Durant ce projet, nous nous sommes intéressés à une bactérie, D. radiodurans, un coque particulièrement connu pour ces extraordinaires capacités de résistance à différents facteurs de stress. Cependant, à cause de ses capacités de radiorésistance, cette bactérie a surtout été étudiée dans cette optique. Certaines caractéristiques de son cycle cellulaire restent méconnues, notamment (i) sa morphologie au cours de sa division ainsi que (ii) l’organisation et (iii) la ségrégation de son nucléoïde. Ces méconnaissances touchent aussi de façon plus générale toutes les bactéries de types coques, notamment de par la petite taille relative des bactéries qui a été un frein pour leurs études en microscopie photonique.Le but du projet de thèse est donc de mieux comprendre comment les bactéries sont capables d’avoir un nucléoïde très compacté, mais en même temps, dynamique et restant accessible pour les différents mécanismes tels que la réplication de l’ADN, sa transcription ou sa réparation. Dans ce but, nous avons exploré l’organisation en 4D ainsi que la dynamique du nucléoïde de D. radiodurans, en fonction du cycle de vie de la bactérie, de sa phase de croissance. Afin de réaliser ces objectifs, plusieurs stratégies ont été poursuivies : (i) des timelapses en 3D par microscopie confocale (ii) l’étude dynamique du nucléoïde par FRAP et par SptPALM, et (iii) la cartographie des protéines associées au nucléoïde réalisé par microscopie de super-résolution (PALM). / During this PhD work, we have studied on D. radiodurans, a coccus, known for its intriguing outstanding resistance to different stress factors. Studies on D. radiodurans have been mainly focusing on its tremendous radioresistance. 52 years after its discovery, its nucleoid organization/segregation as well as its cell morphology during its cell cycle still remain elusive. Most of our knowledge on the bacteria shape during division and on the nucleoid organization/segregation arises from the study of a small number of “model bacteria”, that are mainly rod-shaped or ovoid. In contrast, little is known on the nucleoid organization/segregation of cocci. Moreover, the small relative size of bacteria and of their nucleoids (<1µm3) has limited their studies by conventional microscopy.Thus, one of the aims of this PhD project is to contribute to a better understanding of the cell morphology and the nucleoid organization/segregation in cocci. For that matter, we explored the 4D organization and the dynamics of D. radiodurans nucleoids, as a function of the cell cycle progression and growth phase. In order to achieve the objective of this PhD, several strategies were undertaken: (i) timelapse 3D stacks by spinning confocal microscopy (ii) dynamics studies with FRAP analysis and SptPALM acquisitions, and (iii) cartographies of nucleoid associated proteins using super-resolution microscopy (PALM).

Les proteïnes bacterianes associades al nucleoide (NAPs) juguen un paper clau en l’organització, la replicació, la segregació, la reparació i l’expressió del cromosoma. L’estudi de nous membres de les famílies de NAPs, així com de proteïnes paràlogues a les ja conegudes, és important per entendre millor el seu paper biològic. Aquest projecte d’investigació té com a objectiu avançar en l’estudi de paràlegs a Escherichia coli de la proteïna Hha. Les proteïnes objecte d’estudi han estat YdgT, la subunitat θ de l’ADN polimerasa III (també anomenada en aquest treball HolE) i la proteïna YmgB. Pel que fa referència a YdgT, proteïna considerada fins al moment paràloga d’Hha, s’ha dut a terme una anàlisi transcriptòmica de mutants hha i ydgT per tal de comparar els corresponents patrons d’expressió gènica. Els mutants senzills hha i ydgT mostren un patró d’expressió gènica més diferent del que s’esperaria. De fet, el patró del mutant hha conté molts gens induïts mentre que en el mutant ydgT la majoria estan reprimits. Per tant, en general Hha té una funció repressora mentre que YdgT actuaria principalment com un activador. Dins del capítol dedicat a l’anàlisi de mutants hha i ydgT i durant l’estudi del fenotip del doble mutant hha ydgT, es van obtenir uns resultats prou rellevants com per ser considerats un nou apartat dins del present treball. Es tracta de la detecció i anàlisi de l’origen de clons no hemolítics que apareixen en mutants hha ydgT portadors del plasmidi hemolític pANN202-312R en plaques d’agar sang que contenen l’antibiòtic kanamicina. La presència de kanamicina (marcador de la mutació hha) és la causant de l’aparició de colònies sense halo d’hemòlisi. En el present estudi s’han identificat les regions per on es produeix l’escissió i s’ha observat que pertanyen a seqüències d'inserció IS91 parcials. Aquest procés s’ha estudiat també en una soca salvatge amb un plasmidi parental de baix número de còpies (pHly152) en presència de concentracions subinhibitòries de kanamicina i d’ampicil•lina. Pel que fa a la subunitat θ del nucli de l’ADN polimerasa III, s’ha detectat una similitud estructural amb la proteïna associada al nucleoide Hha. En aquest cas, també s’ha realitzat l’anàlisi transcriptòmica del mutant en aquesta subunitat (holE). Això ha permès comprovar que el conjunt de gens alterats en un mutant holE és molt més similar al del mutant ydgT que al del mutant hha. Una part significativa dels gens comuns alterats en els mutants holE i ydgT pertanyen a operons de motilitat, seqüències intergèniques i ARN petits. Aquests resultats i la recent publicació dels estudis que relacionen la sobreexpressió d’ydgT amb la complementació del fenotip de recuperació de la polaritat transcripcional en mutants rho, han permès atribuir també a la subunitat θ de l’ADN polimerasa III un paper en processos de terminació prematura de la transcripció. En el cas de la proteïna YmgB, els estudis duts a terme en aquest treball estableixen noves relacions entre aquesta proteïna i les proteïnes associades al nucleoide H-NS/Hha. Els resultats més interessants que aporta aquest treball s’han obtingut sobreexpressant ymgB. L’anàlisi de l’efecte de la sobreexpressió d’ymgB sobre el patró d’expressió de proteïnes ha permès evidenciar la regulació d’enzims relacionats amb la resistència a l’àcid (lisina descarboxilasa i glutamat descarboxilasa) i de la proteïna ribosomal L2, la qual sembla jugar un paper en la traducció. A més, la sobreexpressió d’ymgB té efectes sobre l’expressió de les proteïnes associades al nucleoide H-NS i Hha, així com sobre l’expressió de gens regulats per aquestes (bgl, proU i hly). / The bacterial nucleoid-associated proteins (NAPs) play a key role in the organization, replication, segregation, repair and expression of the chromosome. The study of new members of NAP families, as well as paralogue proteins of the ones which are already known, is important in order to understand their biological roles better. This research project aims to advance the study of paralogues of protein Hha in Escherichia coli. The proteins which were studied were YdgT, the θ subunit of DNA polymerase III and the protein YmgB. With regard to YdgT, a protein considered until now a paralogue of Hha, we carried out a transcriptomic analysis of hha and ydgT mutants and we compared the corresponding patterns of gene expression. We found out that in general Hha has a repressor function, while YdgT acts mainly as an activator. In the chapter which is dedicated to the analysis of hha and ydgT mutants and during the study of the phenotype of the double mutant hha ydgT, we obtained results relevant enough to be considered as a new section in the present work. This is the detection and analysis of the origin of non-hemolytic clones appearing in hha ydgT mutants carrying the hemolytic plasmid pANN202 312R in blood agar plates containing the antibiotic Kanamycin. Looking at the θ subunit of DNA polymerase III, initially we could detect a structural similarity to the Hha protein. In this case, we also performed a transcriptomic analysis of the mutant in this subunit (holE). This has revealed that the set of genes altered in a holE mutant is much more similar to the set of the ydgT mutant than the one of the hha mutant. A significant proportion of common genes altered in the holE and ydgT mutants belongs to motility operons, intergenic sequences and small RNA. These results and the recent publication of studies that link overexpression of ydgT to the complementation of the phenotype of recovery of transcriptional polarity in rho mutants, have allowed us to attribute to HolE a role in the process of premature transcription termination. Finally and regarding the protein YmgB, research conducted in this study establishes new relationships between this protein and nucleoid-associated proteins H-NS/Hha. The most interesting results provided by this study were obtained by overexpressing ymgB.