Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die methodischen Aspekte bei der Entwicklung mechanischer Simulationen zur Messung der Funktionalitäten von Handballschuhen systematisch zu untersuchen und aus den Ergebnissen allgemeingültige Aussagen zum Abstraktionsgrad abzuleiten. Die Untersuchungen der vier methodischen Aspekte Messgerät, Auswertemodell, Einfluss- und Eingangsgröße haben ergeben, dass insgesamt drei Aspekte einen Einfluss auf den Messwert hatten. Mit Ausnahme der Ergebnisse zum Aspekt Eingangsgröße besaßen die untersuchten methodischen Aspekte jeweils einen Einfluss auf den Messwert. Anhand der Ergebnisse konnte abgeleitet werden, dass der Abstraktionsgrad einen Einfluss auf die Messwerte besitzt. / The aim of the current work was to investigate systematically the methodological aspects used in the development of mechanical simulations, which are capable of measuring the functionalities of handball shoes, and to derive general conclusions about the proper degree of abstraction from the results. The investigations of the four methodological aspects, namely measuring instrument, evaluation model, influence quantity and input quantity, have shown that three aspects had an influence on the measurand. Except for the results on the aspect of input quantity, each of the examined methodological aspects had an influence on the measurand. Based on the results, it could be deduced that the degree of abstraction has an influence on the measurand.

Tesis por compendio / [ES] Esta tesis doctoral pretende aportar conocimientos fundamentales y prácticos sobre la valorización de las algas pardas. Se ha tratado de comprender la relación entre la estructura y funcionalidad de sus polisacáridos y proteínas, considerando sus propiedades funcionales, tecnológicas y bioactivas. Todo ello se ha abordado desde una perspectiva de biorrefinería, enfocada a la economía circular y la sostenibilidad. En primer lugar, se ha llevado a cabo una optimización para la extracción de compuestos valiosos a partir de algas pardas utilizando diversas tecnologías innovadoras. Se investigó un pretratamiento a alta presión de algas pardas (A. nodosum y S. latissima) para extraer alginato y se comparó con el método de extracción convencional. El objetivo era comprender cómo las diferencias iniciales en la composición y estructura de la pared celular de las algas afectaban a la extracción de este polisacárido y a sus propiedades tecnológicas, así como, su capacidad como emulsionante y gelificante. Asimismo, se examinó la extracción de conjugados proteína-polisacárido mediante la aplicación secuencial de varios métodos de extracción, así como sus propiedades funcionales (capacidad de retención de agua y aceite, emulsionante) y bioactivas (actividad antioxidante y capacidad antihipertensiva). En estos estudios se observaron diferencias en la arquitectura de la pared celular de las algas, pertenecientes a distintos órdenes, como Fucales y Laminariales, que influyeron directamente en los compuestos extraídos y en sus propiedades estructurales y tecnológicas. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, los resultados mostraron el potencial de los compuestos extraídos como ingredientes en la industria alimentaria y farmacéutica. La segunda sección de esta tesis exploró la valorización de los subproductos generados durante la extracción del alginato. Se realizó un estudio exhaustivo de todas las fracciones y subproductos producidos en este proceso con el objetivo de identificar las fracciones más prometedoras para su valorización. Los resultados mostraron que los residuos sólidos tenían el potencial más significativo debido a su composición fisicoquímica. Por lo tanto, se sugirieron posibles estrategias para valorizar estos residuos, destacando su alto potencial como ingredientes bioactivos, texturizantes o de valor añadido nutricional para aplicaciones alimentarias, de piensos, cosméticos y farmacéuticos. Además, a partir de este trabajo, se investigó la extracción secuencial y combinada por diferentes métodos para recuperar la mayor cantidad posible de proteína intracelular de estos residuos sólidos. Se comprobó que la fracción proteica de los extractos contenía un alto porcentaje de aminoácidos esenciales, adecuadas propiedades funcionales y una interesante actividad antihipertensiva. Finalmente, la tercera parte de esta tesis se centró en la generación de conocimiento a través de la elucidación estructural del alginato. Para ello, se desarrolló un método rápido para determinar la relación M/G del alginato, que mostró valores cercanos al método de referencia (1H NMR), demostrando su precisión. En conjunto, esta tesis doctoral representa un avance significativo en la generación de conocimiento y valorización de la biomasa algal y sus residuos en compuestos de alto valor. Además, estos enfoques son potencialmente aplicables a otras biomasas algales. / [CA] Esta tesi doctoral pretén aportar coneixements fonamentals i pràctics sobre la valorització de les algues marrons. S'ha tractat de comprendre la relació entre l'estructura i funcionalitat dels seus polisacàrids i proteïnes, considerant les seues propietats funcionals, tecnològiques i bioactivas. Tot això s'ha abordat des d'una perspectiva de biorrefinería, enfocada a l'economia circular i la sostenibilitat. En primer lloc, s'ha dut a terme una optimització per a l'extracció de compostos valuosos a partir d'algues marrons utilitzant diverses tecnologies innovadores. Es va investigar un pretractament a alta pressió d'algues marrons (A. nodosum i S. latissima) per a extraure alginat i es va comparar amb el mètode d'extracció convencional. L'objectiu era comprendre com les diferències inicials en la composició i estructura de la paret cel·lular de les algues afectaven l'extracció d'este polisacàrid i a les seues propietats tecnològiques, així com, la seua capacitat com a emulsionant i gelificant. Així mateix, es va examinar l'extracció de conjugats proteïna-polisacàrid mitjançant l'aplicació seqüencial de diversos mètodes d'extracció, així com les seues propietats funcionals (capacitat de retenció d'aigua i oli, emulsionant) i bioactivas (activitat antioxidant i capacitat antihipertensiva). En estos estudis es van observar diferències en l'arquitectura de la paret cel·lular de les algues, pertanyents a diferents ordes, com Fucales i Laminariales, que van influir directament en els compostos extrets i en les seues propietats estructurals i tecnològiques. No obstant això, malgrat estes diferències, els resultats van mostrar el potencial dels compostos extrets com a ingredients en la indústria alimentària i farmacèutica. La segona secció d'esta tesi va explorar la valorització dels subproductes generats durant l'extracció de l'alginat. Es va realitzar un estudi exhaustiu de totes les fraccions i subproductes produïts en este procés amb l'objectiu d'identificar les fraccions més prometedores per a la seua valorització. Els resultats van mostrar que els residus sòlids tenien el potencial més significatiu a causa de la seua composició fisicoquímica. Per tant, es van suggerir possibles estratègies per a valorar estos residus, destacant el seu alt potencial com a ingredients *bioactivos, texturitzants o de valor afegit nutricional per a aplicacions alimentàries, de pinsos, cosmètics i farmacèutics. A més, a partir d'este treball, es va investigar l'extracció seqüencial i combinada per diferents mètodes per a recuperar la major quantitat possible de proteïna intracel·lular d'estos residus sòlids. Es va comprovar que la fracció proteica dels extractes contenia un alt percentatge d'aminoàcids essencials, adequades propietats funcionals i una interessant activitat antihipertensiva. Finalment, la tercera part d'esta tesi es va centrar en la generació de coneixement a través de l'elucidació estructural de l'alginat. Per a això, es va desenvolupar un mètode ràpid per a determinar la relació M/G de l'alginat, que va mostrar valors pròxims al mètode de referència (1H NMR), demostrant la seua precisió. En conjunt, esta tesi doctoral representa un avanç significatiu en la generació de coneixement i valorització de la biomassa algal i els seus residus en compostos d'alt valor. A més, estos enfocaments són potencialment aplicables a altres biomasses algals. / [EN] This doctoral thesis aims to provide fundamental and practical knowledge on the valorization of brown seaweeds. It has sought to understand the relationship between the structure and functionality of their polysaccharides and proteins, considering their functional, technological and bioactive properties. All this has been approached from a biorefinery perspective, focused on circular economy and sustainability. First, an optimization for extracting valuable compounds from brown seaweeds was carried out using various innovative technologies. A high-pressure pre-treatment of brown seaweeds (Ascophyllum nodosum and Saccharina latissima) to extract alginate was investigated and compared with the conventional extraction method. The purpose was to understand how initial differences in algal cell wall composition and structure affected the extraction of this polysaccharide and its technological properties, such as its ability as emulsifier and gelling agent. Likewise, the extraction of protein-polysaccharide conjugates was examined by sequential application of several extraction methods, as well as their functional properties (water, oil retention activity and emulsifying capacity) and bioactive properties (antioxidant activity and antihypertensive capacity). In these studies, differences were observed in the cell wall architecture of the algae, belonging to different orders, such as Fucales and Laminariales, which directly influenced the extracted compounds and their structural and technological properties. However, despite these differences, the results showed the potential of the extracted compounds as ingredients in the food and pharmaceutical industries. The second section of this thesis explored the valorization of by-products generated during alginate extraction. An exhaustive study of all the fractions and by-products produced in this process was carried out to identify the most promising fractions for valorization. The results showed that solid wastes had the most significant potential due to their physicochemical composition. Therefore, possible strategies to valorize these wastes were suggested, highlighting their high potential as bioactive, texturizing, or nutritional value-added ingredients for food, feed, cosmetic, and pharmaceutical applications. Besides, from this work, sequential and combined extraction by different methods was investigated to recover as much intracellular protein as possible from these solid wastes. It was found that the protein fraction of the extracts contained a high percentage of essential amino acids, adequate functional properties, and an interesting antihypertensive activity. Finally, the third part of this thesis focused on generating knowledge through the structural elucidation of alginate. For this purpose, a rapid method was developed to determine the M/G ratio of alginate, which showed values close to the reference method (1H NMR), demonstrating its accuracy. Overall, this PhD thesis represents a significant advance in generating knowledge and valorizing algal biomass and its residues into high-value compounds. Furthermore, these approaches are potentially applicable to other algal biomasses. / The authors wish to acknowledge funds from the grants PID2022- 138328OB-C21 and CEX2021-001189-S funded by MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 and by “ERDF A way of making Europe” and the project CIRCALGAE (Horizon Europe) under grant agreement 101060607. H. Bojorges acknowledges financial support from the Generalitat Valenciana for the award of a Santiago Grisolía grant (GRISOLIAP/2019/007). The authors acknowledge funds from the project PID2020-117744RJ-I00 and the project CIRCALGAE (Horizon Europe) under grant agreement 101060607. Additionally, the Accreditation as Center of Excellence Severo Ochoa CEX2021-001189-S funded by MCIN/AEI / 10.13039/501100011033 is also fully acknowledged. H. Bojorges expresses gratitude for the financial assistance provided by the Generalitat Valenciana in the form of a Santiago Grisolía grant (GRISOLIAP/2019/007) / Bojorges Gutiérrez, H. (2024). Biorefinery of the relevant brown algae Saccharina latissima and Ascophylum nodosum towards novel, sustainable and functional ingredients [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/211317 / Compendio

Regular starches contain two principal types of glucan polymers: amylopectin and amylose. The structure of amylopectin is characterized according to the unit chain length profile and the nature of the branching pattern, which determine the alignment of glucan chains during biosynthesis. The organization of glucan chains in amylopectin and their impact on the structure of starch are still open to debate. The location of amylose and its exact contribution to the assembly of crystalline lamellae in regular and high-amylose starch granules also remain unknown. The primary focus of this thesis is the organization and flexibility of glucan chains in crystalline lamellae. The organization and flexibility of glucan chains in native, annealed (ANN), and heat-moisture treated (HMT) normal, waxy, hylon V, hylon VII, and hylon VIII corn starches were examined. This study has shown for the first time that increased amounts of apparent amylose in B-type starches hinder the polymorphic transition (from B to A+B) during HMT. The research has also demonstrated that an iodine-glucan complex transformed the B-type polymorphic pattern of hylon starches into a V-type pattern. The differential scanning calorimetry (DSC) results showed that ANN- and HMT-induced changes were most pronounced in hylon starches. These findings suggest that the glucan tie chains influences the assembly of crystalline lamellae in high-amylose starches. The relationship between the internal unit chain composition of amylopectin, and the thermal properties and annealing of starches from four different structural types of amylopectin was investigated by DSC. The onset gelatinization temperature (To) correlated negatively with the number of building blocks in clusters (NBbl) and positively with the inter-block chain length (IB-CL). The enthalpy of gelatinization (∆H) correlated positively with the external chain length of amylopectin. Annealing results showed that starches with a short IB-CL were most susceptible to ANN, as evidenced by a greater increase in the To and Tm. The increase in enthalpy was greater in starches with long external chains and IB-CLs. These data suggest that the internal organization of glucan chains in amylopectin determines the alignment of chains within the crystalline lamellae and thereby the thermal properties and annealing of the starch granules.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.