diet for 22 weeks. During treatment body weight was determined daily. By the end of the experiment oxygen consumption was measured using a system of open respirometry and body composition was determined by analysis of the carcass. We also exposed KOb1 and KOb2 animals to cold (4C). The thermogenic response of iBAT was evaluated through i.v NE infusion. The results obtained in our study showed that the animals KOb1 and KOb2 treated with high fat diet did not gain more fat when compared to wild type animals, but are unable to increase the oxygen consumption, suggesting that these receptors are not relevant in development of obesity. Furthermore, our data indicate that the presence of the b1 receptor is required for cold-induced thermogenesis, since the KOb1 mice are sensitive to cold and BAT thermogenic response is significantly impaired when compared with animals wild type. The absence of b2 receptor does not worsen the response of animals to cold suggesting that this isoform is not involved in the diet- or cold- induced thermogenesis. In conclusion, our findings indicate that the b1 isoform of the adrenergic receptor is critical in the cold-induced thermogenesis, but not in diet induced thermogenesis. Moreover, it is likely that the diet-induced thermogenesis and cold-induced thermogenesis are regulated by different mechanisms.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-09-26T18:09:59Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vera Lúcia Lima de Almeida - 2017.pdf: 4171276 bytes, checksum: 87f3a46f53c09bbba2b757e69ce2c7d8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: A citação apresenta problemas : Almeida, V. L. L. Papel de citocinas e da leptina na imunopatologia da fase aguda na infecção experimental pelo trypanosoma cruzi em camundongos nocautes para IL-4 e IFN-γ. 2017. 66 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical e Saúde Publica) - Universidade Federal de Goiás,Goiânia,2017. CORRETO: ALMEIDA, V. L. L. Papel de citocinas e da leptina na imunopatologia da fase aguda na infecção experimental pelo trypanosoma cruzi em camundongos nocautes para IL-4 e IFN-γ. 2017. 66 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical e Saúde Publica) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2017. on 2017-09-27T11:28:48Z (GMT) / Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-09-27T17:46:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Vera Lúcia Lima de Almeida - 2017.pdf: 4171276 bytes, checksum: 87f3a46f53c09bbba2b757e69ce2c7d8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-02T13:43:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Vera Lúcia Lima de Almeida - 2017.pdf: 4171276 bytes, checksum: 87f3a46f53c09bbba2b757e69ce2c7d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T13:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Vera Lúcia Lima de Almeida - 2017.pdf: 4171276 bytes, checksum: 87f3a46f53c09bbba2b757e69ce2c7d8 (MD5) Previous issue date: 2017-04-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Chagas disease is a parasitic disease caused by the Protozoan Trypanosoma cruzi. Approximately 30% of infected individuals develop cardiac manifestations. Among the factors involved in this evolution highlights the role of inflammation. Evidence points to an important relationship of adipokines with the cellular immune response and inflammation. The present study is objective is to evaluate the role of cytokines and leptin on immunopathology of acute phase of experimental infection by T. cruzi. For this we used C57Bl/6 WT mice, C57Bl/6 WT KO IFN-γ, Balb-c WT and Balb-c KO IL-4 100 infected with of Colombian strain forms of T. cruzi and non-infected controls was analyzed in the hearts the presence of T. cruzi, fibrosis, inflammatory infiltrate, production of cytokines in situ and serum levels of leptin, TNF-α and IL-10. Noted greater tissue parasitism in C57Bl/6 animals KO IFN-γ, but no difference in the intensity of the inflammatory infiltrate and percentage of fibrosis. Regarding cytokines C57Bl/6 mice IFN-γ KO infected showed increased TNF-α in situ, as well as the Balbc KO IL-4. Despite greater expression in situ, systemically animals Balb-c KO IL-4 have shown to be good producers of TNF-α and IL-10 as well as the C57Bl/6 KO IFNγ. However, these last have shown to be good producers of serum leptin, as well as the Balb-c. Thus, our results indicate that in the absence of IFN-γ mice infected can' not control the tissue parasitism. However, feature increased in situ of TNF-α and serum leptin as a compensatory mechanism of the Th1 response deficiency. / A doença de Chagas é uma doença parasitária causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Aproximadamente 30% dos indivíduos infectados desenvolvem a manifestação cardíaca. Dentre os fatores envolvidos nesta evolução destaca-se o papel da inflamação. Evidências apontam uma importante relação das adipocitocinas com a resposta imune celular e inflamação. O presente estudo objetivou avaliar o papel de citocinas e da leptina na imunopatologia da fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi. Para isso foram utilizados camundongos C57Bl/6 WT, C57Bl/6 KO IFN-γ, Balb-c WT e Balb-c KO IL-4 infectados com 100 formas tripomastigotas de cepa Colombiana de T. cruzi e controles não infectados. Foi analisado nos corações a presença ninhos de T. cruzi, infiltrado inflamatório, fibrose, produção de citocinas in situ e níveis séricos de leptina, TNF-α e IL-10. Foi observado maior parasitismo tissular nos animais C57Bl/6 KO IFN-γ, mas sem diferença na intensidade do infiltrado inflamatório e percentual de fibrose. Em relação as citocinas os camundongos C57Bl/6 KO IFN-γ infectados apresentaram aumento de TNF-α in situ, assim como os Balb-c KO IL-4. Apesar de maior expressão in situ, sistemicamente os animais Balb-c KO IL-4 não mostram ser bons produtores de TNF-α e IL-10 assim como os C57Bl/6 KO IFN-γ, entretanto esses últimos mostraram ser bons produtores de leptina sérica, assim como os Balb-c. Dessa forma, nossos resultados apontam que na ausência de IFN-γ os camundongos infectados não conseguem controlar o parasitismo tissular. Entretanto apresentam aumento in situ de TNF-α e leptina sérica como mecanismo compensatório da deficiência de resposta Th1, representado pela ausência de IFN-γ.

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In 2015, according to WHO, 10.4 million new cases of tuberculosis worldwide have emerged. Currently the commonly used treatments are not effective against the forms of disease resistant to the most effective anti-TB drugs, and drugs with new mechanisms of action are needed. Mycobacterium tuberculosis dihydroneopterin aldolase (MtDHNA /FolB) is a folate enzyme encoded by the folB gene, which has important properties that make it a potential target for the synthesis of new antimicrobial agents. As a first step for target validation in the antimicrobial drug development pipeline, it is important to prove that the gene encoding a putative target is essential for pathogen?s viability. In this study, using site directed mutagenesis, biochemical analyzes and gene knockout experiments, we demonstrated that the folB gene is essential for the survival of Mtb, and furthermore we prove that this essentiality depends on the aldolase/epimerase activities of the MtFolB protein. The wild-type gene (wt) and the point mutants K99A and Y54F were cloned and expressed, and the corresponding recombinant proteins were purified and monitored for the activities of aldolase, epimerase and oxygenase using HPLC. In contrast to the wild-type MtFolB (wt) enzyme, both mutants had neither aldolase nor epimerase activities under the conditions tested. The Y54F mutant maintained oxygenase activity, whereas for the K99A mutant it was possible to detect oxygenase activity only in the presence of HP and GA as substrates. Knockout experiments showed that the folB gene is essential for the survival of Mtb under the conditions tested. However, unlike the wild-type copy, when the sequences encoding the K99A or Y54F mutants were used for complementation, no viable colonies were obtained, indicating that these point mutants could not rescue the cells after the folB knockout. These results indicate that aldolase and/or epimerase activities are crucial for the survival of Mtb. The construction of Mycobacterium tuberculosis folB-GFP fusion (Mtb) strains containing wild-type folB gene sequence or a deleted C-terminal mutant (folB?C), devoid of the sequence presumably necessary for anchoring the enzyme within nanocage compartments, were performed and together with other cell biology methods described in this work will be used for a better understanding of MtDHNA/FolB cellular functions and for the validation of this enzyme as a therapeutic target. / A tuberculose (TB) tornou-se a principal causa mundial de morte por doen?as infecciosas. Em 2015, de acordo com a OMS, surgiram 10,4 milh?es de novos casos de tuberculose no mundo. Atualmente os tratamentos comumente utilizados n?o s?o eficientes contra as formas da doen?a resistentes aos f?rmacos anti-TB mais eficazes, sendo necess?rios f?rmacos com novos mecanismos de a??o. A di-hidroneopterina aldolase de Mycobacterium tuberculosis (MtDHNA/FolB) ? uma enzima da via do folato, codificada pelo gene folB, que apresenta caracter?sticas importantes que a tornam um potencial alvo para s?ntese de novos agentes antimicrobianos. Neste estudo, por meio de mutag?nese s?tio-direcionada, an?lises bioqu?micas e experimentos de nocaute g?nico, demostramos que o gene folB ? essencial para a sobreviv?ncia de Mtb, e al?m disso provamos que essa essencialidade depende das atividades de aldolase/epimerase da prote?na MtFolB. O gene do tipo selvagem (wt) e os mutantes pontuais K99A e Y54F foram clonados e expressos, e as prote?nas recombinantes correspondentes foram purificadas e monitoradas para as atividades de aldolase, epimerase e oxigenase utilizando HPLC. Em contraste com a enzima MtFolB selvagem (wt), ambas as mutantes n?o apresentaram atividade de aldolase nem de epimerase nas condi??es testadas. A mutante Y54F manteve a atividade da oxigenase, enquanto que para a mutante K99A foi poss?vel detectar a atividade de oxigenase apenas na presen?a de HP e GA como substratos. Os experimentos de nocaute mostraram que o gene folB ? essencial para a sobreviv?ncia de Mtb sob as condi??es testadas. Entretanto, diferentemente da c?pia selvagem, quando as sequ?ncias que codificam os mutantes K99A ou Y54F foram utilizadas para complementa??o, n?o foram obtidas col?nias vi?veis, indicando que estes mutantes pontuais n?o poderiam resgatar as c?lulas ap?s o nocaute do gene folB. Esses resultados indicam que as atividades de aldolase e/ou epimerase s?o cruciais para a sobreviv?ncia de Mtb. A constru??o de cepas com fus?o folB-GFP de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que cont?m a sequ?ncia do tipo selvagem do gene folB ou um mutante com o C-terminal deletado (folB?C), desprovida da sequ?ncia supostamente necess?ria para a ancoragem da enzima dentro dos compartimentos de nanocargas, foram realizadas e juntamente com outros m?todos de biologia celular descritos neste trabalho tamb?m poder?o ser utilizados para um melhor entendimento das fun??es celulares apresentadas por MtDHNA/FolB e para valida??o dessa enzima como potencial alvo terap?utico.