La synthèse du ribosome est un processus compliqué, très hiérarchisé et essentiel à toutes les cellules vivantes. La complexité de ce processus tient notamment au fait que les différentes étapes de la biogenèse du ribosome eucaryote sont temporellement et spatialement organisées dans des compartiments cellulaires différents (le nucléole, le nucléoplasme et le cytoplasme). Il est toutefois connu que le pré-ARNr 35S (le précurseur de trois des quatre ARNr, les ARNr 18S, 5.8S et 25S) est pris en charge dès sa synthèse par des facteurs impliqués dans sa maturation. Ainsi, la formation d’un ribosome requiert l’association, sur le transcrit naissant, des facteurs de synthèse, au nombre de 400. Ces facteurs essentiels interagissent transitoirement avec l’ARNr et ne font pas partie des particules ribosomiques matures impliquées dans la traduction. Leur rôle est d’assister le remodelage constant du pré-ribosome et le processus d’assemblage des sous-unités.<p>Parmi ces facteurs de synthèse, nous avons caractérisé en détail, chez la levure et chez l’homme, la protéine Las1 impliquée dans la maturation des deux extrémités de l’ITS2, séquence qui sépare les ARNr 5.8S et 25S/28S. Chez la levure, en absence de la protéine Las1, les analyses de profils de polysomes révèlent un déficit de sous-unité 60S et l’apparition d’« halfmères ». Les techniques de purification d’affinité et de gradient de sédimentation nous indiquent que Las1 est associée aux pré-ribosomes 60S et qu’elle interagit avec de nombreux facteurs de synthèse de la petite, de la grande sous-unité ou des deux. De plus, Las1 copurifie avec des pré-ribosomes qui contiennent aussi les exoribonucléases 5’-3’ Rat1/Rai1 et Xrn1. Rai1 coordonne la maturation aux deux extrémités de l’ARNr 5.8S. Nous suggérons que Las1 appartient à un macrocomplexe connectant spatialement des sites de clivages éloignés sur la séquence primaire du pré-ARNr qui seraient rapprochés suite au reploiement de l’ITS2.<p>Un autre aspect de ce travail de thèse consiste en l’étude de l’assemblage des particules ribonucléoprotéiques et plus spécifiquement du pré-ribosome et des sous-unités ribosomiques eucaryotes. Nous avons utilisé la technique d’immunoprécipitation de chromatine (Ch-IP) pour caractériser l’assemblage d’une structure appelée le « SSU processome ». Celui-ci correspond à un pré-ribosome en formation ainsi que l’assemblage des protéines ribosomiques sur l’ARNr naissant.<p>Enfin, nous avons étudié le rôle d’une plateforme d’activation de méthyltransférases d’ARN et de protéines, la protéine Trm112 dans la ribogenèse. Nous avons montré que chez la levure, Trm112 est impliquée dans la synthèse du ribosome et dans la progression de la mitose. En absence de cette protéine, les pré-ARNr sont dégradés par un mécanisme de surveillance. Trm112 copurifie avec plusieurs facteurs de synthèse du ribosome dont la méthyltransférase Bud23, impliquée dans la modification post-transcriptionnelle de l’ARNr18S. Trm112 est requise pour cette méthylation et nous postulons que la protéine Bud23 est incapable de se lier aux pré-ribosomes en l’absence de Trm112.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique qui nécessite de nombreuses étapes de maturation et de modification des ARNr ainsi que l’assemblage et le transport des RNPs précurseurs. Un ribosome mature contient une centaine de pièces, ARN et protéines confondus, mais son assemblage requiert l’intervention de plus de 400 facteurs de synthèse. De part le coût énergétique important de ce processus, plusieurs voies de régulation interviennent pour contrôler la biogenèse des ribosomes en fonction des conditions nutritives. L’une des voies les plus connue est la voie TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation agît principalement au niveau de la transcription des différents intervenants de la biogenèse :les ARNr, les protéines ribosomiques mais aussi les facteurs de synthèse. Ces facteurs, ayant une action transitoire dans la maturation des ribosomes, sont, par économie, recyclés pour la synthèse de nouveaux ribosomes. Nous nous sommes donc intéressés au devenir de ces facteurs, plus particulièrement de ceux intervenants dans la biogenèse de la petite sous unité, lorsque les conditions environnementales sont inadaptées à la croissance cellulaire. Ainsi, nous avons pu montré, pour quatre facteurs particuliers :Dim2, Rrp12, Hrr25 et Fap7, que leur localisation est dépendante de la synthèse ribosomique. Ainsi, lors de carence en sources nutritives, l’inhibition de la synthèse et de l’activité ribosomique entraîne un confinement de ces facteurs ribosomiques dans le nucléole ou dans des corps cytoplasmiques. En outre, la localisation particulière des facteurs ribosomiques Hrr25 et Fap7 dans les P-bodies en phase de croissance saturée laisse penser que ces corps cytoplasmiques sont le lieu de dégradation des pré-ribosomes lorsque les carences nutritives perdurent. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Promyelocytic leukemia protein (PML) is a tumour suppressor which is frequently downregulated in human tumours. PML plays a role in many cellular processes including DNA damage response, senescence and apoptosis and is mainly localized in special structures called PML nuclear bodies (PML NBs). The nucleolus is a key nuclear compartment, where transcription of ribosomal DNA and biogenesis of ribosomes take place. The nucleolus is also called a stress sensor because of its role, for instance, in stabilization of tumour suppressor p53. Localization of PML to the nucleolar periphery appears to be prominent after disturbance of nucleolar functions - for example inhibition of rRNA transcription or processing. Thus the relationship between the nucleolus and PML nuclear bodies may be important for cellular response to stress. However, the role of PML nucleolar associations in nucleolar function including mechanism of formation of these structures remain unclear. Here we characterised PML nucleolar structures and mechanism of their formation. We showed that formation of PML nucleolar structures is not caused by replication stress, is not dependent on any specific phase of cell cycle and is not caused by DNA damage response but is induced by topological stress due to inhibition of toposiomerase function....

1 Abstract: The diploma thesis focuses on study of sex chromosomes evolution and repetitive organized genes of chosen mygalomorph and araneomorph spiders. Spiders are characterized by complexicity of sex chromosome systems, their karyotypes contain multiple sex chromosomes X. Besides multiple X chromosomes they also contain a pair or two pairs of nondiferentiated sex chromosomes X and Y. The used methods include methods of classical cytogenetics (preparation of chromosome slides, C-banding) and methods of molecular cytogenetics (fluorescent in situ hybridization and comparative genome hybridization). Complex sex systems were discovered in the studied Theraphosidae spiders. In Theraphosidae spiders Atropothele socotrana and Poecilotheria vittata neo-sex chromosomes were found. Analysis of molecular differentiation of sex chromosomes suggests low differentiation of Y chromosome in neo-sex chromosomes and pair of nondifferentiated sex chromosomes XY. In haplogyne spider Kukulcania aff. hibernalis (X1X2Y), the Y chromosome was significantly differentiated, male specific signal covered the whole chromosome. Detection of 18S rDNA showed that karyotypes of majority of analysed Theraphosidae spiders and haplogyne spiders contain low number (1 or 2) of nucleolar organizing regions localized terminally, which...

Karyotypes of mygalomorph spiders are not satisfactorily known. This thesis is focused on the basic cytogenetic analysis of selected species of African clades of theraphosid mygalomorphs. It includes four subfamilies: Eumenophorinae, Harpactirinae, Ischnocolinae and Stromatopelminae. Diploid numbers, chromosome morphology, sex chromosome systems and chromosome behaviour in male germline in the selected species of African theraphosid subfamilies were studied. The findings support published results, that refer of high karyotype diversity in Theraphosidae. Diploid chromosome number reduction is probably a basic trend of theraphosid karyotype evolution. The majority of analysed species exhibited one, two or three sex chromosomes. In some species neo-sex chromosome systems were found. In some species one or two sex chromosome pairs (SCP), composed of chromosomes which lack morphological differentiation were detected. Nucleolus organizer regions were detected by fluorescent in situ hybridization in several species. Constitutive heterochromatin detection was performed by C-banding in two species. Keywords: constitutive heterochromatin, diploid number, karyotype, fluorescence in situ hybridization, Mygalomorphae, nucleolus organizer region, SCP, sex chromosome, spider, Theraphosidae

The dissertation deals with a cell response to genotoxic stress, specifically to anti-cancer treatments with a genotoxic mechanism of action. In principle, cells can respond to these perturbing stimuli in several ways: in case of severe DNA damage, they usually undergo apoptosis or enter senescence. In case of minor DNA damage, or upon defective checkpoint mechanisms, they may continue the cell cycle, either with successfully repaired DNA or with mutations of various kind. Thanks to selection pressure, the mutations that provide cells with a certain growth advantage under conditions of continuing genotoxic stress, gradually accumulate and render the tumor treatment-resistant. In my thesis, I focus on several aspects of this whole process. First, I participated in a characterization of a radioresistant and anoikis-resistant population of prostate cancer cells. This population was generated by irradiating cells 35 times by 2 Gy, a regime used in clinics. After this treatment, a population of low-adherent cells emerged that demonstrated increased expression of EMT- and stem cell markers. The low-adherent state of these cells was maintained by Snail signaling and their anoikis resistance by ERK1/2 signaling. Interestingly, after a protracted period of time, these cells were able to re-adhere and...

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Cytogenetics of mesothelid spiders is largely unkown. The presented diploma thesis is focused on the karyotype evolution of these spiders. As it is the most basal group of spiders, the analysis of its cytogenetics can bring important data about ancestral spider karyotype. In the framework of my thesis, I analysed diploid chromosome numbers, chromosome morphology, meiotic division, sex chromosomes and the pattern of selected molecular markers that were detected by fluorescence in situ hybridization. According to my results, mesothelid spiders have a high number of chromosomes and the prevalence of monoarmed chromosomes. Unlike other spiders, mesothelids have little differentiated sex chromosomes. Key words: evolution, spider, chromosome, karyotype, fluorescence in situ hybridization, nucleolar organiser region, sex chromosomes

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den morphologischen bzw. cytologischen Anomalien eines mutierten Klons 5/74/2 aus der haploiden Sorte `Kleiner Liebling` von Pelargonium zonale. An histologischen Schnitten wurden die Ploidiestufen verschiedener Zellschichten von Cytochimären durch Chromosomenzählung direkt bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die Epidermis in den Blättern vom Klon 5/74/2 verschiedene Ploidiestufen aufweist. Solche Variabilität trat in den L2- und L3-bürtigen Zellschichten nicht auf. Somit wurde hier erstmals eine Periklinalcytochimäre mit verschiedenen Ploidie in der Epidermis nachgewiesen. Es zeigte aber zwei unterschiedliche Zustände im Sprossscheiteln: Beim ersten sind die Zellen der L1 Polyploidie. Beim zweiten sind die Zellen der L1 haploid. Die Polyploidisierung der Epidermis setzt sich bei dem Wachstum des Blattes fort. Bei den cytologischen Untersuchungen wurden anomale Mitosen mit irregulären Chromsomenanordnungen (multipolare) und mehrkernige Zellen in der Epidermis beobachtet. Als weitere Anomalie traten eingeschnürte Zellkerne in den Epidermiszellen auf. Die Pflanzen mit stark behaarten und gekräuselten Blättern vom Klon 5/74/2 waren nicht stabil. Die Epidermis des gekräuselten und stark behaarten Blattes enthielt wie die des stark behaarten Blattes oder die des gekräuselten Blattes verschiedene Ploidiestufe. Die Epidermiszellen der meisten Pflanzen mit normal glatten Blättern lagen im diploiden Bereich. Die morphologische Kräuselung und Behaarung hing mit dem Auftreten der somatischen Variabilität in Epidermis von Klon 5/74/2 zusammen. Adventivpflanzen mit Hilfe eines modifizierten Mediums aus Kallus von Pelargonium zonale sind in in vitro-Kultur zu regenerieren. Dabei zeigte die Zugabe von Perlit und anschließend PVP die beste Wirkung gegen die Bildung von Polyphenolverbindungen im Pelargonium-Gewebe. TDZ ist einer der effektivsten Wuchsstoffe für die Kallusinduktion und Regeneration der Adventivsprosse bei Pelargonium. Die Blatt- und die Blütenfarbe der Adventivpflanzen aus dem dreifach markierten chimärischen `Weißer Liebling` (WRR, GWG, DHH) stimmten mit dem Genotyp der L1-Zellen überein. Die Stomatalängen der Adventivpflanzen aus dem Klon 5/74/2 (PHH) lagen wie die von `Weißer Liebling` (DHH) meistens im Bereich von diploid, nur selten von tetraploid oder gemischten. Die ursprünglich polyploiden und haploiden Zellen der kultivierten Gewebe traten nach der Regeneration nicht mehr auf. Dies weist auf eine Zellmutation und -selektion während der in vitro-Kultur hin. Aus chimärischen Geweben der GWG- und GGW-Varianten von `Mrs. Pollock` wurden 8,6% Adventivsprosse mit neuen chimärischen Blattmustern regeneriert. Das Ergebnis zeigt, dass die Zellen mindestens in L2 und L3-bürtigen Gewebeschichten der Explantaten zur Regeneration der Adventivsprossen teilgenommen haben. / A mutated clone with different ploidy levels in epidermis cells, 5/74/2, of the haploid `Kleiner Liebling` of Pelargonium zonale was investigated to answer the question that how the different ploidy levels were generated. Such a variability did not appear in L2- and L3-derived cells. Consequently, clone 5/74/2 is a periclinal cytochimera with a mixed ploidy epidermis. This type of cytochimera with different ploidy levels in epidermis has not been reported up to now. The epidermis of the blistered leaf or of the hairy leaf is polyploid with different ploidy levels, like the epidermis of the shoots with blistered and hairy leaves. Epidermis cells of normal shoots are diploid. The morphologically blistered leaf surface seems to be the result of a somatic variability in epidermis. Histological investigations of clone 5/74/2 showed two different ways of development of the somatic variability: the cells of the L1 in the apical meristem were already polyploid and the cells in the apical meristem were haploid. Cytological analyses revealed anomalies of the mitosis in epidermis cells of clone 5/74/2. Various irregular chromosomal arrangements (multipolar mitosis) and polynuclear cells were observed. Additionally, nuclei with constrictions were found. Adventitious shoots were successfully regenerated from callus of adult tissue of Pelargonium in vitro on modified medium. The combination of Perlit and PVP showed the best effects against the formation of phenolic substances on Pelargonium tissues during in vitro-culture. TDZ was the most effective substance for callus induction and regeneration of adventitious shoots. The colour of leaves and flowers in the adventitious plants regenerated from tissue of the triply marked chimera ’Weißer Liebling’ (GWG, WRR, DHH) were correlated with the genotype of L1. However, somaclonal variability of ploidy levels was observed. The size of stomata on adventitious plants from the clone 5/74/2 (PHH) was similar to from DHH-tissue, mostly in the range of diploid, only rarely in tetraploid or mixed ploidy. Derivates of the original polyploid and haploid cells of the cultivated tissue were not found. Evidently, cell selection and mutation occurred during the in vitro-culture. 8.6% Adventitious shoots with new chimeral patterns were regenerated from chimeral GWG- and GGW-explants of Pelargonium zonale `Ms. Pollock`. More chimeras from GGW explants were obtained than from GWG explants. This result showed that cells in both L2 and L3 derived tissues of the explants were involved in the regeneration of the adventitious shoots.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines catalysée par une famille d’enzymes : les poly(ADP-ribose) polymérases. Parmi les plus étudiées, PARP-1 et PARP-2 interviennent dans l’organisation, l’expression et le maintien de l’intégrité du génome. Nous avons initié l'étude d'un nouveau partenaire de PARP-1 préalablement identifié par double-hybride, et encore peu étudié à ce jour : HMG2L1 (High-Mobility Group protein 2 Like-1). La protéine humaine de 601 acides aminés contient un domaine HMG (High-Mobility Group) normalement impliqué dans l’interaction avec l’ADN. Quelques études ont montré que HMG2L1 régule la transcription en agissant comme co-régulateur négatif ou positif. Dans un premier temps, nous avons caractérisé le lien entre PARP-1 et HMG2L1. L’interaction avec PARP-1 a été confirmée in-vivo et in vitro. Nous avons montré que HMG2L1 pouvait également interagir avec PARP-2. HMG2L1 est poly(ADP-ribosyl)ée par PARP-1 et PARP-2, de même qu’elle est capable d’interagir avec le poly(ADP-ribose). La construction de formes tronquées de HMG2L1 en fusion avec la GFP nous a permis de montrer que le domaine N-terminal – en amont du domaine HMG – est impliqué dans ces interactions. Ce domaine N-terminal est très électropositif et intrinsèquement désordonné ce qui lui confère de nombreuses potentialités d’interactions. L’expression des fusions GFP dans des cellules HeLa nous a permis de montrer la localisation nucléaire et nucléolaire de HMG2L1, comme c’est le cas pour PARP-1 et PARP- 2. En outre, HMG2L1 colocalise avec UBF (Upstream Binding Factor), le facteur de transcription de l’ARN polymérase I responsable de la transcription des ARN ribosomaux. La surexpression de GFP-hHMG2L1 entraîne un stress nucléolaire caractérisé par l’inhibition de la transcription des ADNr et la formation de coiffes nucléolaires. Nous avons également entrepris une recherche de partenaires de HMG2L1 par spectrométrie de masse. De nombreuses protéines nucléolaires, impliquées dans la biogenèse des ribosomes ou la maturation des ARNs ont été identifiées, suggérant un rôle de HMG2L1 dans ces processus. Nous avons montré que la protéine purifiée interagit avec l’ADN via son domaine HMG principalement, et qu’elle interagit avec l’ARN via son domaine N-terminal. Mais surtout, nous avons mis en évidence une activité ARN-chaperonne, qui peut être régulée par le poly(ADP-ribose). La localisation de HMG2L1, son réseau d’interaction ainsi que son activité chaperonne nous laissent à penser qu’elle pourrait être impliquée dans des processus de maturation des ARN, régulés par la poly(ADPribosyl)ation. / Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins mediated by a family of enzymes called poly(ADP-ribose) polymerases. Among the best studied, PARP-1 and PARP-2 are both implicated into the transcription, organization and integrity of genome. We have initiated the characterization of a new PARP-1 partner previously identified in a yeast two-hybrid screen, and still poorly studied: HMG2L1 (High-Mobility Group protein 2 Like-1). The human protein of 601 amino acids contains one HMGbox domain normally implicated in the recognition of DNA. Some studies have reported the role of HMG2L1 in the regulation of transcription by acting as a negative or positive coregulator. First, we characterized the link between PARP-1 and HMG2L1. We confirmed the interaction between both proteins in vivo and in vitro. We also showed that HMG2L1 couldinteract with PARP-2. HMG2L1 is poly(ADP-ribosyl)ated by PARP-1 and PARP-2, and is able to interact with poly(ADP-ribose). The construction of GFP-fused truncated versions of HMG2L1 allowed us to show that the N-terminal part – upstream to the HMGbox – is responsible for all these interactions. This N-terminal domain is highly electropositive and intrinsically disordered conferring a lot of interactions potentialities. The expression of the GFP-fused proteins in HeLa cells allowed us to localizeHMG2L1 into the nucleus and the nucleolus, like PARP-1 and PARP-2. Moreover, HMG2L1 colocalizes with UBF (Upstream Binding Factor), the transcription factor responsible for the transcription of ribosomal ARNs by RNA polymerase I. The overexpression of GFPhHMG2L1 leads to a nucleolar stress illustrated by the inhibition of transcription and the formation of nucleolar caps. We also undertook a proteomic study to find new partners of HMG2L1. We found a huge amount of nucleolar proteins, involved in ribosome biogenesis or RNA maturation, suggesting that HMG2L1 could be involved in these processes. Finally, we demonstrated the ability of the purified protein to interact with DNA mostly through its HMGbox domain and RNA through its N-terminal domain. Moreover, we discovered that HMG2L1 is endowed with a RNA-chaperone activity, that can be regulated by poly(ADP-ribose). Taken together, the localization of HMG2L1, its interacting partners and its RNA chaperone activity allow us to make the assumption that HMG2L1 could be implicated in RNA maturation processes, regulated by poly(ADP-ribosyl)ation.