Master of Science / Department of Clinical Sciences / James W. Carpenter / Current in vitro maturation (IVM) systems for domestic dog oocytes are inefficient, largely due to the species' unique reproductive physiology. The size of donor follicle influences developmental competence of dog ovarian oocytes. Specifically, oocytes from follicles > 2 mm in diameter complete in vitro nuclear maturation at a higher rate than those from smaller follicles. The objective was to determine the influences of follicular size, maturation time, and meiotic status on oocyte metabolism. We hypothesized that metabolic patterns differed between oocytes from small versus large follicles. Oocytes (n = 531) from adult ovaries were collected and grouped based on follicular size (small, < 1 mm, n = 252; medium, 1 to 2 mm, n = 231; and large, > 2 mm, n = 48). Oocytes were cultured for 0, 24, or 48 hours at 38.5°C in 5% CO[subscript]2 in 80 [Mu]L of TCM 199 + 25[Mu]M [Beta]- mercaptoethanol + 10 ng/ml epidermal growth factor + 0.25 mM pyruvate + 2.0 mM glutamine + 0.1% polyvinyl alcohol + 0.03 mg/ml streptomycin + 0.03 mg/ml penicillin G sodium (IVM medium), assessed for metabolism and evaluated for nuclear status. For metabolic assessments, oocytes were incubated for 3 h in 3 [Mu]l of IVM medium containing (1) 0.005 mM [0.064 [Mu]Ci/[Mu]l] D-53H-glucose (glycolysis) + 1 mM D-614C [0.053 [Mu]Ci/[Mu]l] glucose (glucose oxidation) or (2) 0.001 mM [0.041 [Mu]Ci/[Mu]l] L-G-3H-glutamine + 1 mM [0.027 [Mu]Ci/[Mu}l] 1-14C pyruvate, placed on the lid of a centrifuge tube containing 25 mM NaHCO3 and trapped radioactivity was measured using a [Beta]-counter. Only oocytes at an appropriate meiotic stage for each culture period (n = 380) were included in data analysis (e.g., germinal vesicle stage at 24 and 48 h culture were excluded). Differences in metabolism among groups were analyzed by ANOVA (main effects being follicular class, culture interval, and meiotic status). Oocytes recovered from large follicles metabolized significantly more pyruvate, glutamine, and glucose (via glycolysis) than those from small ones (p < 0.05). Across meiotic stages and follicular sizes, glycolytic rate was lowest in oocytes cultured for 24 hours (p < 0.05) compared to 0 or 48 hours. Metaphase II oocytes had a significantly higher glycolytic rate than those at other meiotic stages (p < 0.05). At culture onset (0 h), oocytes from small follicles predominately used pyruvate (p < 0.05), while oocytes from larger follicles (p < 0.05) predominately metabolized glucose. The present data suggests that dog oocytes preferentially use glucose as an energy substrate and that increasing glycolytic rate correlates with meiotic maturation. In addition, oocytes collected from large follicles exhibit increased metabolic capabilities that may be responsible for their increased developmental competence during IVM.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-10-16T11:45:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_barbara_da_silva_alves.pdf: 489976 bytes, checksum: 4eeba836c9990bc82824db3437f40cd3 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-17T11:39:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_barbara_da_silva_alves.pdf: 489976 bytes, checksum: 4eeba836c9990bc82824db3437f40cd3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-17T11:42:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_barbara_da_silva_alves.pdf: 489976 bytes, checksum: 4eeba836c9990bc82824db3437f40cd3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-17T11:42:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_barbara_da_silva_alves.pdf: 489976 bytes, checksum: 4eeba836c9990bc82824db3437f40cd3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / A produção in vitro de embriões é uma das principais técnicas aplicadas a reprodução animal. A suplementação com ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (PUFA) da série ômega-3 nos meios de maturação in vitro (MIV) pode ser relevante para a diminuição de gotículas lipídicas que prejudicam a eficiência da produção in vitro e criopreservação de embriões suínos. O presente trabalho avaliou o efeito da suplementação do meio de MIV com dois PUFA, o eicosapentaenoico (EPA) e o docosahexaenóico (DHA), sobre a maturação nuclear de oócitos suínos. Folículos com 3 a 6 mm de diâmetro foram aspirados de ovários de fêmeas suínas pré-púberes coletados em frigoríficos. O meio de maturação foi constituído de TCM-199 suplementado com 0,57 mM de cisteína, 0,91 mM de piruvato de sódio, 10 ng/mL de EGF, 0,5μg/mL de LH, 0,5μg/mL de FSH e 0,1% de PVA. A MIV foi avaliada para grupos com aproximadamente 30 complexos cumulus-oócitos, compondo quatro tratamentos, em meios suplementados com: 10% de fluído folicular suíno (FFS), considerado como controle; 50; 100 e 150μM de cada PUFA. Foi também realizada a suplementação com FFS e AMPc para avaliar a possível toxicidade desses ácidos graxo. Após as 44 h de MIV, os oócitos foram corados com Hoechst 33342. Houve diferença entre as taxas de MIV obtidas nos meios suplementados com diferentes níveis de EPA a partir de 100 μM, em comparação ao controle (P > 0,05). As taxas de MIV observadas nos meios suplementados com DHA em concentrações a partir de 100 μM foram inferiores às observadas para o controle (P < 0,05). Quando comparadas com meios suplementados FFS e AMPc, as taxas de MIV observas com 50 μM de EPA e DHA não diferiram (P > 0,05). Estes resultados indicam que a suplementação de meios para MIV com EPA e DHA influenciam de forma negativa as taxas de maturação in vitro nuclear, sugerindo um efeito tóxico para os oócitos suínos. / The production of embryos in vitro (IVP) is one of the main techniques applied to animal reproduction. Supplementation of in vitro maturation (IVM) media with long-chain polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the omega-3 series may be relevant to the decrease of lipid droplets which hinder efficient IVP and cryopreservation of porcine embryos. This study evaluated the effects of supplementation of IVM media with two PUFA, the eicosapentaenoic (EPA) and the docosahexaenoic (DHA) on the nuclear maturation of pig oocytes. Follicles with 3-6 mm diameter were aspirated from ovaries collected at abattoirs from prepubertal gilts. The IVM medium was TCM-199 supplemented with 0.57 mM cysteine, 0.91 mM sodium pyruvate, 10 ng/mL EGF, 0.5 μg/mL LH, 0.5 μg/mL FSH and 0.1% PVA. The IVM rates were evaluated for groups having nearly 30 cumulus-oocyte complexes in four treatments, including media supplemented with: 10% porcine folicular fluido (PFF), as a control; 50; 100 and 150μM of each PUFA. FOS supplementation and cAMP was also performed to evaluate the possible toxicity of these fatty acids. After 44 h of IVM, oocytes were stained with Hoechst 33342. Differences were observed between IVM rates obtained in media supplemented with different levels of EPA from 100 uM, compared to the control (P> 0.05). The IVM rates observed in media supplemented with DHA at concentrations from 100 uM were lower than those in the control (P <0.05). When compared with supplemented FFS and cAMP means IVM rates swarming with 50 mM of EPA and DHA did not differ (P> 0.05). These results indicate that supplementation of IVM medium with EPA and DHA influenced negatively the rate of nuclear maturation, suggesting a toxic effect for swine oocytes.

Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Camila Infantosi Vannucchi / Banca: Lúcia Daniel Machado da Silva / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Marion Burkhardt Koivisto / Resumo: Este estudo foi realizado com o intuito de avaliar comparativamente os efeitos do emprego de meios seqüenciais com hormônios no desenvolvimento meiótico e citoplasmático de oócitos caninos durante o período de cultivo de 72 horas. Os oócitos foram coletados de 49 cadelas hígidas submetidas à ovariosalpingo-histerectomia ou ovariectomia, divididas em três grupos de acordo com seu status reprodutivo (fase folicular, lútea e anestro). Os óocitos foram aleatoriamente distribuídos em quatro sistemas de cultivo diferentes sendo o meio básico (MB) o TCM 199 suplementado. Os demais consistiam: no sistema A (controle) os oócitos foram maturados por 72 horas no (MB) com 10 UI/mL de hCG, 1 mg/mL de progesterona (P4) e 1 mg/mL de estradiol (E2), ou seja, expostos de forma contínua à estes hormônios; no sistema seqüenciado B os oócitos foram maturados no meio base com hCG por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema seqüenciado C os oócitos foram maturados no MB com hCG, P4 e E2 por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema D (controle) os oócitos foram maturados no MB, sem hormônios. Nos meios B e C, os hormônios foram suplementados nas mesmas concentrações empregadas no sistema A. Os resultados evidenciaram efeito positivo dos meios seqüenciais na progressão da meiose e na maturação citoplasmática (P<0,05). Não houve influência da condição reprodutiva das fêmeas doadoras nas taxas de maturação oocitária (P>0,05). A presença de espermatozóides nos meios de cultivo não teve efeito benéfico sobre as taxas de MII; em contrapartida, a porcentagem de oócitos degenerados aumentou consideravelmente (P>0,05). / Abstract: The aim of this work was to study the influence of different bi-phasic systems with gonadotrophins and steroids on meiotic and cytoplasmic development of canine oocytes cultured for 72 hours. Oocytes were collected after ovariohysterectomy or ovariectomy from 49 healthy bitches, divided into 3 groups according to their reproductive status (follicular, luteal and anestrous stages). Oocytes were randomly allocated in four different culture systems with the base medium (BM) consisting of TCM-199. The systems were as follows: in system A oocytes were matured for 72 h in BM with 10 UI/mL hCG, 1 mg/mL progesterone (P4), 1 mg/mL estradiol (E2); in bi-phasic system B oocytes were matured for 48 h in BM with hCG and for 24 h in BM with P4; in bi-phasic system C oocytes were matured for 48 h in BM with hCG, P4 and E2, and for 24 h in BM with P4. In system D (control), oocytes were cultured in BM without hormones. In sytems B and C hormones were supplemented at the same doses as in system A. The results suggest that the use of bi-phasic systems was beneficial for oocyte meiosis and cytoplasmic maturation (P<0,05). No difference was noticed with regards to the influence of reproductive status on maturation rates (P>0,05). The addition of spermatozoa to the medium had no benefit on MII stage rates (P>0,05); however, the percentage of degenerated oocytes has significantly increased. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:21Z : No. of bitstreams: 1 apparicioferreira_m_dr_jabo.pdf: 8938205 bytes, checksum: 540b8a495ebda2425790114eece3d47a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo foi realizado com o intuito de avaliar comparativamente os efeitos do emprego de meios seqüenciais com hormônios no desenvolvimento meiótico e citoplasmático de oócitos caninos durante o período de cultivo de 72 horas. Os oócitos foram coletados de 49 cadelas hígidas submetidas à ovariosalpingo-histerectomia ou ovariectomia, divididas em três grupos de acordo com seu status reprodutivo (fase folicular, lútea e anestro). Os óocitos foram aleatoriamente distribuídos em quatro sistemas de cultivo diferentes sendo o meio básico (MB) o TCM 199 suplementado. Os demais consistiam: no sistema A (controle) os oócitos foram maturados por 72 horas no (MB) com 10 UI/mL de hCG, 1 mg/mL de progesterona (P4) e 1 mg/mL de estradiol (E2), ou seja, expostos de forma contínua à estes hormônios; no sistema seqüenciado B os oócitos foram maturados no meio base com hCG por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema seqüenciado C os oócitos foram maturados no MB com hCG, P4 e E2 por 48 horas e nas 24 horas adicionais no MB com P4; no sistema D (controle) os oócitos foram maturados no MB, sem hormônios. Nos meios B e C, os hormônios foram suplementados nas mesmas concentrações empregadas no sistema A. Os resultados evidenciaram efeito positivo dos meios seqüenciais na progressão da meiose e na maturação citoplasmática (P<0,05). Não houve influência da condição reprodutiva das fêmeas doadoras nas taxas de maturação oocitária (P>0,05). A presença de espermatozóides nos meios de cultivo não teve efeito benéfico sobre as taxas de MII; em contrapartida, a porcentagem de oócitos degenerados aumentou consideravelmente (P>0,05). / The aim of this work was to study the influence of different bi-phasic systems with gonadotrophins and steroids on meiotic and cytoplasmic development of canine oocytes cultured for 72 hours. Oocytes were collected after ovariohysterectomy or ovariectomy from 49 healthy bitches, divided into 3 groups according to their reproductive status (follicular, luteal and anestrous stages). Oocytes were randomly allocated in four different culture systems with the base medium (BM) consisting of TCM-199. The systems were as follows: in system A oocytes were matured for 72 h in BM with 10 UI/mL hCG, 1 mg/mL progesterone (P4), 1 mg/mL estradiol (E2); in bi-phasic system B oocytes were matured for 48 h in BM with hCG and for 24 h in BM with P4; in bi-phasic system C oocytes were matured for 48 h in BM with hCG, P4 and E2, and for 24 h in BM with P4. In system D (control), oocytes were cultured in BM without hormones. In sytems B and C hormones were supplemented at the same doses as in system A. The results suggest that the use of bi-phasic systems was beneficial for oocyte meiosis and cytoplasmic maturation (P<0,05). No difference was noticed with regards to the influence of reproductive status on maturation rates (P>0,05). The addition of spermatozoa to the medium had no benefit on MII stage rates (P>0,05); however, the percentage of degenerated oocytes has significantly increased.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In mammals, it is well know that resumption of meiosis occurs after the preovulatory LH surge and results in germinal vesicle breakdown (GVBD), initiating the so-called oocyte maturation. However, the pathway by which this gonadotrophin acts is not completely clear. We have recently demonstrated that AngII plays an important role on the onset of ovulation in cattle, potentially acting as an intrafollicular LH mediator. We also observed that AngII prevents the inhibitory effect of follicular cells during bovine oocyte nuclear maturation in vitro. These results suggest that AngII plays a role in LH-induced resumption of meiosis in the bovine oocyte. The aim of this study was to verify the involvement of AngII in LH-induced meiosis resumption and test the hypothesis that prostaglandins E2 and F2α participates of AngII-induced meiosis resumption in bovine oocytes. In the first experiment, seven cows were superovulated with FSH and follicles larger than 12 mm in diameter were subjected to an intrafollicular injection of saralasin or saline. Follicles from the right ovary (n=17) where intrafollicular injected with saralasin (10μM) and follicles from the left ovary (n=17) were treated with saline (control group). A preovulatory LH surge was induced by im injection of a GnRH agonist (gonadorelin 100μg im) following the intrafollicular injections. Fifteen hours later, the animals were ovariectomized and the oocytes were recovered to evaluate the stage of meiotic maturation. All oocytes (n=12) were at germinal vesicle stage (GV) 15 hours after GnRH agonist injection in the saralasin group while in the control group (n=13) the oocytes were at the GVBD (30.8%) or Metaphase I (MI; 69.2%; P<0.001) stage. In other experiment, oocytes were co-cultured with follicular hemisections during 15 hours, to evaluate the role of prostaglandins mediating the effect of AngII on meiotic resumption. The inhibitory effects caused by follicular cells on oocyte nuclear maturation was prevented by adding 100pM of AngII to the culture medium (26.6% MI without AngII vs. 77.5% MI with AngII; P<0.001). However, when a nonselective ciclooxigenase (COX) inhibitor (10μM of indometacin) was present in the culture system with AngII and follicular hemisections, oocytes reached MI in a percentage (13.4%) significantly lower than without indometacin (P<0.001). Furthermore, when 1μM of PGE2 or PGF2α was added to the co-culture system with follicular cells, oocyte nuclear maturation rate followed the same pattern as the high maturation rate observed in the presence of AngII (PGE2 77.4%, PGF2α 70.0% and AngII 75.0% of MI). In conclusion, these results suggest that AngII mediates meiosis resumption induced by LH surge in bovine oocytes, which is dependent of PGE2 and PGF2α production by follicular cells. / Em mamíferos, é bem estabelecido que o reinício da meiose ocorre após o pico préovulatório de LH e resulta no rompimento da vesícula germinativa (RVG), iniciando a maturação do oócito. Entretanto, a via pela qual essa gonadotrofina atua não está completamente elucidada. Nosso grupo demonstrou que a angiotensina II (AngII) apresenta uma importante função no início da ovulação em bovinos, potencialmente atuando como um mediador intrafolicular do LH. Nós também observamos que a AngII previne o efeito inibitório das células foliculares durante a maturação nuclear in vitro de oócitos bovinos. Estes resultados sugerem que a AngII apresenta uma função importante durante o reinício da meiose induzido pelo LH em oócitos bovinos. Portanto, os objetivos deste estudo foram verificar a participação da AngII no reinício da meiose induzido pelo pico ovulatório de LH, e investigar o envolvimento das prostaglandinas E2 e F2α como mediadores da AngII para desencadear o reinício da meiose em oócitos bovinos. No primeiro experimento, sete vacas foram superovuladas com FSH e os folículos maiores que 12mm de diâmetro foram submetidos a uma injeção intrafolicular de saralasina ou NaCl 0,9%. Os folículos do ovário direito (n=17) receberam uma injeção intrafolicular de saralasina (10μM) e os do ovário esquerdo (n=17) foram injetados com NaCl 0,9% (grupo controle). Um pico de LH foi induzido pela administração IM de um agonista do GnRH (gonadorelina 100μg) imediatamente após as injeções intrafoliculares. Quinze horas após, os animais foram ovariectomizados e os oócitos foram recuperados para avaliar o estádio da maturação nuclear. Todos os oócitos do grupo saralasina (n=12) estavam no estádio de vesícula germinativa (VG) 15 horas após a administração IM de um agonista do GnRH enquanto que no grupo controle (n=13) os oócitos estavam no estádio de RVG (30,8%) ou Metáfase I (MI; 69,2%; P<0,001). Em outro experimento, oócitos foram co-cultivados com metades foliculares durante 15 horas para avaliar a participação das prostaglandinas como mediadores do efeito da AngII sobre o reinício da meiose. O efeito inibitório causado pelas células foliculares sobre a maturação nuclear do oócito foi prevenido pela adição de 100pM de AngII ao meio de cultivo (26,6% de MI sem AngII vs. 77,5% de MI com AngII; P<0,001). Entretanto, quando um inibidor não seletivo da COX (10μM de indometacina) foi adicionado ao sistema de cultivo contendo AngII e metades foliculares, os oócitos atingiram MI em uma percentagem (13,4%) significativamente mais baixa que sem indometacina (P<0,001). Além disso, quando 1μM de PGE2 ou PGF2α foram adicionados ao sistema de co-cultivo in vitro com metades foliculares, a taxa de maturação nuclear dos oócitos seguiu o mesmo padrão observado na presença de AngII (PGE2 77,4%, PGF2α 70,0% e AngII 75,0% de MI). Portanto, este estudo demonstra que o reinício da meiose em oócitos bovinos, induzido pelo pico ovulatório de LH, requer AngII, e que as prostaglandinas E2 e F2α participam dessa ação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to verify the type of angiotensin II (AngII) receptor involved in nuclear maturation of bovine oocytes and the possible participation of bradykinin (BK) as a mediator of AngII in this process. The first experiment was conducted to analyze the type of AngII receptor, for this cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 7 or 12h in the presence of follicular hemisections and AngII (10-11M), with or without the antagonists losartan (10-6M; selective for AT1 receptor), PD123319 (10-6M; selective for AT2 receptor) or saralasin (10-7M; AT1 and AT2 antagonist). Additionally, two control groups were used where the oocytes were cultivated in the absence or presence of follicular hemisections (positive and negative control, respectively). Oocytes cultured for 7h in the presence AngII reached 70,4% germinal vesicle breakdown (GVBD). When losartan was added to the maturation medium with AngII, the GVBD oocytes did not have any difference (73,2%), however when COCs were cultured in the presence of AngII + PD123319, the nuclear maturation was lower (52,1%; P<0,05). The cultivation of the oocytes for a larger period (12h) did not cause a significant difference in relation to those 7h treatments (P<0,05). These data indicate that the AT2 receptor mediate the actions of AngII during the nuclear maturation in bovine. In a second experiment, the effect of different concentrations of PD123319 was verified in the oocytes nuclear maturation in the presence of AngII (10-11M) and follicular hemisections. The culture was accomplished by 7h in a similar experimental design as previous experiment and it was verified that the inhibition induced by the antagonist happened in a dose-dependent way and there is lineal relation between concentration of PD and rates of obtained RVG (P=0,0306). To verify the participation of BK in the action mechanism of AT2 receptors, the oocytes were cultured in the presence of AngII (10-11M) and follicular hemisections with or without Hoe-140 (antagonist of B2 receptors of BK) in different concentrations (10-6, 10-7, 10-8 and 10-9M) for 7h. In this experiment, there was not any difference in the rates of GVBD oocytes among the groups treated with the antagonist and the AngII group (P>0,05). These data allow to infer that AngII acts in the nuclear maturation of the bovines oocytes activating the AT2 receptors and that the BK/receptor B2 pathway is not involved in that process. / O objetivo deste estudo foi de verificar o tipo de receptor da angiotensina II (AngII) envolvido na maturação nuclear de oócitos bovinos e a possível participação da bradicinina (BK) como mediadora da AngII nesse processo. O primeiro experimento foi conduzido para analisar o tipo de receptor, para isso os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram cultivados por 7 ou 12h na presença de hemiseções foliculares e AngII (10-11M), com ou sem os antagonistas losartan (10-6M; seletivo para receptores AT1), PD123319 (10-6M; seletivo para receptores AT2) ou saralasina (10-7M; antagonista AT1 e AT2). Adicionalmente, foram utilizados dois grupos controle, onde os oócitos foram cultivados na ausência ou na presença de hemiseções foliculares (controle positivo e negativo, respectivamente). Oócitos cultivados por 7h em presença de AngII atingiram 70,4% de rompimento da vesícula germinativa (RVG). Quando o losartan foi adicionado ao meio de cultivo com AngII, não houve diferença na percentagem de oócitos em RVG (73,2%), porém, quando os CCOs foram incubados na presença de AngII + PD123319, houve queda significativa na maturação nuclear (52,1%; P<0,05). O cultivo dos oócitos por um período maior (12h) não causou diferença significativa em relação a esses tratamentos quando foram realizados às 7h (P<0,05). Esses dados indicam que os receptores AT2 mediam as ações da AngII na maturação nuclear em bovinos. Em um segundo experimento, foi verificado o efeito de diferentes concentrações de PD123319 na maturação nuclear dos oócitos na presença de AngII (10-11M) e hemiseções foliculares. O cultivo foi realizado por 7h em um delineamento similar ao do experimento anterior e verificou-se que a inibição induzida pelo antagonista ocorreu de maneira dosedependente e há relação linear entre concentração de PD e índices de RVG obtidos (P=0,0306). Para verificar a participação da BK no mecanismo de ação dos receptores AT2, os oócitos foram cultivados na presença de AngII (10-11M) e hemiseções foliculares com ou sem Hoe-140 (antagonista de receptores B2 da BK) em diferentes concentrações (10-6, 10-7, 10-8 e 10-9M) por 7h. Nesse experimento, não houve diferença nos índices de oócitos que atingiram RVG entre os grupos tratados com o antagonista e o grupo AngII (P>0,05). Esses dados permitem inferir que a AngII atua na maturação nuclear dos oócitos bovinos ativando os receptores AT2 e que a via BK/receptor B2 não está envolvida nesse processo.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.