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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18496号 / 理博第4011号 / 新制||理||1578(附属図書館) / 31382 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 西村 いくこ, 教授 鹿内 利治, 教授 長谷 あきら / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.

Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome is described as a series of mutations within the lamin A gene leading to the accumulation of progerin in the nucleus, contributing to premature aging and affecting the epigenetic control. Epigenetic control, such as DNA methylation, relies on DNA methyltransferase enzymes. In human cells, heat shock (HS) leads to the formation of nuclear stress bodies (nSBs); ribonucleoprotein aggregates of Sat III RNA and RNA-binding proteins. The objectives of this study were to determine if epigenetic status induces varying responses to HS and assess the variability of nuclear proteins in similar conditions. Results show epigenetic modifications do not prevent a stress response; however the extent may be affected. In addition the functions of most nuclear antigens were not affected. It is most likely the sum of interactions at the inner nuclear membrane and nuclear lamina interface that result in nuclear strength pertaining to lamin A.

Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome is described as a series of mutations within the lamin A gene leading to the accumulation of progerin in the nucleus, contributing to premature aging and affecting the epigenetic control. Epigenetic control, such as DNA methylation, relies on DNA methyltransferase enzymes. In human cells, heat shock (HS) leads to the formation of nuclear stress bodies (nSBs); ribonucleoprotein aggregates of Sat III RNA and RNA-binding proteins. The objectives of this study were to determine if epigenetic status induces varying responses to HS and assess the variability of nuclear proteins in similar conditions. Results show epigenetic modifications do not prevent a stress response; however the extent may be affected. In addition the functions of most nuclear antigens were not affected. It is most likely the sum of interactions at the inner nuclear membrane and nuclear lamina interface that result in nuclear strength pertaining to lamin A.

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Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau. Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus. Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes. Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2. "Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2. Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2. En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire. Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire. / During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations. Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown. The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression. In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation. Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling. We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network. In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting. Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signalling

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.