Les adénovirus (AdV), comme d'autres virus à réplication nucléaire, ont besoin d’arriver jusqu’aunoyau cellulaire afin de libérer leur génome. Pour ce faire, les particules des AdV contenant l’ADNviral sont transportées jusqu’au complexe du pore nucléaire (NPC), via le centre d’organisation desmicrotubules, par un mécanisme encore mal compris qui implique l’exportine cellulaire CRM1. Lacapside des AdV dépasse la taille limite d’entrée dans le noyau, et par conséquent, elle doit êtredésassemblée au niveau du NPC. Le mécanisme d’import de molécules d’ADN n’est pas un processusphysiologique. Pour cela, les AdV doivent détourner la machinerie cellulaire afin d’importer leurgénome dans le noyau. Le NPC est un complexe de protéines appelées nucléoporines. LaNup358/RanBP2, principal composant des filaments cytoplasmiques, sert de plateforme de liaison àdes karyopherines (e.g Importin-β, CRM1) et à la protéine GTPase Ran. Les karyopherinesreconnaissent des signaux spécifiques présents dans les cargos et facilitent leur transport d’unemanière très régulée dépendante de RanGTP. Nous avons constaté que l’import du génome AdV estmoins efficace en l’absence de Nup358. Dans ces conditions, nous avons observé que certaineskaryopherines deviennent limitantes pour l’import du génome viral, et identifié la région minimale deNup358 requise pour compenser ce défaut. D’autre part, nous avons confirmé l’implication de CRM1dans l’arrivé des particules virales au noyau et identifié un nouveau rôle de CRM1 dans ledésassemblage de la capside des AdV. Ces travaux contribuent à mieux connaître le mécanismed’entrée du génome AdV dans le noyau et donnent une idée de la façon dont les virus peuventcontourner la machinerie de transport cellulaire pour leur propre bénéfice. / Nuclear delivery of viral genomes is an essential step for nuclear replicating DNA viruses such asAdenovirus (AdV). AdV particles reach the nuclear pore complex (NPC) in the form of genomecontaining, partially disassembled capsids, through a poorly understood CRM1-dependent mechanism.These capsids exceed the NPC size limit and therefore, they must disassemble at the NPC to releasethe viral genome. Nuclear import of DNA cargos is not a physiological process. Consequently, AdVneed to divert the cellular transport machinery for nuclear genome delivery. The NPC is a multiproteincomplex consisting of nucleoporins (Nups). The Nup358/RanBP2 is the major component ofthe cytoplasmic filaments of the NPC and serves as binding platform for factors includingkaryopherins (i.e Importin-β, CRM1) and the small GTPase Ran. Selective transport of cargo throughthe NPC is mediated by karyopherins, which recognize specific signals within the cargos and facilitatetheir transport in a RanGTP-dependent regulated manner. We identified that Nup358-depleted cellsreduce nuclear import efficiency of the AdV genome. Indeed, we observed that karyopherins are ratelimitingfor AdV genome import under these conditions and we mapped the minimal region ofNup358 necessary to compensate the import defect. On the other hand, we could confirm therequirement of CRM1 in nuclear targeting of AdV capsids and identified and additional role inmediating AdV capsid disassembly. This work helps to understand the strategy used by AdV todeliver their genome and gives insight about how viruses hijack the cellular transport machinery fortheir own benefit.

Certaines protéines régulatrices dites nucléo-cytoplasmique naviguent entre le noyau et le cytoplasme. En réponse à une perturbation de l'environnement de la cellule, ces protéines relocalisent massivement dans le noyau pour y activer des mécanismes permettant la survie cellulaire. Chez la levure S. pombe, 285 protéines présentent la particularité d'être nucléo-cytoplasmiques. Une étude exhaustive de certaines de ces protéines a été ici entreprise. L'objectif était d'identifier celles présentes chez S. cerevisiae qui sont vitales dans la réponse aux stress endommageant l'ADN. Parmi les protéines candidates, celles i) étant les plus conservées chez l'ensemble des organismes eucaryotes, ii) de fonction inconnue ou peu décrite et iii) dont la répartition nucléo-cytoplasmique change après stress ont été sélectionnées à l'aide d'un crible génétique mis au point chez S. cerevisiae. Douze protéines ont été identifiées comme relocalisant au noyau sous l'effet du stress radiatif ou métaux lourds. Parmi elles, la protéine Pat1 (YCR077C) décrite à ce jour comme un activateur de la dégradation cytoplasmique des ARNs messagers a été choisie et une étude plus approfondie de son activité entreprise. Par une approche TAP-tag couplée à une stratégie de protéomique de type shotgun, le réseau de partenaires protéiques de Pat1 a été établi en absence de stress et en condition de stress UV. La région potentiellement impliquée dans la localisation cellulaire de la protéine Pat1 est sujette à de multiples phosphorylations dont le degré augmente après stress UV. Enfin, les résultats sur les partenaires spécifiques de Pat1 identifiés par protéomique en condition de stress ont été corroborés par une analyse de sa relocalisation chez les différents mutants correspondants. L'ensemble de nos résultats mettent en exergue une nouvelle fonctionnalité pour la protéine Pat1 spécifiquement menée au noyau des cellules qu'il reste désormais à préciser. / Some regulatory proteins called nucleo-cytoplasmic proteins, shuttle between the nucleus and the cytoplasm. Upon environmental stress, these proteins relocate massively to the nucleus where they activate pro-survival mechanisms. In the yeast S. pombe, 285 proteins are nucleo-cytoplasmic. An exhaustive study of some of these proteins was carried out herein. The goal was to identify the ones that are present in S. cerevisiae and vital in the DNA damage response. Among the candidate proteins, the ones i) that are the most conserved in the eukaryotic cells, ii) with unknown function or poorly characterized, and iii) whose nucleo-cytoplasmic repartition changes upon stress were selected by the use of a genetic screen monitored in S. cerevisiae. Twelve proteins were found to accumulate in the nucleus upon irradiating or heavy metal stresses. Pat1 (YCR077C) currently described as a cytosolic mRNA decay activator was chosen and a more complete investigation about its activity was undertaken. By the mean of a TAP-tag approach combined with a shotgun proteomic analysis, the Pat1 interaction network was established without any stress and after UV stress illumination. Pat1 exhibits a domain potentially involved in its relocation that is subjected to multiple phosphorylations whose state enhances after UV stress. Finally, the data about the specific partners of Pat1 identified by proteomic analysis in stress condition were confirmed by the study of Pat1 relocation in the corresponding deleted strains. Altogether, our data suggest a novel function for the Pat1 protein that needs to be further investigated.

L’édition des ARN est une exception à la règle de la biologie moléculaire qui stipule que l’information codée par le gène se trouve fidèlement transmise à la protéine. Dans les mitochondries de plante, elle procède par conversion de centaines de cytosines en uraciles par désamination, principalement dans les ARNm. Afin de comprendre le mode de reconnaissance des cytosines par la machinerie d’édition nous avons systématiquement vérifié l’importance des nucléotides -1 et +1 entourant la cytosine cible dans l’édition des transcrits cox2 de blé. Sur cette base, les sites d'édition peuvent être classés en quatre familles: (a) dépendance du résidu +1, (b) dépendance du résidu -1, (c) dépendance des deux résidus et (d) indépendance. Nous avons d’autre part mis en évidence des effets à distance sur le taux de la réaction d’édition, montrant ainsi que certains sites ne sont pas autonomes pour la réaction. L'ensemble des observations nous révèle que le devenir des transcrits a une influence sur l'efficacité de l’édition. Pour le vérifier nous avons construit des gènes cox2 et rps10 dépourvus d'introns. L’efficacité d’édition des transcrits qui ne sont pas soumis à l'épissage est grandement réduite par rapport aux transcrits sauvages, ce qui renforce l’idée que les mécanismes de maturation doivent être interconnectés dans les mitochondries de plante. D’autre part, nous avons montré que l’édition de certains sites introniques pouvait être indispensable à la maturation des transcrits en rétablissant des structures nécessaires à l’épissage. L’exploration de la mécanistique de l’épissage des introns mitochondriaux nous a conduit à mettre au point un test de trans-épissage in organello. Ce test doit permettre de valider expérimentalement les hypothèses ayant trait à la reconnaissance des transcrits et de vérifier le rôle de l’édition dans ce mécanisme. Enfin, la mise en relation de l’édition avec d’autres phénomènes physiologiques touchant les organelles, comme la stérilité mâle cytoplasmique, nous a permis de développer une hypothèse permettant d’expliquer l’émergence et le maintien au cours de l’évolution de ce phénomène chez les plantes. Nous proposons que le conflit nucléo-cytoplasmique a constitué l’élément moteur pour l’apparition de l’édition en permettant l’installation de mutations T en C au niveau de la mitochondrie. La réponse nucléaire a été la correction de ces mutations sur l’ARN mitochondrial, aboutissant à ce que nous appelons aujourd'hui l’édition des ARN. / RNA editing is an exception to the central dogma of molecular biology which states that the information encoded by the gene is faithfully transmitted to the protein. The plant mitochondrial transcriptome undergoes hundreds of specific C-to-U changes by RNA editing, mainly in mRNAs. To understand the mechanism used by the plant to select the C targets on the transcript, we studied the role of the neighbors -1 and +1 nucleotides in wheat cox2 editing sites. Under this scheme, four different recognition patterns can be distinguished: (a) +1 dependency (b) -1 dependency (c) +1/-1 dependency and (d) no dependency on nearest neighbor residues. An important observation was that distal elements can influence the editing efficiency, indicating that some sites are not autonomous for the reaction. We propose that these results could be a consequence of the fate of transcripts during the different maturation steps. To test this hypothesis, we constructed intronless cox2 and rps10 genes. RNA editing was strongly reduced in these constructs, suggesting that efficient RNA processing may require a close interaction of factors engaged in different maturation processes. Our results on editing events in non coding region, particularly in introns, indicate that editing is essential for splicing by remodeling the secondary structure required to excise the intron. To gain insight into the splicing mechanism for scattered mitochondrial genes, we have settled an in organello trans-splicing assay. By this way, it should be possible to decipher the molecular determinants of the reaction and the eventual role of RNA editing in this process. Finally, we proposed a new hypothesis explaining the origin and evolution of RNA editing in plant mitochondria. We assume that the nucleo-cytoplasmic conflict was the driving force allowing the settlement of T-to-C mutations in the mitochondrial genome. The nuclear response was the correction of these mutations on the RNA, i.e. RNA editing.

Les travaux de ce mémoire portent sur la dynamique d'assemblage, de dissociation et de recyclage des protéines impliquées dans la biogenèse de la grande sous-unité ribosomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ils permettent une meilleure compréhension de deux points de contrôle de cette voie métabolique, l'un dans le noyau, l'autre dans le cytoplasme. <br />Nous avons montré que la protéine nucléaire Nsa2, extrêmement conservée chez les Eucaryotes, est requise pour la maturation correcte de l'intermédiaire d'ARN ribosomique 27SB. Nsa2 est un facteur instable et régulé en fonction de l'activité de la biogenèse des ribosomes ; à ce titre, il pourrait centraliser différents signaux de contrôle de la voie métabolique. Par ailleurs, la technique de SILAC nous a permis de définir des groupes de facteurs pré-ribosomiques précoces ou tardifs par rapport au point d'action de Nsa2.<br />Dans le cytoplasme, nous avons mis en évidence un réseau de protéines marquant la transition entre la fin de la biogenèse de la grande sous-unité et l'initiation de la traduction. La protéine cytoplasmique Rei1 et la karyophérine Kap121 sont requises pour le recyclage du dimère de facteurs navettes Arx1-Alb1, du cytoplasme vers le noyau. Ce recyclage conditionne la dissociation entre le facteur d'anti-association Tif6 et la grande sous-unité ribosomique, qui peut dès lors se lier à la petite sous-unité ribosomique et participer à la traduction.

Dans la cellule, les ARN pré messagers contenant des introns sont normalement retenus au noyau par leur interaction avec des facteurs d’épissage. Cependant, les ARN partiellement et non épissés des rétrovirus doivent entrer dans le cytoplasme pour servir de matrice pour la synthèse de certaines protéines telles que Env, Gag et Gag-Pol ainsi que d’ARN génomique qui sera empaqueté dans les nouveaux virions. Un mécanisme post-transcriptionnel utilisé par les lentivirus pour éviter la séquestration nucléaire de ces ARNm dépend d’une protéine virale appelée Rev. Pour assurer sa fonction d’exportation, Rev doit transiter entre le noyau et le cytoplasme et doit aussi pouvoir former des multimères. Par conséquent, Rev est dotée de domaines fonctionnels lui procurant ces habiletés. On retrouve le domaine riche en arginines qui contient le domaine de liaison à l’ARN et le signal de localisation nucléaire (NLS), un second domaine, riche en leucines, porte le signal d’exportation nucléaire (NES) et finalement le domaine de multimérisation. Bien que les protéines Rev du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) et bovine (VIB) aient été caractérisées, aucune étude n’a été réalisée pour la protéine Rev du virus de la maladie de Jembrana (JDV) et très peu sur le virus de l’immunodéficience féline (VIF). Comme les domaines fonctionnels et la voie d’importation des protéines Rev déjà caractérisées sont différents, nous supposons que chaque protéine Rev possède une organisation qui lui est propre et que les mécanismes de transport nucléo-cytoplasmique diffèrent entre les virus. Ce projet a pour objectif de caractériser ces domaines pour la protéine Rev du JDV et ceux du VIF ainsi que les mécanismes permettant leur transport nucléaire. L’utilisation de mutants de la protéine Rev de ces virus couplés à la protéine de fluorescente verte (EGFP) exprimés dans des cellules appropriées et observés par microscopie a permis d’identifier des séquences NLS et NES différentes de celles déjà caractérisées. Le NLS de la protéine Rev du JDV a été identifié et est composé des résidus arginines de la séquence 76-RRPARRPPIRR-87 avec un NoLS composé des mêmes résidus en plus des arginines R74, R103 et R104. Son NES est composé des résidus hydrophobes de la séquence 116-MAELEERFEDLAL-128 et est du type de l’inhibiteur de la protéine kinase (PKI pour « protéine kinase inhibitor »). Pour la protéine Rev du VIF, son NLS est composé des résidus basiques de la séquence 84-KKKRQRRRRKKKAFKK-99. Le NoLS est composé des mêmes acides aminés en plus du résidu K82. De plus, les essais d’importation nucléaires et d’interaction semblent indiquer que les voies d’importation utilisées diffèrent entre les virus et que plusieurs voies peuvent être utilisées. Ces travaux pourront éventuellement servir de base pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les lentivirus. / In the cell, pre-messenger RNAs containing introns are normally retained in the nucleus by their interaction with splicing factors. However, the partially and unspliced ​​RNAs of retroviruses must enter the cytoplasm to serve as a template for the synthesis of certain proteins such as Env, Gag and Gag-Pol as well as genomic RNA to be packaged in the new virions. A post-transcriptional mechanism used by lentiviruses to prevent nuclear sequestration of these mRNAs depends on a trans-activator, the viral protein Rev. To ensure its export function, Rev must be able to shuttle between the nucleus and the cytoplasm and to form multimers. As a result, Rev has functional domains that provide these abilities: the arginine-rich domain, which contains the RNA binding domain and the nuclear localization signal (NLS), a second domain, rich in leucine, corresponding to the nuclear export signal (NES) and finally the multimerization domain. Although the Rev proteins of the human and bovine immunodeficiency virus (HIV-1 and BIV respectively) have been characterized, no studies have been performed for the Jembrana disease virus (JDV) Rev protein and very little on the feline immunodeficiency virus (FIV). Since the functional domains and import pathway of the already characterized Rev proteins are different, we assume that each Rev protein has its own organization and that the nucleo-cytoplasmic transport mechanisms differ between viruses. The goal of this project is to characterize these domains for the JDV and FIV Rev proteins as well as to elucidate mechanisms for their nuclear transport. The use of Rev mutants fused to the EGFP expressed in appropriate cells and observed by microscopy has identified NLS and NES sequences that differ from those already characterized. JDV Rev NLS is composed of arginine residues in the 76-RRPARRPPIRR-87 sequence with a NoLS composed of the same residues with the addition of arginine R74, R103 and R104. JDV Rev NES is composed of hydrophobic residues in the 116-MAELEERFEDLAL-128 sequence and is of the protein kinase inhibitor type (PKI). For the FIV Rev protein, its NLS is composed of basic residues in the 84-KKKRQRRRRKKKAFKK-99 sequence. FIV Rev NoLS is composed of the same residues with the addition of the lysine at position 82. In addition, the nuclear import and interaction tests suggest that the import routes used by Rev differ between the different viruses studied and that more than one import pathway may be used. This work could serve as a basis for identifying new therapeutic targets against lentiviruses.

The nucleo-cytoplasmic compartmentalization enables eukaryotic cells to develop sophisticated post-transcriptional regulations of gene expression. However, managing the exchanges of macromolecules between the two compartments also represents a formidable challenge for the cells. Nucleo-cytoplasmic exchanges rely on specialized soluble carriers and take place at nuclear pore complexes that span the nuclear envelope. Active nucleo-cytoplasmic transport of proteins, in particular, is performed mainly by a family of carriers called karyopherins, which includes about twenty members in mammals. Some of them, called importins, recognize nuclear localization signals (NLSs) in their substrates and convey them into the nucleus. Others, called exportins, recognize nuclear export signals (NESs) in their substrates and bring them back to the cytoplasm. <p>Many RNA-binding proteins (RBPs) shuttle between the nucleus and the cytoplasm, where they can often fulfill different functions. RBPs also frequently localize into specialized microdomains that are not delimited by a membrane but in which specific factors are concentrated. Those include processing bodies and stress granules, which are cytoplasmic foci associated with mRNA decay, storage and translational repression. Post-transcriptional regulations mediated by RBPs can therefore be modulated rapidly and efficiently through changes in the localization of RBPs.<p>The first part of this work focuses on the subcellular localization and nucleo-cytoplasmic transport of the Drosophila RBP dTIS11. Like its mammalian and yeast homologues, dTIS11 binds AU-rich elements in the 3’UTR of its target mRNAs, and stimulates their rapid deadenylation and decay. Here, we have observed that although dTIS11 appears to be located mostly in the cytoplasm, it is constantly shuttling in and out of the nucleus. We show that the export of dTIS11 from the nucleus depends on the CRM1 exportin and is mediated by a hydrophobic NES that encompasses residues 101 to 113 in dTIS11 sequence. We also identify a cryptic Transportin-dependent PY nuclear localization signal (PY-NLS) in the tandem zinc finger region of dTIS11 and show that it is conserved across the TIS11 protein family. This PY-NLS partially overlaps the second zinc finger (ZnF2) of dTIS11. Importantly, mutations disrupting the capacity of the ZnF2 to coordinate a Zn2+ ion unmask dTIS11 and TTP PY-NLS and promote nuclear import. Taken together, our results indicate that the nuclear export of Drosophila and mammalian TIS11 proteins is mediated by CRM1 through diverging NESs, while their nuclear import mechanism might rely on a conserved PY-NLS whose activity is negatively regulated by ZnF2 folding.<p>In the second part, we present preliminary results which implicate the nucleo-cytoplasmic transport machinery in the assembly of stress granules (SGs) in mammalian cells. SGs contain silenced mRNPs which resemble stalled initiation complexes, and they form transiently in response to acute stress, concomitantly with a global arrest of translation. While their exact role remains undefined, it seems clear that SGs are able to exchange mRNPs with polysomes and with PBs, and that they are connected to post-transcriptional and translational regulations of gene expression during stress. Here, we show that inhibition of Transportin-1 expression or function does not affect the translational status of cells but impairs the assembly of stress granules. Finally, we show that Transportin-1 and -2B, but not -2A, localize into stress granules in response to several stresses. <p>In conclusion, we suggest two potential new roles for Transportins, in the nucleo-cytoplasmic traffic of TIS11 proteins on the one hand and in the assembly of stress granules on the other hand.<p>/<p>Le compartimentage nucléo-cytoplasmique permet aux cellules eucaryotes de réguler l’expression génétique par des mécanismes post-transcriptionnels élaborés. Les ARN messagers subissent plusieurs étapes de maturation dans le noyau avant d’être exportés vers le cytoplasme où ils sont traduits et dégradés. Ces processus sont effectués via des protéines de liaison à l’ARN, ou RBPs. Beaucoup de RBPs exercent des fonctions différentes dans le noyau et dans le cytoplasme, et leur activité peut dès lors être rapidement modulée par une modification de leur localisation.<p>Le transport nucléo-cytoplasmique actif des protéines s’effectue à travers les pores nucléaires et fait majoritairement appel à des transporteurs solubles de la famille des karyophérines. Ceux-ci reconnaissent au sein des protéines à transporter une séquence-passeport appelée NLS (nuclear localization signal) ou NES (nuclear export signal) selon la direction nécessitée. <p>Le présent travail comporte deux parties. La première porte sur la localisation subcellulaire et le transport nucléo-cytoplasmique des protéines de la famille TIS11, et plus particulièrement de dTIS11 qui est le seul représentant de cette famille chez la Drosophile. Comme ses homologues dans d’autres espèces, dTIS11 est une RBP qui favorise la déadénylation et la dégradation de ses ARN messagers cibles. Nos résultats démontrent que dTIS11 fait la navette entre le noyau et le cytoplasme. L’export de dTIS11 hors du noyau est réalisé par la karyophérine CRM1 et fait appel à un NES différent de celui présent chez les protéines TIS11 mammaliennes. Nous identifions également un NLS cryptique au sein du domaine à deux doigts de zinc avec lequel dTIS11 lie l’ARN. Ce NLS correspond partiellement au signal consensus reconnu par la Transportine. Il est démasqué par la mutation du second doigt de zinc ;dans ces conditions, il permet l’import de dTIS11 par la Transportine. Enfin, nous montrons qu’il est conservé dans d’autres protéines de la famille TIS11. <p>Dans la seconde partie, nous nous intéressons aux granules de stress, qui sont des microdomaines cytoplasmiques dans lesquels se concentrent des RBPs et des ARN messagers non traduits en réponse à un stress cellulaire. Nous montrons que les karyophérines appartenant à la sous-famille des Transportines sont présentes dans ces granules et que l’inhibition de l’expression ou de la fonction des Transportines réduit la formation de ces granules en réponse à divers stress cellulaires. Nous écartons la possibilité que ce résultat soit un effet indirect d’un ralentissement du métabolisme traductionnel. Nos résultats suggèrent donc une implication des Transportines dans la formation des granules de stress. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished