Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1529_1.pdf: 841640 bytes, checksum: a1668107b89c5355d88180dbb4cb329e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Objetivando estudar o efeito de isolados de bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) e fungos micorrízicos arbusculares (FMA) foram realizados três experimentos. Primeiramente, bactérias epifíticas e endofíticas foram isoladas de raízes de bananeiras sadias de seis cultivares e caracterizadas quanto à produção de pectinase, celulase, ácido indolacético, β-1,3-glucanase e quitinase. No 1º. experimento, as rizobactérias foram avaliadas quanto à promoção do crescimento de bananeiras micropropagadas cv. Grande Naine em casa de vegetação, sendo 74 tratamentos de bacterização + um tratamento controle, com 8 repetições. Mudas com aproximadamente 10 cm foram transplantadas e bacterizadas em potes contendo 1 kg de solo desinfestado. No 2º. experimento, foi observada a ação antagônica in vitro das RPCP selecionadas, contra Fusarium oxysporum f. sp. cubense. No 3º experimento, em casa de vegetação, foi estudado o efeito da associação RPCP x FMA no desenvolvimento de mudas de bananeiras cv. Grand Naine. Foi aplicado DIC com 7 tratamentos de bacterização com RPCPs (BAN29, BAN36, BAN81, BAN82, S1, S2 e controle) × 3 tratamentos de inoculação com FMAs (Glomus etunicatum, Glomus clarum e controle) × 7 repetições. A inoculação (200 glomerosporos/planta) ocorreu no transplantio das mudas para sacos contendo 1,5 Kg de solo desinfestado. Em seguida, as mudas foram bacterizadas com seis isolados pré-selecionados no Experimento 1. As suspensões bacterianas (50 mL/planta) utilizadas nos experimentos em casa de vegetação foram preparadas e ajustadas em fotocolorímetro (A580) em água destilada esterilizada (ADE) visando obter para 108 UFC/mL. O tratamento controle sem FMA e sem bactérias recebeu ADE. Para o isolamento de bactérias endofíticas foram testados diferentes substâncias desinfestantes e tempos de exposição, com melhor resultado obtido com hipoclorito de cálcio a 5%, por 20 minutos. Foram obtidos 80 isolados bacterianos, com predominância de bactérias epifíticas (53,7%) e de Gram-positivas (67,1%). Nove isolados produziram pectinase, 37 ácido indolacético e dois β-1,3-glucanase. Nenhum dos isolados foi capaz de produzir celulase, ácido cianídrico, quitinase ou solubilizar fosfato. Incrementos no desenvolvimento de mudas micropropagadas de bananeiras cv. Grand Naine foram evidenciados a partir dos 30 dias após bacterização com 40 isolados. Houve incremento de até 82% para a biomassa fresca (BF) da parte aérea e de até 263% para a BF de raízes das mudas associadas com BAN29, BAN36, BAN81, BAN82, S1 e S2 (Experimento 1). A BAN36 foi capaz de inibir o crescimento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. cubense em placas de Petri (até 67%) (Experimento 2). Em geral, a inoculação conjunta RPCP × FMA não proporcionou incremento no crescimento, sendo observada interação positiva apenas entre FMAs e os isolados S1 e S2. Apenas na ausência dos FMAs, as mudas tratadas com BAN29, BAN36, BAN81 e BAN82 diferiram em relação ao controle. Houve estímulo na colonização das raízes de bananeiras por G. clarum quando associadas com BAN82. Isolados bacterianos epifíticos e endofíticos de raízes de bananeiras são capazes de produzir substâncias, in vitro, com potencial uso biotecnológico para promoção do crescimento de mudas micropropagadas de bananeira da cultivar Grand Naine visando o controle de F. oxysporum f. sp. cubense. A interação RPCPs e FMAs demonstrou resultados conflitantes, concluindo-se que o efeito associado depende do isolado específico de cada microrganismo

Dentre os mecanismos relacionados à interação bactéria-planta, a biossíntese bacteriana de ácido indol acético (AIA) exerce um papel fundamental na promoção do crescimento vegetal, uma vez que é capaz de influenciar inúmeros processos fisiológicos nas plantas. Diferentes vias metabólicas são utilizadas pelas bactérias para a biossíntese do AIA, sendo a via do ácido indol-3-pirúvico (IPyA) a mais comumente descrita. Nesta via encontra-se o gene indol-3-piruvato descarboxilase (ipdC) com vital função na produção de AIA utilizando como precursor o aminoácido L-triptofano. Nesse contexto, estudos moleculares acerca das vias metabólicas e dos genes envolvidos nesse processo são preponderantes para o entendimento da inter-relação das vias regulatórias com a síntese do fitormônio. A rizobactéria Bacillus sp. (RZ2MS9) vem apresentando satisfatória atividade na promoção de crescimento vegetal. O sequenciamento do seu genoma apontou a presença de uma vasta gama de genes relacionados à promoção do crescimento, com destaque para genes codificadores de auxinas. Assim, o estudo teve por objetivo comprovar a função do gene ipdC na biossíntese do AIA pela via dpendente do L-triptofano através do nocaute sítio dirigido do gene ipdC na Rizobactéria Promotora do Crescimento em Plantas (RPCP) Bacillus sp. (RZ2MS9). Para tanto, foi realizado o nocaute sítio dirigido por meio da técnica de CRISPR-Cas9. O nocaute do gene ipdC foi eficiente, gerando mutantes disruptivos para o referido gene. A biossíntese do AIA pela linhagem ΔipdC apresentou reduções nas concentrações do fitormônio, de acordo com o tempo de crescimento, sendo 87,96% em 24 horas, 88,25% em 48 horas e 58,27% em 72 horas do crescimento em comparação à linhagem selvagem (WT). Além disso, a biossíntese do AIA na ausência do aminoácido L-triptofano também foi avaliada, não sendo constatada síntese do fitormônio em nenhum dos tempos crescimento, tanto na linhagem selvagem, quanto na linhagem ΔipdC. O presente estudo foi pioneiro no nocaute do gene ipdC em uma linhagem de Bacillus utilizando a técnica de CRISPR-Cas9. Os resultados obtidos contribuem para um melhor entendimento da influência do gene ipdC e da via IPyA na biossíntese do AIA pela linhagem RZ2MS9 e futuramente sera comprovado seu papel na promoção de crescimento vegetal. / Among the mechanisms related to the bacterium-plant interaction, the bacterial biosynthesis of indole acetic acid (AIA) plays a fundamental role in the promotion of plant growth, since it is capable of influencing innumerable physiological processes in plants. Different metabolic pathways are used by bacteria for the biosynthesis of IAA, with the indole-3-pyruvic acid (IPyA) pathway being the most commonly described. In this pathway, the indole-3-pyruvate decarboxylase (ipdC) gene has a vital role in the production of IAA using the amino acid L-tryptophan as a precursor. In this context, molecular studies about the metabolic pathways and the genes involved in this process are preponderant for the understanding of the interrelationship of the regulatory pathways with the phytormonium synthesis. The rhizobacterium Bacillus sp. (RZ2MS9) has been showing satisfactory activity in promoting plant growth. The sequencing of its genome pointed to the presence of a wide range of genes related to growth promotion, especially genes encoding auxins. Thus, the objective of the present study was to verify the function of the ipdC gene in the IAA biosynthesis L-tryptophan dependent through the knockout of the ipdC in the plant growth-promoting rhizobateria (PGPR) Bacillus sp. (RZ2MS9). Therefore, the knockout was realized using the CRISPR-Cas9. The knockout of the ipdC gene was efficient, generating disruptive mutants for the said gene. IAA biosynthesis by the ΔipdC strain showed reductions in phytormonium concentrations, according to the growth time, being 87.96% in 24 hours, 88.25% in 48 hours and 58.27% in 72 hours of growth compared to the Wild Type (WT). In addition, the biosynthesis of IAA in the absence of the amino acid L-tryptophan was also evaluated, with no phytormonium synthesis being observed at any growth time, both in the wild type and ΔipdC strain. The present study pioneered the knockout of the ipdC gene in a Bacillus strain using the CRISPR-Cas9. The results obtained contribute to a better understanding of the influence of the ipdC gene and the IPyA pathway in the IAA biosynthesis through the RZ2MS9 strain, and its role in plant growth promoting will be demonstrated in the future.

Dentre os mecanismos relacionados à interação bactéria-planta, a biossíntese bacteriana de ácido indol acético (AIA) exerce um papel fundamental na promoção do crescimento vegetal, uma vez que é capaz de influenciar inúmeros processos fisiológicos nas plantas. Diferentes vias metabólicas são utilizadas pelas bactérias para a biossíntese do AIA, sendo a via do ácido indol-3-pirúvico (IPyA) a mais comumente descrita. Nesta via encontra-se o gene indol-3-piruvato descarboxilase (ipdC) com vital função na produção de AIA utilizando como precursor o aminoácido L-triptofano. Nesse contexto, estudos moleculares acerca das vias metabólicas e dos genes envolvidos nesse processo são preponderantes para o entendimento da inter-relação das vias regulatórias com a síntese do fitormônio. A rizobactéria Bacillus sp. (RZ2MS9) vem apresentando satisfatória atividade na promoção de crescimento vegetal. O sequenciamento do seu genoma apontou a presença de uma vasta gama de genes relacionados à promoção do crescimento, com destaque para genes codificadores de auxinas. Assim, o estudo teve por objetivo comprovar a função do gene ipdC na biossíntese do AIA pela via dpendente do L-triptofano através do nocaute sítio dirigido do gene ipdC na Rizobactéria Promotora do Crescimento em Plantas (RPCP) Bacillus sp. (RZ2MS9). Para tanto, foi realizado o nocaute sítio dirigido por meio da técnica de CRISPR-Cas9. O nocaute do gene ipdC foi eficiente, gerando mutantes disruptivos para o referido gene. A biossíntese do AIA pela linhagem ΔipdC apresentou reduções nas concentrações do fitormônio, de acordo com o tempo de crescimento, sendo 87,96% em 24 horas, 88,25% em 48 horas e 58,27% em 72 horas do crescimento em comparação à linhagem selvagem (WT). Além disso, a biossíntese do AIA na ausência do aminoácido L-triptofano também foi avaliada, não sendo constatada síntese do fitormônio em nenhum dos tempos crescimento, tanto na linhagem selvagem, quanto na linhagem ΔipdC. O presente estudo foi pioneiro no nocaute do gene ipdC em uma linhagem de Bacillus utilizando a técnica de CRISPR-Cas9. Os resultados obtidos contribuem para um melhor entendimento da influência do gene ipdC e da via IPyA na biossíntese do AIA pela linhagem RZ2MS9 e futuramente sera comprovado seu papel na promoção de crescimento vegetal. / Among the mechanisms related to the bacterium-plant interaction, the bacterial biosynthesis of indole acetic acid (AIA) plays a fundamental role in the promotion of plant growth, since it is capable of influencing innumerable physiological processes in plants. Different metabolic pathways are used by bacteria for the biosynthesis of IAA, with the indole-3-pyruvic acid (IPyA) pathway being the most commonly described. In this pathway, the indole-3-pyruvate decarboxylase (ipdC) gene has a vital role in the production of IAA using the amino acid L-tryptophan as a precursor. In this context, molecular studies about the metabolic pathways and the genes involved in this process are preponderant for the understanding of the interrelationship of the regulatory pathways with the phytormonium synthesis. The rhizobacterium Bacillus sp. (RZ2MS9) has been showing satisfactory activity in promoting plant growth. The sequencing of its genome pointed to the presence of a wide range of genes related to growth promotion, especially genes encoding auxins. Thus, the objective of the present study was to verify the function of the ipdC gene in the IAA biosynthesis L-tryptophan dependent through the knockout of the ipdC in the plant growth-promoting rhizobateria (PGPR) Bacillus sp. (RZ2MS9). Therefore, the knockout was realized using the CRISPR-Cas9. The knockout of the ipdC gene was efficient, generating disruptive mutants for the said gene. IAA biosynthesis by the ΔipdC strain showed reductions in phytormonium concentrations, according to the growth time, being 87.96% in 24 hours, 88.25% in 48 hours and 58.27% in 72 hours of growth compared to the Wild Type (WT). In addition, the biosynthesis of IAA in the absence of the amino acid L-tryptophan was also evaluated, with no phytormonium synthesis being observed at any growth time, both in the wild type and ΔipdC strain. The present study pioneered the knockout of the ipdC gene in a Bacillus strain using the CRISPR-Cas9. The results obtained contribute to a better understanding of the influence of the ipdC gene and the IPyA pathway in the IAA biosynthesis through the RZ2MS9 strain, and its role in plant growth promoting will be demonstrated in the future.

O uso de fertilizantes minerais nas culturas, inclusive no milho, é uma prática agrícola que provoca danos ambientais e prejuízos econômicos. Uma alternativa promissora, visando melhorar a produtividade e reduzir o uso de fertilizantes, é a utilização de microrganismos benéficos associados às plantas, particularmente as rizobactérias promotoras de crescimento. Essas bactérias vivem na rizosfera e são capazes de colonizar diversos tecidos vegetais, beneficiando o desenvolvimento das plantas através de mecanismos de promoção de crescimento. Na busca por alternativas sustentáveis e mais rentáveis, o presente trabalho teve como objetivo isolar, caracterizar, selecionar e monitorar rizobactérias associadas ao guaranazeiro da Amazônia que possuíssem características promotoras de crescimento vegetal para serem usadas como inoculantes em sementes de milho. Amostras de solo rizosférico de cinco plantas de guaranazeiros foram coletadas e foi realizado o isolamento das rizobactérias. A caracterização molecular foi realizada através do sequenciamento do gene 16S rDNA para análise da diversidade microbiana e identificação das linhagens. Avaliou-se a capacidade das linhagens de produzir ácido indol acético (AIA), fixar nitrogênio atmosférico, solubilizar fosfato inorgânico e de produzir sideróforos. A análise da diversidade microbiana indicou semelhança entre a comunidade bacteriana isolada da rizosfera do guaranazeiro e a do milho encontrada na literatura. Foi observada predominância do filo Proteobacteria, sendo em sua maioria representado pelo gênero Burkholderia. Do total das 101 linhagens obtidas, 89% foram capazes de produzir AIA, 23% fixaram nitrogênio atmosférico, 43% solubilizaram fosfato inorgânico e 24% produziram sideróforos. Cinco linhagens foram selecionadas para o ensaio de promoção de crescimento de milho em casa de vegetação, essas foram identificadas pelo sequenciamento completo do gene 16S rDNA e compuseram os tratamentos como segue: RZ2MS9 - Bacillus sp. (T1), RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria (T2) e consórcio (T3) de 5 linhagens (RZ1MS6 - Burkholderia vietnamiensis, RZ1MS11 - Burkholderia sp., RZ2MS9 - Bacillus sp., RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria e RZ4MS18 - Delftia acidovorans). As análises estatísticas comprovaram que as linhagens RZ2MS9 (Bacillus sp.) e RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) foram eficientes como promotoras de crescimento em milho, aumentando a altura cerca de 39 e 33%, respectivamente, em relação ao controle, o peso seco da parte aérea cerca de 236 e 114% e do sistema radicular cerca de 248 e 136%, respectivamente, comparado ao controle não inoculado. A linhagem RZ2MS9 (Bacillus sp.) aumentou o conteúdo de Ca nas plantas inoculadas. Para o monitoramento da colonização da bactéria na planta, a linhagem RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) foi transformada com o plasmídio pCM88 e passou a expressar a proteína GFP, sendo possível observar, por microscopia óptica de fluorescência, que, 12 dias após a inoculação na planta, a bactéria encontra-se concentrada no cilindro central da raiz da mesma de onde pode se inserir em algum vaso condutor e colonizar a planta sistematicamente, o que demonstra que a mesma se comporta como endofítica da planta de milho. Assim, fica evidente a importância da exploração de plantas de clima tropical, como o guaranazeiro, como reservatórios de bactérias com enorme potencial biotecnológico. As bactérias estudadas nesse trabalho tem grande potencial para serem utilizadas futuramente como inoculantes. / The use of mineral fertilizers on agricultural crops, including maize, is a practice that causes environmental damage and economical losses. A promising alternative, to improve productivity and reduce fertilizer use is the use of benefical microrganisms associated with plants, particulary the growth-promoting rhizobacteria. These bacteria live in the rhizosphere and are capable of colonizing different plant tissues, benefiting plant growth through mechanisms of growth promotion. In the search for sustainable and more profitable alternative, this study aimed to isolate, characterize, monitor and select rhizobacteria associated with Amazonian guarana that possessed characteristics of plant growth promoters for use as inoculants in maize seeds. Rhizosphere soil samples from five guarana plants were collected and the isolation of rhizobacteria was performed. Molecular characterization was performed by sequencing the 16S rDNA for analysis of microbial diversity and identification of strains. It was evaluated the ability of strains to produce indole acetic acid (IAA), fix atmospheric nitrogen, solubilize inorganic phosphate and produce siderophores. The analysis of microbial diversity indicated similarity between the bacterial community isolated from the rhizosphere of guarana and that found in the literature to maize. It was observed predominance of Proteobacteria phylum, being mostly represented by the genus Burkholderia. Of the total 101 strains obtained, 89% were able to produce IAA, 23% fixed atmospheric nitrogen, 43% solubilized inorganic phosphate and 24% produced siderophores. Five strains were selected for testing growth promotion of maize under greenhouse conditions; these were identified by complete sequencing of the 16S rDNA and compose the treatments as follows: RZ2MS9 - Bacillus sp. (T1), RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria (T2) and consortium (T3) of 5 strains (RZ1MS6 - Burkholderia vietnamiensis, RZ1MS11 - Burkholderia sp., RZ2MS9 - Bacillus sp., RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria and RZ4MS18 - Delftia acidovorans). Statistical analyzes showed that the strains RZ2MS9 (Bacillus sp.) and RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) were effective as growth promoters in maize, increasing the height about 39 and 33%, respectively, compared to control, shoot dry weight about 236 and 114% and root system about 248 and 136%, respectively, compared to uninoculated control. The strain RZ2MS9 (Bacillus sp.) increased Ca content in inoculated plants. For monitoring of colonization of the bacteria in the plant, the strain RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) was transformed with the plasmid pCM88 and passed to express GFP, being possible to observe by fluorescence microscopy that, 12 days after inoculation on the plant, the bacteria is concentrated in the root central cylinder where the same can be inserted into a vessel conductor and consistently colonize the plant, proving the endophytic life style of this strain during maize interaction. Thus, it is clear the importance of tropical plants, like guarana, as reservoirs of bacteria with great biotechnological potential. The evaluated bacteria accessed in this work have great potential to be used in future as inoculants.

Para alimentar a população mundial crescente é necessário um aumento sustentável na produtividade agrícola. Nesse sentido, Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCPs) têm sido continuamente buscadas para formulações inoculantes por sua capacidade de incremento na produção vegetal aliado ao seu potencial de redução e/ou substituição do uso de fertilizantes minerais, insumos que causam grandes impactos ambientais, na saúde humana e econômicos. A RPCP Bacillus sp. RZ2MS9, um representante da biodiversidade amazônica brasileira, é uma forte candidata a bionoculante por seu efeito benéfico, previamente descrito, em uma ampla gama de culturas, incluindo milho e soja. Essas duas culturas representam mais de 80% da área cultivada com grãos no Brasil, de forma que incrementos relativamente modestos de crescimento e produtividade poderiam gerar ganhos significativos. Membros do gênero Bacillus apresentam vantagem em formulações inoculantes, principalmente devido a sua capacidade de formação de esporos resistentes ao calor e dissecação. Seus modos de ação são diversos, tornando o entendimento da sua interação com plantas bastante desafiador. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou, dentre os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento vegetal, a produção de Ácido Indol Acético (AIA) e sideróforos, solubilização de fosfato e fixação biológica de nitrogênio, in vitro. No presente trabalho, foi buscado um entendimento detalhado dos mecanismos de ação dessa rizobactéria, explorando desde seu genoma até seu desempenho em condições de campo. O draft genômico (genoma parcial) bacteriano foi obtido utilizando a tecnologia de sequenciamento Illumina, o qual possibilitou a detecção de genes envolvidos nos mecanismos potencialmente relacionados ao efeito benéfico dessa bactéria, que vão desde sua formação de esporos, atração por exsudatos radiculares, motilidade e competição na rizosfera até mecanismos de solubilização de fosfato, produção de sideróforos, entre outros. As informações obtidas permitem uma exploração genética desses mecanismos, fornecendo uma oportunidade de maximizar essa interação e, futuramente, favorecer os benefícios em campo. Adicionalmente, foi demonstrado o potencial de quimiotaxia (atração) de RZ2MS9 em direção a raízes de milho. Um estudo filogenético dessa RPCP, utilizando um método de tipagem com o gene pycA (piruvato carboxilase), mostrou que o Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou-se distante do clado altamente monomórfico de B. anthracis, patógeno humano, e se afiliou a um grupo composto por linhagens de B. thuringiensis (Bt) comercializadas como produtos biopesticidas há mais de 60 anos, o que sugere a potencial possibilidade de seu uso seguro no campo. Sabe-se que a maioria, se não todas, atividades fisiológicas das plantas é regulada por fitormônios como a auxina AIA, os quais podem ser sintetizados também por RPCPs. Com mais detalhamento, os genes envolvidos nas vias biossintéticas desse fitormônio foram detectados no draft genômico de RZ2MS9, indicando que sua produção ocorre através da via IPA (Indol-3-Piruvato). Além disso, plantas de tomate anão Micro-Tom (MT) e seu mutante Δdgt, defectivo na sensibilidade a auxinas, foram utilizadas para caracterizar especificamente o efeito do AIA produzido por Bacillus sp. RZ2MS9 na promoção de crescimento vegetal. A aplicação de RZ2MS9 causou inibição no crescimento de raízes primárias, aumento no comprimento de raízes laterais e na área superficial total de raízes de plantas MT, efeitos característicos daqueles proporcionados por auxinas. Esse incremento radicular refletiu, ainda, em aumento da biomassa da parte aérea de plantas MT. Os mesmos efeitos não foram observados em plantas Δdgt, insensíveis a auxinas, indicando que a elicitação de promoção de crescimento em MT por RZ2MS9 ocorre por meio desses fitormônios. Finalmente, foi demonstrado o efeito sobre o desenvolvimento e produtividade de milho e soja da aplicação de Bacillus sp. RZ2MS9 em condições de campo, sendo comparado com o desempenho de bioinoculantes comerciais. No milho, o efeito da inoculação bacteriana foi, ainda, associado à adubação nitrogenada para verificar a possibilidade de redução desses insumos. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou efeitos significativos sobre o desenvolvimento tanto da soja (comparáveis aos efeitos de rizóbios) quanto do milho, os quais, porém, não refletiram em aumento significativo de produtividade em ambas as culturas. No entanto, o potencial dessa rizobactéria é bastante claro pois, com um custo de produção inferior a R$1,00 por hectare, sua inoculação causou incremento de 16 sacas de milho por hectare com redução de 30% na adubação nitrogenada, assim como um incremento de 11 sacas de soja por hectare, ambos comparados ao controle não inoculado. Os resultados apresentados no presente trabalho vão, portanto, de encontro à grande expectativa na obtenção de linhagens microbianas promissoras visando sistemas agrícolas mais sustentáveis. / To feed the growing global population, a sustainable increase of agricultural production and crop yield is required. In this sense, Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) have been continuously sought to inoculant formulation due to their capacity to increase plant yield along with their potential to reduce and/or replace the use of mineral fertilizers, inputs that cause serious impacts on environment, human health and economy. The PGPR Bacillus sp. RZ2MS9, a representative of the Brazilian Amazonian biodiversity, is a great candidate to bioinoculant because of its beneficial effect on a broad range of crops, including maize and soybean. These two crops represent more than 80% of the area planted with grains in Brazil, so relatively modest growth and yield increases could generate significant gains. Bacillus spp. have advantage in inoculant formulations, mainly due to their ability to form heat- and dissecation-resistant spores. Their modes of action are diverse, making the understanding of its interaction with plants quite challenging. Bacillus sp. RZ2MS9 displays, between the mechanisms involved in plant growth, Indole Acetic Acid (IAA) and siderophore production, phosphate solubilization and biological nitrogen fixation, in vitro. In the present work, we seek a detailed understanding of this rhizobacterium mechanisms of action, exploring from its genome to its performance in field conditions. The bacterial draft genome was obtained using Illumina sequencing technology, making possible the detection of genes involved in mechanisms potentially related to the beneficial effect of this bacterium, and range from its spore formation, attraction by root exudates, motility and competition in the rhizosphere to mechanisms of phosphate solubilization, siderophore production, among others. The information obtained allow a genetic exploration of these mechanisms, providing an opportunity to maximize this interaction and, in the future, favor benefits in field. Additionally, it was demonstrated the chemotaxis (attraction) potential of RZ2MS9 towards maize roots. A phylogenetic study of this PGPR, using a typing method with the pycA (pyruvate carboxylase) gene, showed that Bacillus sp. RZ2MS9 was distant from the highly monomorphic clade of B. anthracis, a human pathogen, and affiliated with B. thuringiensis (Bt) strains marketed as biopesticides for more than 60 years, suggesting the potential possibility of its safe use in the field. It is known that most, if not all, physiological activities of plants are regulated by phytormones such as the auxin IAA, which can also be synthesized by PGPRs. With more detail, genes involved in biosynthetic pathways of this phytormone were detected in the RZ2MS9 draft genome, indicating that its production occurs via the IPA (indole-3-pyruvate) pathway. In addition, plants of the dwarf tomato Micro-Tom (MT) and its mutant Δdgt, impaired in auxin sensibility, were used to specifically characterize the effects of IAA produced by Bacillus sp. RZ2MS9 in the plant growth promotion. The inoculation of RZ2MS9 caused inhibition in the primary roots growth, increase in lateral roots length and in roots total surface area of MT plants, characteristic effects of those provided by auxins. This root growth also reflected in an increase of MT plants shoot biomass. The same effects were not observed in Δdgt plants, insensitive to auxins, suggesting that the elicitation of growth promotion in MT by RZ2MS9 occurs through these phytormones. Finally, we demonstrated the effect of inoculation with Bacillus sp. RZ2MS9 on maize and soybean development and productivity under field conditions, being compared with the performance of commercial bioinoculants. In maize, the effect of bacterial inoculation was also associated with nitrogen fertilization to verify the possibility of reducing these inputs. Bacillus sp. RZ2MS9 showed significant effects on the development of both soybean (comparable to the effects of rhizobia) and maize, which, however, did not reflect a significant increase in productivity in both crops. However, the potential of this rhizobacterium is very clear because, with a cost of production of less than R$1.00 per hectare, its inoculation caused an increase of 16 sacks of maize per hectare with a 30% reduction in nitrogen fertilization, as well as an increase of 11 sacks of soybean per hectare, both compared to uninoculated control. The results presented in this study meet the great expectation of obtaining promising microbial strains aiming at more sustainable agricultural systems.

Para alimentar a população mundial crescente é necessário um aumento sustentável na produtividade agrícola. Nesse sentido, Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCPs) têm sido continuamente buscadas para formulações inoculantes por sua capacidade de incremento na produção vegetal aliado ao seu potencial de redução e/ou substituição do uso de fertilizantes minerais, insumos que causam grandes impactos ambientais, na saúde humana e econômicos. A RPCP Bacillus sp. RZ2MS9, um representante da biodiversidade amazônica brasileira, é uma forte candidata a bionoculante por seu efeito benéfico, previamente descrito, em uma ampla gama de culturas, incluindo milho e soja. Essas duas culturas representam mais de 80% da área cultivada com grãos no Brasil, de forma que incrementos relativamente modestos de crescimento e produtividade poderiam gerar ganhos significativos. Membros do gênero Bacillus apresentam vantagem em formulações inoculantes, principalmente devido a sua capacidade de formação de esporos resistentes ao calor e dissecação. Seus modos de ação são diversos, tornando o entendimento da sua interação com plantas bastante desafiador. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou, dentre os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento vegetal, a produção de Ácido Indol Acético (AIA) e sideróforos, solubilização de fosfato e fixação biológica de nitrogênio, in vitro. No presente trabalho, foi buscado um entendimento detalhado dos mecanismos de ação dessa rizobactéria, explorando desde seu genoma até seu desempenho em condições de campo. O draft genômico (genoma parcial) bacteriano foi obtido utilizando a tecnologia de sequenciamento Illumina, o qual possibilitou a detecção de genes envolvidos nos mecanismos potencialmente relacionados ao efeito benéfico dessa bactéria, que vão desde sua formação de esporos, atração por exsudatos radiculares, motilidade e competição na rizosfera até mecanismos de solubilização de fosfato, produção de sideróforos, entre outros. As informações obtidas permitem uma exploração genética desses mecanismos, fornecendo uma oportunidade de maximizar essa interação e, futuramente, favorecer os benefícios em campo. Adicionalmente, foi demonstrado o potencial de quimiotaxia (atração) de RZ2MS9 em direção a raízes de milho. Um estudo filogenético dessa RPCP, utilizando um método de tipagem com o gene pycA (piruvato carboxilase), mostrou que o Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou-se distante do clado altamente monomórfico de B. anthracis, patógeno humano, e se afiliou a um grupo composto por linhagens de B. thuringiensis (Bt) comercializadas como produtos biopesticidas há mais de 60 anos, o que sugere a potencial possibilidade de seu uso seguro no campo. Sabe-se que a maioria, se não todas, atividades fisiológicas das plantas é regulada por fitormônios como a auxina AIA, os quais podem ser sintetizados também por RPCPs. Com mais detalhamento, os genes envolvidos nas vias biossintéticas desse fitormônio foram detectados no draft genômico de RZ2MS9, indicando que sua produção ocorre através da via IPA (Indol-3-Piruvato). Além disso, plantas de tomate anão Micro-Tom (MT) e seu mutante Δdgt, defectivo na sensibilidade a auxinas, foram utilizadas para caracterizar especificamente o efeito do AIA produzido por Bacillus sp. RZ2MS9 na promoção de crescimento vegetal. A aplicação de RZ2MS9 causou inibição no crescimento de raízes primárias, aumento no comprimento de raízes laterais e na área superficial total de raízes de plantas MT, efeitos característicos daqueles proporcionados por auxinas. Esse incremento radicular refletiu, ainda, em aumento da biomassa da parte aérea de plantas MT. Os mesmos efeitos não foram observados em plantas Δdgt, insensíveis a auxinas, indicando que a elicitação de promoção de crescimento em MT por RZ2MS9 ocorre por meio desses fitormônios. Finalmente, foi demonstrado o efeito sobre o desenvolvimento e produtividade de milho e soja da aplicação de Bacillus sp. RZ2MS9 em condições de campo, sendo comparado com o desempenho de bioinoculantes comerciais. No milho, o efeito da inoculação bacteriana foi, ainda, associado à adubação nitrogenada para verificar a possibilidade de redução desses insumos. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou efeitos significativos sobre o desenvolvimento tanto da soja (comparáveis aos efeitos de rizóbios) quanto do milho, os quais, porém, não refletiram em aumento significativo de produtividade em ambas as culturas. No entanto, o potencial dessa rizobactéria é bastante claro pois, com um custo de produção inferior a R$1,00 por hectare, sua inoculação causou incremento de 16 sacas de milho por hectare com redução de 30% na adubação nitrogenada, assim como um incremento de 11 sacas de soja por hectare, ambos comparados ao controle não inoculado. Os resultados apresentados no presente trabalho vão, portanto, de encontro à grande expectativa na obtenção de linhagens microbianas promissoras visando sistemas agrícolas mais sustentáveis. / To feed the growing global population, a sustainable increase of agricultural production and crop yield is required. In this sense, Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) have been continuously sought to inoculant formulation due to their capacity to increase plant yield along with their potential to reduce and/or replace the use of mineral fertilizers, inputs that cause serious impacts on environment, human health and economy. The PGPR Bacillus sp. RZ2MS9, a representative of the Brazilian Amazonian biodiversity, is a great candidate to bioinoculant because of its beneficial effect on a broad range of crops, including maize and soybean. These two crops represent more than 80% of the area planted with grains in Brazil, so relatively modest growth and yield increases could generate significant gains. Bacillus spp. have advantage in inoculant formulations, mainly due to their ability to form heat- and dissecation-resistant spores. Their modes of action are diverse, making the understanding of its interaction with plants quite challenging. Bacillus sp. RZ2MS9 displays, between the mechanisms involved in plant growth, Indole Acetic Acid (IAA) and siderophore production, phosphate solubilization and biological nitrogen fixation, in vitro. In the present work, we seek a detailed understanding of this rhizobacterium mechanisms of action, exploring from its genome to its performance in field conditions. The bacterial draft genome was obtained using Illumina sequencing technology, making possible the detection of genes involved in mechanisms potentially related to the beneficial effect of this bacterium, and range from its spore formation, attraction by root exudates, motility and competition in the rhizosphere to mechanisms of phosphate solubilization, siderophore production, among others. The information obtained allow a genetic exploration of these mechanisms, providing an opportunity to maximize this interaction and, in the future, favor benefits in field. Additionally, it was demonstrated the chemotaxis (attraction) potential of RZ2MS9 towards maize roots. A phylogenetic study of this PGPR, using a typing method with the pycA (pyruvate carboxylase) gene, showed that Bacillus sp. RZ2MS9 was distant from the highly monomorphic clade of B. anthracis, a human pathogen, and affiliated with B. thuringiensis (Bt) strains marketed as biopesticides for more than 60 years, suggesting the potential possibility of its safe use in the field. It is known that most, if not all, physiological activities of plants are regulated by phytormones such as the auxin IAA, which can also be synthesized by PGPRs. With more detail, genes involved in biosynthetic pathways of this phytormone were detected in the RZ2MS9 draft genome, indicating that its production occurs via the IPA (indole-3-pyruvate) pathway. In addition, plants of the dwarf tomato Micro-Tom (MT) and its mutant Δdgt, impaired in auxin sensibility, were used to specifically characterize the effects of IAA produced by Bacillus sp. RZ2MS9 in the plant growth promotion. The inoculation of RZ2MS9 caused inhibition in the primary roots growth, increase in lateral roots length and in roots total surface area of MT plants, characteristic effects of those provided by auxins. This root growth also reflected in an increase of MT plants shoot biomass. The same effects were not observed in Δdgt plants, insensitive to auxins, suggesting that the elicitation of growth promotion in MT by RZ2MS9 occurs through these phytormones. Finally, we demonstrated the effect of inoculation with Bacillus sp. RZ2MS9 on maize and soybean development and productivity under field conditions, being compared with the performance of commercial bioinoculants. In maize, the effect of bacterial inoculation was also associated with nitrogen fertilization to verify the possibility of reducing these inputs. Bacillus sp. RZ2MS9 showed significant effects on the development of both soybean (comparable to the effects of rhizobia) and maize, which, however, did not reflect a significant increase in productivity in both crops. However, the potential of this rhizobacterium is very clear because, with a cost of production of less than R$1.00 per hectare, its inoculation caused an increase of 16 sacks of maize per hectare with a 30% reduction in nitrogen fertilization, as well as an increase of 11 sacks of soybean per hectare, both compared to uninoculated control. The results presented in this study meet the great expectation of obtaining promising microbial strains aiming at more sustainable agricultural systems.

O uso de fertilizantes minerais nas culturas, inclusive no milho, é uma prática agrícola que provoca danos ambientais e prejuízos econômicos. Uma alternativa promissora, visando melhorar a produtividade e reduzir o uso de fertilizantes, é a utilização de microrganismos benéficos associados às plantas, particularmente as rizobactérias promotoras de crescimento. Essas bactérias vivem na rizosfera e são capazes de colonizar diversos tecidos vegetais, beneficiando o desenvolvimento das plantas através de mecanismos de promoção de crescimento. Na busca por alternativas sustentáveis e mais rentáveis, o presente trabalho teve como objetivo isolar, caracterizar, selecionar e monitorar rizobactérias associadas ao guaranazeiro da Amazônia que possuíssem características promotoras de crescimento vegetal para serem usadas como inoculantes em sementes de milho. Amostras de solo rizosférico de cinco plantas de guaranazeiros foram coletadas e foi realizado o isolamento das rizobactérias. A caracterização molecular foi realizada através do sequenciamento do gene 16S rDNA para análise da diversidade microbiana e identificação das linhagens. Avaliou-se a capacidade das linhagens de produzir ácido indol acético (AIA), fixar nitrogênio atmosférico, solubilizar fosfato inorgânico e de produzir sideróforos. A análise da diversidade microbiana indicou semelhança entre a comunidade bacteriana isolada da rizosfera do guaranazeiro e a do milho encontrada na literatura. Foi observada predominância do filo Proteobacteria, sendo em sua maioria representado pelo gênero Burkholderia. Do total das 101 linhagens obtidas, 89% foram capazes de produzir AIA, 23% fixaram nitrogênio atmosférico, 43% solubilizaram fosfato inorgânico e 24% produziram sideróforos. Cinco linhagens foram selecionadas para o ensaio de promoção de crescimento de milho em casa de vegetação, essas foram identificadas pelo sequenciamento completo do gene 16S rDNA e compuseram os tratamentos como segue: RZ2MS9 - Bacillus sp. (T1), RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria (T2) e consórcio (T3) de 5 linhagens (RZ1MS6 - Burkholderia vietnamiensis, RZ1MS11 - Burkholderia sp., RZ2MS9 - Bacillus sp., RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria e RZ4MS18 - Delftia acidovorans). As análises estatísticas comprovaram que as linhagens RZ2MS9 (Bacillus sp.) e RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) foram eficientes como promotoras de crescimento em milho, aumentando a altura cerca de 39 e 33%, respectivamente, em relação ao controle, o peso seco da parte aérea cerca de 236 e 114% e do sistema radicular cerca de 248 e 136%, respectivamente, comparado ao controle não inoculado. A linhagem RZ2MS9 (Bacillus sp.) aumentou o conteúdo de Ca nas plantas inoculadas. Para o monitoramento da colonização da bactéria na planta, a linhagem RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) foi transformada com o plasmídio pCM88 e passou a expressar a proteína GFP, sendo possível observar, por microscopia óptica de fluorescência, que, 12 dias após a inoculação na planta, a bactéria encontra-se concentrada no cilindro central da raiz da mesma de onde pode se inserir em algum vaso condutor e colonizar a planta sistematicamente, o que demonstra que a mesma se comporta como endofítica da planta de milho. Assim, fica evidente a importância da exploração de plantas de clima tropical, como o guaranazeiro, como reservatórios de bactérias com enorme potencial biotecnológico. As bactérias estudadas nesse trabalho tem grande potencial para serem utilizadas futuramente como inoculantes. / The use of mineral fertilizers on agricultural crops, including maize, is a practice that causes environmental damage and economical losses. A promising alternative, to improve productivity and reduce fertilizer use is the use of benefical microrganisms associated with plants, particulary the growth-promoting rhizobacteria. These bacteria live in the rhizosphere and are capable of colonizing different plant tissues, benefiting plant growth through mechanisms of growth promotion. In the search for sustainable and more profitable alternative, this study aimed to isolate, characterize, monitor and select rhizobacteria associated with Amazonian guarana that possessed characteristics of plant growth promoters for use as inoculants in maize seeds. Rhizosphere soil samples from five guarana plants were collected and the isolation of rhizobacteria was performed. Molecular characterization was performed by sequencing the 16S rDNA for analysis of microbial diversity and identification of strains. It was evaluated the ability of strains to produce indole acetic acid (IAA), fix atmospheric nitrogen, solubilize inorganic phosphate and produce siderophores. The analysis of microbial diversity indicated similarity between the bacterial community isolated from the rhizosphere of guarana and that found in the literature to maize. It was observed predominance of Proteobacteria phylum, being mostly represented by the genus Burkholderia. Of the total 101 strains obtained, 89% were able to produce IAA, 23% fixed atmospheric nitrogen, 43% solubilized inorganic phosphate and 24% produced siderophores. Five strains were selected for testing growth promotion of maize under greenhouse conditions; these were identified by complete sequencing of the 16S rDNA and compose the treatments as follows: RZ2MS9 - Bacillus sp. (T1), RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria (T2) and consortium (T3) of 5 strains (RZ1MS6 - Burkholderia vietnamiensis, RZ1MS11 - Burkholderia sp., RZ2MS9 - Bacillus sp., RZ2MS16 - Burkholderia ambifaria and RZ4MS18 - Delftia acidovorans). Statistical analyzes showed that the strains RZ2MS9 (Bacillus sp.) and RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) were effective as growth promoters in maize, increasing the height about 39 and 33%, respectively, compared to control, shoot dry weight about 236 and 114% and root system about 248 and 136%, respectively, compared to uninoculated control. The strain RZ2MS9 (Bacillus sp.) increased Ca content in inoculated plants. For monitoring of colonization of the bacteria in the plant, the strain RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) was transformed with the plasmid pCM88 and passed to express GFP, being possible to observe by fluorescence microscopy that, 12 days after inoculation on the plant, the bacteria is concentrated in the root central cylinder where the same can be inserted into a vessel conductor and consistently colonize the plant, proving the endophytic life style of this strain during maize interaction. Thus, it is clear the importance of tropical plants, like guarana, as reservoirs of bacteria with great biotechnological potential. The evaluated bacteria accessed in this work have great potential to be used in future as inoculants.

In the current agriculture is essential to adopt management strategies, low environmental impact. In this context, the environment comprising plant roots is of utmost importance, since they are in constant contact with microorganisms such as growth promoting rhizobacteria (RPCPs), known to affect the metabolism and resistance of plants, may help them dealing with biotic and abiotic stresses via promotion of growth, induced resistance, production of phytohormones compounds, volatile organic compounds (VOCs) and ability to fix nitrogen. Studies of associative rhizobacteria led to discovery of Azospirillum genus isolated in grasses and cereals grown in several countries of tropical and temperate. Regarding endophytic microorganisms G. diazotrophicus is a Gram-negative bacteria, obligatory aerobic and non-spore forming isolated initially from sugar cane in Brazil. This study was based on the assumption that the RPCPs can change the resistance of plants to insect herbivores, and to evaluate the influence of the joint action of two strains of RPCPs (Gluconacetobacter diazotrophicus and Azospirillum sp) in metabolome of plant cane -Sugar variety SP 79-1011 but also in plant defense mechanism herbivory by Diatraea saccharalis. The metabolites present in higher concentration both in inoculated plants as on control plants were identified by analysis metaolomica by the NMR technique. Compounds identified in higher concentration in inoculated plants were carbohydrates, aromatic compounds, amino acids and organic acids. In control plants and amino compounds were inetrmediarios Krebs cycle. Changes in the volatile organic compounds VOCs profile were identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Qualitative and quantitative changes have occurred in the overall volatile profile emitted by plants inoculated as compared to the profile of volatile issued by the control plants, which could be contributing to preference Diatraea saccharalis the control plants from the plants inoculated in bioassay chance choice. VOCs present changes in the profile of infested plants with Diatraea saccharalis. Bioassay no choice there was no significant difference in saccharalis Diatraea weight gain fed control or inoculated plants. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na agricultura atual é essencial a adoção de estratégias de manejo, de baixo impacto ambiental. Nesse contexto o ambiente que engloba as raízes das plantas é de extrema importância, uma vez que ela está em constante contato com microrganismos tais como rizobactérias promotoras do crescimento (RPCPs), conhecidos por afetar o metabolismo e a resistência das plantas, podendo ajuda-las a lidar com estresses bióticos e abióticos via promoção de crescimento, resistência induzida, produção de compostos fitohormonios, compostos orgânicos voláteis (COVs) e capacidade de fixar nitrogênio. Estudos com as rizobactérias associativas levaram a descoberta do gênero Azospirillum, isolado em gramíneas forrageiras e cereais cultivados em diversos países de clima tropical e temperado. Em relação aos microrganismos endofíticos G. diazotrophicus é uma bactéria Gram-negativa, aeróbica obrigatória e não-formadora de esporos isolada inicialmente a partir de cana-de-açúcar no Brasil. O presente estudo foi embasado na hipótese de que as RPCPs podem alterar a resistência de plantas a insetos herbívoros, tendo como objetivo avaliar a influencia da ação conjunta de duas estirpes de RPCPs (Gluconacetobacter diazotrophicus e Azospirillum sp) no metaboloma de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP 79-1011 como também nos mecanismo de defesa da planta a herbivoria por Diatraea saccharalis. Os metabólitos presentes em maior concentração tanto em plantas inoculadas quanto em plantas do controle foram identificados por análise metaolômica pela técnica de RMN. Os compostos identificados em maior concentração nas plantas inoculadas foram carboidratos, compostos aromáticos, aminoácidos e ácidos orgânicos. Nas plantas do controle os compostos foram aminoácido e inetrmediários do ciclo de Krebs. Alterações no perfil de compostos orgânicos voláteis COVs foram identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Alterações qualitativas e quantitativas ocorreram no perfil geral de voláteis emitidos pelas plantas inoculadas quando comparado ao perfil de voláteis emitido pelas plantas do controle, fato que poderia estar contribuindo para preferência de Diatraea saccharalis pelas plantas do controle em relação as plantas inoculadas no bioensaio com chance de escolha. Ocorreu alteração no perfil de COVs de plantas infestadas com Diatraea saccharalis. No bioensaio sem chance de escolha não se observou diferença significativa no ganho de peso de Diatraea saccharalis alimentadas com plantas do controle ou inoculadas.