Nous avons étudié un nouveau varant d'épissage de ERa, nommé ERa36 et son implication dans la signalisation non génomique des œstrogènes. Contrairement à ERa, ce variant a une localisation majoritairement cytoplasmique et membranaire. Il possède une partie C-Terminale unique due à l'épissage alternatif. Nous avons découvert que le domaine C-Termonal de ERa36 contient un D-Domain, qui lui confère la capacité de se lier directement avec des protéines de la famille MAPK. En utilisant des approches in-vitro et in-cellulo, nous avons démontré que ERa36 se lie spécifiquement à la kinase ERK2 en réponse d'une stimulation ostrogénique ou anti-ostrogénique. Nous avons démontré que ERK2 lié à ERa36 lui conférait une résistance à la déphosphorylation par la phosphatase MKP3, conduisant ainsi à une activation soutenue de la voir ERK. Ce mécanisme a des effets profonds sur les cibles de ERK. En effet, l'inhibition pharmacologique de l'interaction ERa36/ERK2 diminue la phosphorylation de la Paxilline, qui a son tour conduit à une répression de la Cycline D1. En plus de ces observations, nous avons démontré, en étudiant l'expression de ERa36 par IHC dans 175 tumeurs de sein, que son expression était un facteur prédictif de métastases à distance et conduit à une diminution de la survie globale. Ce travail pourrait amener à dire que l'expression de ERa36 constitue un nouveau biomarqueur dans le cancer du sein / We study a novel splice variant of ERa, named ERa36, and its involvement in estrogen non genomic signaling. Unlike ERa, this variant has main cytoplasmic/plasma membrane localization and alternative splicing confers it with a unique, previously unidentified C-terminal domain. Interestingly, we found that ERa36 C-terminal domain contains a putative MAPK binding D-Domain for the serine/threonine kinase ERK2. This domain is a docking site for members of the MAPK family. Coupling in-vitro and in-cellulo approaches, we demonstrated that ERa36 binds specifically to ERK2 following estrogen, as well as clinical anti-estrogen (tamoxifen) stimulation.We demonstrated that ERa36 binding to ERK2 inhibits the latter’s dephosphorylation by the dual phosphatase MKP3, thereby leading to a sustained ERK activation. This mechanism had profound effects on ERK’s downstream molecular targets. In fact, pharmacological inhibition of the ERa36/ERK2 interaction abrogated the phosphorylation of Paxillin, which in turn led to a downregulation of CyclinD1 transcription.Futhermore, IHC analysis of ERa36 expression in 175 patient breast tumors revealed that its expression constituted an independent predictor of distant metastasis and influenced on overall survival. In conclusion, ERa36 expression could constitute a new biomarker in breast cancer

Le cancer du sein représente une cause de mortalité élevée chez la femme. Le cancer du sein est un cancer hormono-dépendant. De ce fait, il est extrêmement important de définir le rôle joué par les différents acteurs protéiques de la signalisation hormonale, notamment la signalisation œstrogénique. Parallèlement aux effets nucléaires de ERa où l'hormone lie le récepteur nucléaire et régule la transcription génique, il existe une voie dite non génomique. L'équipe a montré que les œstrogènes induisent la méthylation de ERa, qui est un prérequis au recrutement de la Pl3K et de la tyrosine kinase Src, conduisant à l'activation de molécules de signalisation telles que les MAPK et Akt, induisant prolifération et survie cellulaire. Durant ma thèse, j'ai pu démontrer que le complexe mERa/Src/Pl3K existe in vivo et constitue un nouveau biomarqueur indépendant de mauvais pronostique. La recherche de nouveaux partenaires du complexe mERa/Src/Pl3K nous a permis d'identifier le suppresseur de tumeur LKB1 et l'arginine déméthylase JMJD6. De façon surprenante, l'étude de l'expression de LKB1 par immunohistochimie dans une cohorte de tumeurs mammaires a montré une dualité fonctionnelle selon sa localisation subcellulaire. De plus, nous avons démontré que JMJD6 s'associe à ERa méthylé lorsque le récepteur est complexé à Src et Pl3K, et permet ainsi la déméthylation de ERa et la dissociation du complexe mERa/Src/Pl3K. Ce travail a ainsi pu mettre en évidence que les différents acteurs de cette signalisation peuvent constituer des éléments clés au diagnostique mais également lors de la décision thérapeutique, puisque qu'il existe des drogues peuvant cibler cette voie de signalisation / Estrogen receptor a {ERa}, belonging to the superfamily of hormone nuclear receptors, regulates many physiological processes, notably the growth and survival of breast tumor cells, acting as a ligand-dependent transcription factor. Besides to the well described transcriptional effects, estrogen also mediate extranuclear events called non genomic signaling via its receptor. /n fact, team shows that ERa is methylated and that this event is a prerequisite for the recrutement of Src and P/3K and the activation of Akt which orchestrate cell proliferation and survival. During my PhD, / demonstrated that the non genomic signaling complex mERa/Src/P/3K exists in vivo and is operative. /n addition, the complex is found to be an independent prognostic factor for disease free survival. This is an emergent concept that estrogen non genomic pathway is operative in vivo and can constitute a new therapeutic targets. The search for new partners of the complex has allowed us to identify the tumor suppressor LKB1 and arginine demethylase JMJD6. Expression of LKB1 in immunohistochemistry revealed dual properties based on its subcellular localization. When LKB1 is complexed with mERa/Src/P/3K it may acquire oncogenic properties. /n addition, JMJD6 interacts with methylated ERa when the receptor is associated with Src and P/3K, and allows the demethylation of ERa and the dissociation of the complex mERa/Src/P/3K. This work showed that estrogenic non genomic players can constitute new therapeutic targets in Breast tumors

Le développement et l’homéostasie cellulaire de la prostate impliquent le contrôle strict des voies de signalisation induites par les androgènes et les facteurs de croissance. Ces diverses voies sont profondément altérées dans le cancer de la prostate, notamment lors des stades les plus avancés. Dans ce travail, une lignée immortalisée à partir de l’épithélium de prostate humaine, la lignée RWPE-1, a été utilisée pour étudier certains signaux régulant la prolifération cellulaire, ainsi que les connexions entre les voies de signalisation correspondantes. La prolifération des cellules RWPE-1 est sous la dépendance de l’EGF (Epidermal Growth Factor) qui intervient physiologiquement dans le développement épithélial. Les récepteurs apparentés à l’EGF-R sont également impliqués dans la prolifération au cours de la progression tumorale. La prolifération des cellules RWPE-1 en réponse à l’EGF est strictement dépendante de la voie ERK1/2, qui est donc considérée comme un point d’intégration des signaux. L’utilisation d’inhibiteurs du récepteur aux androgènes a permis de montrer le rôle essentiel qu’il joue dans l’activation d’ERK1/2 en réponse à l’EGF. Le récepteur aux androgènes s’associe avec plusieurs molécules de signalisation dans les cellules RWPE-1. Je démontre ici pour la première fois une association entre le récepteur aux androgènes et la kinase Raf-1, activatrice de la voie ERK1/2. Ainsi, le récepteur aux androgènes contrôlerait directement un processus essentiel à la prolifération épithéliale selon un mode d’action non-génomique. Par ailleurs, j’ai montré que la réponse proliférative des cellules RWPE-1 à l’IL-6 requiert l’activation de la voie ERK1/2, et l’activité kinase de l’EGF-R, suggérant la transactivation de ce récepteur par l’IL-6. L’utilisation de divers inhibiteurs chimiques a permis de démontrer que les métalloprotéases de la famille ADAM (a disintegrin and metalloprotease), notamment ADAM17, sont impliquées dans ce processus. Ainsi, l’activation de protéines ADAM par l’IL-6 conduirait au clivage d’un ligand membranaire de l’EGF-R, aboutissant à l’activation de la voie ERK1/2. Ce nouveau mécanisme pourrait être impliqué dans les situations inflammatoires conduisant à une prolifération excessive de l’épithélium prostatique, prélude à la transformation tumorale. En conclusion, les voies de signalisation étudiées sont fortement connectées dans les cellules épithéliales normales. Les deux nouveaux mécanismes décrits ici aboutissent à l’activation des kinases ERK1/2, point d’intégration et de convergence des voies de signalisation dans les cellules épithéliales de prostate normale. / Prostate development and cell homeostasis involve strict control of androgen and growth factors induced signaling pathways. These signaling pathways are deeply altered in prostate cancer, especially during late stages. In this work, the RWPE-1 immortalized cell line derived from human prostate epithelium has been used to study the signaling pathways regulating cell proliferation and their crosstalk. Optimal RWPE-1 proliferation is dependent on EGF (Epidermal Growth Factor), that also controls normal epithelial development. EGF-R family is also involved in cancer cell proliferation. EGF-dependent RWPE- 1 cell proliferation relies strictly on the ERK1/2 pathway which is then seen as a signal integrating node. Specific inhibitors showed essential role of androgen receptor in EGF mediated ERK1/2 activation. Androgen receptor is associated with several signaling molecules in RWPE-1 cells. I show here for the first time the physical interaction between the androgen receptor and the ERK1/2 activating kinase Raf1. Then, the androgen receptor could directly regulate an essential pathway for epithelial cells proliferation through a non-genomic mechanism. In addition, I showed that IL-6 dependent RWPE-1 cells proliferation requires both ERK1/2 and EGF-R kinase activities, suggesting an IL-6 mediated transactivation of EGF-R. By using several inhibitors, I showed that ADAM (a disintegrin and metalloprotease) family metaloproteases, especialy ADAM17, are involved in this process. IL-6-mediated ADAM proteins activation could lead to the cleavage of a membrane bound EGF-R ligand, leading to ERK1/2 pathway activation. This new mechanism could be involved in the inflammatory situations inducing hyperproliferation of the prostate epithelium, the first step of the transformation process. To conclude, the signaling pathways I studied are strongly connected in normal epithelial cells. The two new mechanisms described in this study lead to ERK1/2 kinases activation, an integrating node of signaling pathways in normal prostate epithelial cells.