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Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines. / Assembly of chromatin is an essential process that concerns most DNA transactions in eukaryotic cells. The basic repeating unit of chromatin are nucleosomes, macromolecular complexes that consist of a histone octamer that organizes 147 bp of DNA in two superhelical turns. Although, the structures of nucleosomes are known in detail, their assembly is poorly understood. In vivo, nucleosome assembly is orchestrated by ATP-dependent remodelling enzymes, histone-modifying enzymes and a number of at least partially redundant histone chaperones. Histone chaperons are a structurally diverse class of proteins that direct the productive assembly and disassembly of nucleosomes by facilitating histone deposition and exchange. The currently accepted model is that nucleosome assembly is a sequential process that begins with the interaction of H3/H4 with DNA to form a (H3/H4)2 tetramer-DNA complex. The addition of two H2A/H2B dimers completes a canonical nucleosome. High-resolution structures of histone chaperons in complex with H3/H4 histones have resulted in detailed insights into the process of nucleosome assembly. However, our understanding of the mechanism of nucleosome assembly has been hampered by the as yet limited number of co-crystal structures of histone–chaperone complexes. In particular it remains unclear how histone chaperons mediate H2A/H2B deposition to complete nucleosome assembly. In this work, we have investigated the role of the H2A/H2B chaperon Nap1 (Nucleosome assembly protein 1) in nucleosome assembly. We have determined the crystal structure of the complex between Nap1 and H2A/H2B and analysed the assembly by various biophysical methods. The structure shows that a Nap1 dimer binds to one copy of H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). A large ~550 kDa macromolecular assembly containing 6 copies of the Nap12-H2A/H2B complex is seen in the asymmetric crystallographic unit. We confirmed by both non-denaturing mass spectroscopy and negative stain electron microscopy studies that this assembly is the predominant form of the Nap1_2-H2A/H2B complex in solution. We further investigated the potential interplay between p300-mediated histone acetylation and nucleosome assembly. Together, the structure and associated functional analysis provide a detailed mechanism for the Nap1 chaperon activity, its role in H2A/H2B deposition and in nucleosome assembly.

Mismatch repair corrects errors made during DNA replication and inactive mismatch repair is associated with Lynch Syndrome and sporadic cancer. Genome replication in eukaryotes is accompanied by chromatin formation. The first step in chromatin establishment is nucleosome assembly, that starts with histone tetramer deposition. It is not clear how three important cellular processes: genome replication, mismatch repair and nucleosome assembly are coordinated. Here we analyzed human mismatch repair in the presence of histone deposition in a reconstituted system. We showed that mismatch repair factor inhibits nucleosome assembly on the DNA region with the replicative error. Such a mechanism is important, since in this way DNA with errors remains accessible for mismatch repair system to perform the repair. The DNA synthesis step in mismatch repair is performed by DNA polymerase. Eukaryotes possess two major replicative DNA Polymerases: DNA Polymerase delta and DNA Polymerase epsilon. DNA polymerase delta is involved in mismatch repair. However, it was unknown whether DNA polymerase epsilon can also work in mismatch repair. Here we analyzed human mismatch repair with DNA Polymerase delta and DNA Polymerase epsilon in the environment of histone deposition. Our results indicated that repair activity with both polymerases was activated by histone deposition. Here it was first shown that human DNA Polymerase epsilon performs DNA synthesis during mismatch repair in vitro. Importantly, recent studies have revealed association of Polymerase epsilon mutations with cancer. Since our data showed activity of DNA Polymerase epsilon in mismatch repair, a possible tumor development mechanism may involve inactivation of mismatch repair due to Polymerase epsilon mutations. Overall, our study expanded the understanding of the mechanism of human mismatch repair in the chromatin environment.

Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines.

Eukaryotic promoters are inherently bidirectional and allow RNA Polymerase II to transcribe both coding and noncoding RNAs. Dynamic disassembly and reassembly is a prominent feature of nucleosomes around eukaryotic promoters. While H3K56 acetylation (H3K56Ac) enhances turnover events of these promoter-proximal nucleosomes, the chromatin remodeler INO80C ensures their proper positioning. In my dissertation, I explore how chromatin dynamics regulate transcriptional homeostasis. In the first part, I investigate the role of H3K56Ac on the nascent transcriptome throughout the eukaryotic cell cycle. I find that H3K56Ac is a global, positive regulator for coding and noncoding transcription by promoting both initiation and elongation/termination. On the contrary, I find that H3K56Ac represses promiscuous transcription following replication fork passage by ensuring efficient nucleosome assembly during S-phase. In addition, I show that there is a stepwise increase in transcription in the S-G2 transition, and this response to gene dosage imbalance does not require H3K56Ac. This study clearly shows that a single histone modification, H3K56Ac can exert both positive and negative effects on transcription at different cell cycle stages. In the second part, I investigate the role of the chromatin remodeler INO80C on the nascent transcription around replication origins. I show that INO80C, together with the transcription factor Mot1, prevents cryptic transcription around yeast replication origins, and the loss of these proteins lead to an increase in DNA double strand breaks. I hypothesize that recruitment of INO80C ensures proper positioning of nucleosomes around origins and the exclusion of RNA Pol II to prevent cryptic initiation. Together these findings indicate that H3K56Ac regulates transcription globally by enhancing nucleosome turnover, and it prevents cryptic transcription and reinforces transcriptional fidelity by promoting efficient nucleosome assembly in the S-phase. In addition, INO80C maintains genome stability by preventing cryptic transcription around the origins.