This thesis had two different parts: Yeast ecology and selection and adaptive mechanisms for fermentations at low temperatures.The aim of the first part was to study the yeast ecology of two Spanish wine regions (Terra Alta and Priorat). This study was used to select some yeasts for fermentation starters.This study confirmed that non-Saccharomyces species were limited to early stages of the fermentation, being the main species Candida stellata, whilst Saccharomyces dominated towards the end of fermentation. This study presented a large variability of Saccharomyces strains (a total of 112, all of them identified as S. cerevisiae). A classic selection with this high number of strains would have been very time-consuming. Thus, we used two criteria: massive competence during fermentation, to analyse the imposition of a strain over similar ones, and fermentation temperature. The temperature clearly determines the fermentation kinetics, the development of the Saccharomyces strains and the characteristics of the final wine.The selected strains were tested in cellars of both wine regions and as consequence, strain RV1 was selected to be sold commercially for the elaboration of red wines with high ethanol content.The aim of the second part was to study the effect of low temperature (13C) on the cell membrane fatty acid composition, production of volatile compounds and intracellular evolution of some metabolites (sugars, organic acids.)The optimal membrane fluidity at low temperature was modulated by changes in the unsaturation degree in S. cerevisiae. In S. bayanus, however, the change in the unsaturated fatty acid percentage was not observed at different growth temperatures but the percentage of medium-chain fatty acids at low temperatures was higher. Anyway, more strains should be tested to make any conclusion.In the study of intracellular metabolites, we observed that citric acid was the main intracellular acid in the middle stages of fermentation. However, tartaric acid, which was practically undetectable until mid fermentation, was clearly accumulated in the latter stages of the process. This accumulation was unexpected because this acid was not metabolised by S. cerevisiae.Further studies about the effect of the organic acids on the alcoholic fermentation were done. The most important result was that in a defined medium with ammonium sulphate as nitrogen source, an organic acid was necessary in order to prevent stuck fermentations. The effect of these acids on the fermentation seems to be not only related to its buffering capacity, but to the role of these acids inside the cells that remains unclear yet. Also, it is not known how these acids cross the membrane, although our results suggested a regulated transport.If instead ammonium, amino acids are used as nitrogen source, the fermentation finished without problems in absence of organic acids and the acidification of the media was lower. This lower acidification by amino acids was caused by a different transport mechanism of these compounds inside the cells. The nitrogen source also influences the cell fatty acid composition and the production of volatile compounds. / Esta tesis consta de dos partes bien diferenciadas: una primera parte de Ecología y selección de levaduras y una segunda parte de Mecanismos de adaptación a bajas temperaturas.La primera parte consistía en realizar un estudio ecológico de dos zonas vitivinícolas de la provincia de Tarragona, las Denominaciones de Origen (D.O.) Terra Alta y Priorat como paso previo para una posterior selección de levaduras para su utilización como iniciadores de fermentación en procesos industriales en estas dos D.O.s o en fermentaciones con características similares. En este estudio ecológico, la especie mayoritaria durante los primeros días de fermentación fue Candida stellata, pero a partir del 3er o 4º día, como era de esperar, se impusieron las cepas de Saccharomyces. La variabilidad de cepas de Saccharomyces detectada fue muy elevada, ya que se identificaron 112 cepas diferentes de Saccharomyces cerevisiae entre las dos D.O.s. A causa de la gran variabilidad obtenida, como criterios de selección se utilizaron principalmente dos: fermentaciones masivas por competencia, es decir, capacidad de imposición de unas cepas sobre otras similares, y la temperatura de fermentación. La temperatura se eligió porque se trata de una variable que influye de forma muy clara en la cinética de fermentación, en la imposición de las cepas de Saccharomyces y en el producto final.Con las cepas seleccionadas se hicieron pruebas de fermentación en bodega. A partir de las cuales, la Universidad Rovira i Virgili registró una cepa, que posteriormente ha sido comercializada por la empresa Lallemand como RV1, seleccionada para la elaboración de vinos tintos con elevado grado alcohólico.En la segunda parte se estudiaba el efecto de la bajas temperaturas (13C) sobre la composición de ácidos grasos de membrana, la producción de compuestos volátiles y la evolución intracelular de algunos metabolitos (azúcares y ácidos orgánicos). La óptima fluidez de la membrana a bajas temperaturas por parte de las células parece mantenerse de forma diferente por las especies de Saccharomyces. Mientras las cepas de Saccharomyces cerevisiae mantienen un grado de insaturación mayor, la cepa de Saccharomyces bayanus aumenta su porcentaje de ácidos grasos de cadena media. Más cepas de ambas especies deberían estudiarse para sacar conclusiones definitivas.En el estudio de los metabolitos intracelulares, por su parte, se observó que hasta mitad de fermentación el ácido mayoritario en el interior de la célula era el ácido cítrico mientras que a final de fermentación era el ácido tartárico. Este último dato era interesante porque el ácido tartárico es un ácido que no es utilizado por Saccharomyces.Estudios más exhaustivos sobre el efecto de los ácidos orgánicos en la fermentación alcohólica se realizaron, en los que se observó que en un medio definido en el que la fuente de nitrógeno era sulfato amónico, se necesitaba un ácido orgánico para evitar una parada de fermentación. El efecto de estos ácidos en el buen funcionamiento del proceso parece no estar únicamente relacionado con su capacidad de tamponante. De todas maneras, los otros beneficios ocasionados por los ácidos orgánicos a la célula nos son actualmente desconocidos, así como si Saccharomyces regula el transporte del ácido tartárico, aunque nuestros resultados apuntan hacia esta posibilidad. En cambio, si la fuente de nitrógeno son aminoácidos en lugar de amonio, la fermentación finaliza sin problemas en ausencia de ácidos orgánicos y la acidificación producida en el medio es menor. La causa de esta menor acidificación hay que buscarla en el transporte de ambas especies al interior de la célula. La fuente de nitrógeno también tiene una gran influencia en la composición de ácidos grasos de membrana, así como en la producción de compuestos volátiles.

Title: Evaluation of factors affecting must composition in the development of alcoholic fermentation at low temperatures Josep M. Llauradó i Reverchon under the guidance of Dr. Albert Mas i Barón and Dra. Magdalena Constantí i Garriga.Departament de Bioquímica i BiotecnologiaDefended/Presented on the 23rd of October 2002The alcoholic fermentation at low temperatures (< 15 ºC) results in more aromatic wines with paler colour, characteristics highly appreciated in white and rose wines. Although this enological practice is well established in some European traditional processings (Sauternes, Jura, Amarone, Vinosanto, second fermentation of sparkling wines), low temperature fermentations can be problematic in musts from southern regions. These musts have typically a high sugar content and a low nitrogen availability for yeast. In addition, at low temperatures, a higher competition for nutrients occurs between the inoculated yeast and the non-Saccharomyces species. Altogether can result in stucked or delayed fermentations.In this work the nitrogen composition of five varieties of fresh must (white Grenache, Chardonnay, Pinot Noir, Carinyena and Riesling) were characterized as well as their respective microfermentations (500 mL) evaluating the variety effect, the temperature (13 ºC and 17 ºC) and the addition of yeast nutrients, on the fermentative kinetics. A new empirical parameter was designed for this study (R). The calculation of R is based on the nitrogen content of some neutral amino acids and the initial sugar concentration. A correlation between the value of R and the maximum rates in all the fermentations was observed, therefore R could be considered as an estimator of the fermentability of must. Low temperature of fermentation (13 ºC) reduced the amounts of ethyl acetate, acetaldehyde and acetic acid. On the other hand, yeast nutrients showed a clearly incidence in the composition of the higher alcohols, limiting their production.According to the previous results Carinyena presented the most difficult fermentations, hence fresh must of this variety was used in a second experiment. The must was supplied with several combinations of yeast nutrients (diammonium hydrogen phosphate and Fermaid K) and inoculated with different commercial yeast strain. A slight sinergic effect of the addition of both yeast nutrients was observed depending on the yeast strain inoculated. In addition, the yeast nutrients enhanced the imposition of the inoculated yeast strain in a must with a significant initial population of wild yeast. The presence of wild yeast, specially Candida stellata, caused changes in the differential consumption of glucose and fructose. The addition of yeast nutrients reduced the amount of acetic acid and increased glycerol content; those modifications were different depending on the inoculated yeast strain.Two commercial yeast strains were pre-adapted to the fermentation temperature (13 ºC and 17 ºC). Their fermentative kinetics were compared to those carried out at 25 ºC (fermentation starter effect) with yeasts simply rehydrated and with a cryotolerant strain. A fermentative improvement was observed due to the temperature pre-adaptation dependent on the yeast strain. Furthermore, the temperature adaptation had an incidence on the composition of secondary products that may affect the quality of wines. / Títol: Avaluació dels condicionants del most en el desenvolupament de la fermentació alcohòlica a baixes temperaturesJosep M. Llauradó i Reverchon sota la direcció del Dr. Albert Mas i Barón i de la Dra. Magdalena Constantí i Garriga.Departament de Bioquímica i BiotecnologiaPresentada el 23 d'Octubre del 2002 La fermentació alcohòlica a baixes temperatures (< 15 ºC) permet obtenir vins amb major aroma i més pàl·lids, trets apreciats en els vins blancs i rosats. Malgrat que les fermentacions alcohòliques a baixes temperatures estan ben integrades a elaboracions tradicionals europees (Sauternes, Jura, Amarone, segona fermentacions de escumosos), aquestes solen ser problemàtiques (aturades i alentiments) per a mostos meridionals. Aquests es caracteritzen per uns graus probables alts i continguts de nitrogen disponible per als llevats pobres. Juntament a la menor capacitat fermentativa dels llevats inoculats i a la major competència pels recursos dels llevats no-Saccharomyces a baixes temperatures fa que es doni moltes vegades problemes de fermentació a baixes temperatures dels mostos meridionals. Es van caracteritzar la composició nitrogenada de cinc varietats de most fresc (Garnatxa blanca, Chardonnay, Pinot noir, Carinyena i Riesling) així com les microfermentacions respectives (500 ml) avaluant l'efecte de varietat, temperatura (13 ºC i 17 ºC) i la suplementació d'adjuvants nutritius, sobre la cinètica fermentativa. Es va troba un paràmetre empíric que té en compte la concentració inicial de sucre i la de nitrogen d'alguns aminoàcids neutres, paràmetre que correlaciona amb las velocitats màximes observades per a totes les fermentacions, i per tant poden considerar-se com un estimador de la fermentabilitat d'un most. Les baixes temperatures de fermentació (13 ºC) van reduir les quantitats d'acetat d'etil, àcid acètic i acetaldéhid. Per una altra banda, els adjuvants nutritius tenen una clara incidència en la composició dels alcohols superiors, de manera que es limita la seva producció. En un segon experiment, es va utilitzar un most fresc de la varietat Carinyena, al ser aquesta la més problemàtica en l'assaig anterior. Es van provar combinacions de adyuvants (fosfat de diamoni i Fermaid K) que suplementaven el most i es van inocular amb diferents soques de llevats comercials. S'observà un lleuger efecte sinèrgic de l'afegiment dels dos adyuvants que depenia de la soca inoculada. Així mateix, els adjuvants afegits permetien una major imposició de la soca de llevat inoculada, en un most amb una càrrega inicial de llevats nadius important. La gran presencia de llevats nadius, i en concret de Candida stellata fa que variï el consum diferencial de glucosa i fructosa. En els vins, els adjuvants permeten reduir les quantitats d'àcid acètic, i augmentar les de glicerol, aquest darrer fet dependent de la soca inoculada. Es van pre-adaptar a la temperatura de fermentació (13 ºC y 17 ºC) dues soques de llevats comercials i van comparar les respectives cinètiques fermentatives amb les portades a terme amb el llevat crescut a 25 ºC (efecte peu de cub), amb els llevats simplement re-hidratats i amb soca criotolerant. Es detecta una millora fermentativa pel fet de pre-adaptar a la temperatura de fermentació que és dependent de la soca de llevat. També la pre-adaptació té una incidència sobre la composició dels productes secundaris de manera que influiria directament sobre la qualitat dels vins.

Alcoholic fermentation is a process mainly characterised by several factors that induce yeast stress response (low pH, high osmotic pressure, low nitrogen content, etc). Thus, stress response is essential to yeast in order to assure its survival, adaptation and growth, in both natural habitats and industrial conditions such as winemaking. One of the main features to optimise and improve alcoholic fermentation is the establishment of metabolic and physiological changes by the yeast just after must inoculation. In this early phase, yeast must quickly change its metabolism to achieve maximum advantage in the new growth medium. Oenological industry uses selected active dry wine yeast (ADWY) to inoculate the musts in order to get a better control over the fermentation process. Those dry yeasts have to be rehydrated before must inoculation. Therefore, yeast rehydration is the first step to ensure healthy cells and a good fermentation performance. The knowledge of the early yeast metabolic responses, from a biochemical and physiological point of view, were the main objectives of this thesis. The studied objectives were: Analysis of trehalose and glycogen metabolism (reserve carbohydrates) in a commercial wine yeast strain, considering these carbohydrates markers of stress response. Study of their metabolism in winemaking conditions, taking into account the fermentation temperature (low 13ºC and control 25ºC), nitrogen content (low 60 mg/l, control 300 mg/l and high 1200 mg/l) and the ADWY rehydration and pre-adaptation. Determination of early transcriptional responses of yeast just after must inoculation. It was considered the presence of glucose and fructose, the osmotic shock and the yeast metabolic activation, including the presence of the drug Cycloheximide, which is an inhibitor of protein synthesis. Characterisation of the standard protocol of ADWY rehydration in an oenological context, which is rehydrate in warm water (37ºC) during 30 minutes.Low fermentation temperatures affected fermentation kinetics, but not induced any additional stress response. In fact, high levels of trehalose were accumulated at control temperature than at 13ºC. In industrial conditions, after a period of pre-adaptation before inoculation, carbohydrates were completely depleted once yeasts were inoculated into the must. Their synthesis started simultaneously with a change in the phase of growth, from exponential to stationary, coinciding with nitrogen depletion. We also studied rehydration and characterised the early response to synthetic must but also to relevant conditions that ADWY must cope after inoculation (osmotic shock, presence of carbon sources). Glycogen content did not presented any change. However, trehalose was early mobilised in those media capable to ensure yeast growth. The effect of nitrogen availability upon trehalose metabolism was also studied. Neither glucose nor nitrogen exhaustion were involved in the regulation of trehalose metabolism. TPS1 (gene which codifies for trehalose-6-phosphate synthase) was induced just before trehalose accumulation, simultaneously with growth arrest. Microarray technique was used to determine whole gene expression after rehydration and in the same conditions previously studied. We can conclude that 30 minutes of rehydration in water is enough for the yeast to fully recover and that longer times in this medium are detrimental. The yeast transcriptional switch is the presence of fermentable sugars, and this is mostly related to ribosome and protein synthesis, glycolysis and ethanol synthesis. / La fermentació alcohòlica és un procés bàsicament caracteritzat per una sèrie de factors que indueixen estrès al llevat, el microorganisme responsable de la seva consecució. La resposta a estrès per part del llevat és essencial per a la seva supervivència, adaptació i creixement, tant en medis naturals com en processos industrials (enologia). Una de les principals característiques per a l'optimització de la fermentació alcohòlica és l'establiment de canvis metabòlics i fisiològics del llevat just després de la inoculació en el most. És en aquesta fase inicial quan el llevat ha de canviar ràpidament el seu metabolisme per tal d'adquirir el màxim d'avantatge en el nou medi de creixement. La indústria enològica disposa de llevats secs actius (LSA) seleccionats que s'inoculen al most per tal d'assolir un millor control sobre el procés fermentatiu. Aquests llevats secs requereixen d'una rehidratació prèvia a la inoculació en el most. La rehidratació és el primer pas per tal d'assegurar el bon estat cel.lular i una bona fermentació alcohòlica. El coneixement de les respostes metabòliques inicials del llevat des d'un punt de vista bioquímic i fisiològic foren els objectius fonamentals d'aquest treball. Els objectius van ésser:- Anàlisi del metabolisme de trehalosa i glicogen (carbohidrats de reserva) en una soca de llevat comercial, com a indicadors de resposta a estrès. Estudi del metabolisme en condicions víniques, considerant com a variables la temperatura de fermentació (baixa, 13ºC i control, 25ºC), contingut en nitrogen (baix 60 mg/l, control 300 mg i elevat 1200 mg/l) i la rehidratació i preadaptació del LSA.- Determinació de les respostes transcripcionals inicials del llevat immediatament després de la seva inoculació en el most. Es va considerar la presència de glucosa i fructosa, el shock osmòtic i l'activació metabòlica del llevat, incloent la presència de cicloheximida, un inhibidor de la síntesi proteica.- Caracterització del protocol estàndard de rehidratació del llevat dins el context enològic, que és la utilització d'aigua a 37-40ºC durant 30 minuts. Les baixes temperatures de fermentació van incidir sobre la cinètica fermentativa, però no sobre una resposta a estrès. De fet, es va trobar major acumulació de trehalosa a temperatura control que a 13ºC. En condicions industrials, després d'un període d'adaptació previ a la inoculació (peu de cuba), els nivells de carbohidrats van ser nuls. La seva síntesi es va produir al canvi de fase exponencial a estacionària, coincidint amb l'esgotament de nitrogen. Es va estudiar la rehidratació i permanença en diferents medis (aigua, glucosa/fructosa, most sintètic i sorbitol). La concentració intracel.lular en glicogen no presentà cap modificació. Però la trehalosa es va metabolitzar en les fases inicials, en aquells medis favorables per al creixement del llevat.Es va estudiar l'efecte de la disponibilitat de nitrogen sobre el metabolisme de la trehalosa. Independentment del contingut nitrogenat, el seu metabolisme no es va veure modificat. TPS1 (gen que codifica trehalosa-6-fosfat sintasa) es va induir just abans de la acumulació de trehalosa, coincidint amb l'aturada del creixement cel.lular. Mitjançant la tècnica dels "microarrays" es va determinar l'expressió gènica global del llevat després de rehidratar i romandre en els medis anteriors. Podem concloure que el temps de rehidratació utilitzat en enologia assegura la total recuperació de LSA. Temps més llargs afectaren negativament la fisiologia del llevat, reduint significativament la seva vitalitat. Les modificacions transcripcionals al most foren degudes bàsicament a la presència de glucosa i fonts nitrogenades, induint la síntesi proteica, glucòlisi i producció d'etanol.

El carbamato de etilo (CE) es un conocido carcinógeno animal presente en alimentos y bebidas fermentados. El principal precursor involucrado en la formación de CE en los vinos es la urea, producida por el metabolismo de la arginina por las levaduras. Se sabe también que las bacterias lácticas (BL) pueden formar en los vinos precursores del CE, citrulina y carbamil-fosfato, a partir del metabolismo de la arginina, aunque no es ampliamente aceptada la afectación de las BL y de la fermentación maloláctica (FML) sobre la formación del CE. El principal objetivo de la presente tesis era comprender más extensamente los distintos factores que influyen en la formación del CE durante la FML con el fin último y primordial de encontrar pautas que nos permitan prevenir la formación de CE y de sus precursores. Evidenciamos que ni la realización de la FML sobre lías ni la conservación del vino por 12 meses afectaron los niveles de CE de los vinos. Aunque el desarrollo de la FML y un mayor tiempo de exposición con los hollejos durante la fermentación alcohólica (FA) no influyeron los niveles de CE en los vinos, sí provocaron un aumento del CE potencial (CEP). También comprobamos que la variedad de uva y el tiempo de duración de la FML influyen en las concentraciones de citrulina que se forman en los vinos. La cepa comercial utilizada para conducir la FML también influye sobre los niveles de CEP al evidenciar éstas diferente capacidad para degradar la arginina. El catabolismo de la arginina aumentó el crecimiento de Oenococcus oeni en algunas condiciones que favorecen su metabolismo, concretamente, un pH vínico elevado. En estas condiciones el rango de conversión de arginina a citrulina fue mayor, así como el contenido en CEP, que correlacionó directamente con el aumento en el contenido de citrulina al final del consumo del ácido L-málico, lo que señala a la citrulina como un buen previsor de las concentraciones de CE. La degradación de la arginina siempre fue retrasada con respecto a la degradación del ácido L-málico en todas las cepas testadas en vino simulado. La cepa ensayada de Lactobacillus plantarum no fue capaz de degradar la arginina y no excretó citrulina en las diferentes condiciones estudiadas, aunque los niveles obtenidos de CE fueron similares a los alcanzados por las cepas de O. oeni. Encontramos correlación entre los niveles de CEP al final de la fermentación alcohólica (FA) y al final de la FML y los niveles nitrogenados de mostos y vinos. También las concentraciones de glicerol al final de la FA y la acidez de mostos y vinos correlacionaron con los niveles de CEP al final de la FA y al final de la FML respectivamente. / Ethyl carbamate (EC) is a well-known animal carcinogen found in fermented foods and beverages. The major precursor involved in EC formation in wine is urea, produced by the metabolism of arginine by yeast. It's also know that lactic acid bacteria (LAB) may form precursors of EC in wine, citrulline and carbamyl-phosphate, from arginine metabolism, although it is not widely accepted the involvement of LAB and malolactic fermentation (MLF) on EC formation. The main objective of this thesis was to fully understand different factors that influence EC formation during MLF with the purpose of finding patterns that allow us to prevent EC formation in wines. We found that neither the execution of MLF on yeast lees or wine storage for 12 months affected EC levels of wines. The development of MLF and a longer exposure time with the skins during alcoholic fermentation (AF) did not affect EC levels in wine, but they caused an increase in potential EC. We also found that grape variety and the duration of MLF influence citrulline concentrations in wines. Malolactic starter used for induction of MLF in wine also influences potential EC levels because they show different capacity to degrade arginine. Arginine degradation favours the growth of Oenococcus oeni in some conditions. The good correlation obtained between citrulline and potential EC allows us to use the citrulline produced during the bacterial metabolism of arginine during MLF to predict the levels of potential EC at the end of L-malic acid degradation. In those cases in which L-malic acid was degraded completely, arginine degradation was delayed in comparison to L-malic acid degradation in all strains tested. This has oenological importance because it means that the winemaker can prevent arginine degradation by removing cells or inhibiting cell activity after the L-malic acid degradation in wine is over. Although virtually no citrulline was produced, the potential EC obtained in assays with tested strain of Lactobacillus plantarum was comparable to that of Oenococcus strains studied. We found a correlation between potential EC levels at the end of alcoholic fermentation (AF) and at the end of MLF and nitrogen levels in musts and wines. Also the concentration of glycerol at the end of AF and acidity of musts and wines correlated with potential EC levels at the end of AF and at the end of MLF, respectively.

En esta tesis se han estudiado diferentes métodos de conservación de la leche materna (leche de la propia madre) y/o humana (leche de otra madre sana), concluyendo que las muestras de leche pueden conservarse en el refrigerador a 4ºC hasta un máximo de 3 horas, en el congelador a -20ºC hasta un máximo de 5 meses y en el ultracongelador a -80ºC hasta un máximo de 8 meses con la finalidad de preservar los niveles iniciales de vitaminas C y E y los niveles de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL) muy importantes para el recién nacido como son el ácido docosahexaenoico y el ácido araquidónico. En el caso de prolongar estos periodos de conservación, se recomienda añadir vitamina C a la leche. Igualmente, se analizaron los dos métodos de pasteurización de la leche humana más usados en los bancos de leche de Norte América, de UK y de Brasil, concluyendo que el método de pasteurización lento (62.5ºC durante 30 minutos) producía menos pérdidas de vitamina C total y de alfa- y gamma-tocoferoles que el método rápido (100ºC durante 5 minutos). Estos dos estudios de conservación dieron lugar a dos publicaciones. Para poder realizar los estudios anteriores, se pusieron a punto tres métodos analíticos que dieron lugar a tres publicaciones: uno para la determinación y cuantificación de la vitamina C, otro para la determinación y cuantificación de la vitamina E y el último para la extracción de la grasa de la leche humana. Igualmente, se estudió la estabilidad oxidativa de fórmulas lácteas con diferentes niveles de AGPI-CL (concretamente de ácido docosahexaenoico, DHA y ácido araquidónico, AA) almacenadas a diferentes temperaturas, a través de analizar sus principales AGPI-CL, los niveles de hidroperóxidos y de compuestos volátiles producidos y de realizar ensayos organolépticos dúo-trio y de comparación por parejas. En este estudio, que dio lugar a una publicación, se encontró que al incrementar la temperatura de almacenamiento y/o la suplementación con AGPI-CL, incrementaba la oxidación de la muestra. Para realizar la determinación de los compuestos volátiles se puso a punto un método analítico de Cromatografía de Gases en espacio en cabeza que dio lugar a otra publicación. Finalmente, se estudió si existían diferencias en la conversión del ácido alfa-linolénico a DHA entre ratas Wistar macho, hembras vírgenes y hembras embarazadas., concluyendo que dicha conversión fue más elevada en las hembras vírgenes que en los machos, y más elevada en las hembras embarazadas que en las vírgenes y que en los machos. Este estudio se realizó a la Universidad de Southampton, UK y dio lugar a una publicación que está pendiente de enviar. / This thesis examines different methods of conservation of human milk. We conclude that it can be conserved in a refrigerator at 4ºC for a maximum of 3 hours, in a freezer at -20ºC for a maximum of 5 months and in an ultrafreezer at -80ºC for a maximum of 8 months without compromising the initial levels of vitamin C and E or the long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) such as docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (AA). For longer periods of conservation, it is recommended to add vitamin C. Moreover, the pasteurization methods usually applied in the milk banks of North America, UK and Brazil were analyzed, concluding that the slow method (62.5ºC, 30 min) produced lower losses of vitamin C and E than the fast method (100ºC, 5min). Moreover, the oxidation stability of milk powder formulas with different levels of LC-PUFA (DHA and AA) was determined. They were stored at different temperatures for 15 months. The main LC-PUFA, the peroxide value and the volatile compounds produced were analyzed and sensory analyses (duo-trio and pair comparison tests) were performed. Increasing the storage temperature or supplementation with LC-PUFA led to an increase in the oxidation of the sample. Finally, we examined possible differences in Wistar rats between males, virgin females and pregnant females in the conversion of alpha-linolenic acid to DHA. We conclude that this conversion was greater in virgin females than in males, and greater in pregnant females than in virgins. This study was performed at the University of Southampton, UK.

La composición lipídica del organismo humano refleja la formación endógena de lípidos así como la ingesta procedente de la dieta. Un exceso calórico no sólo de lípidos, sino también de los otros macronutrientes, puede conducir a un aumento de los factores de riesgo de enfermedad cardiovascular, que es en la actualidad la principal causa de mortalidad en las sociedades industrializadas. La creciente evidencia científica sugiere que ciertos patrones alimentarios pueden influir de forma favorable en los factores de riesgo cardiovascular. Uno de estos patrones de dieta saludable es la denominada "Dieta Mediterránea Tradicional", caracterizada por un consumo de aceite de oliva como fuente principal de lípidos. La incidencia durante los últimos años en las poblaciones europeas de la enfermedad cardiovascular y patologías relacionadas como la obesidad, sugiere una desviación de los "patrones alimentarios prudentes" a los denominados "patrones occidentales", caracterizados por elevadas ingesta de grasas, carne y cereales refinados. Este hecho plantea la necesidad de preservar y promover la dieta mediterránea tradicional en la población europea, sin excepción de los países mediterráneos que le han dado origen. Por ello, en esta tesis se evaluó el estado nutricional, así como el grado de cumplimiento de los actuales objetivos nutricionales nacionales y europeos, y del patrón alimentario mediterráneo en la población catalana actual. Como biomarcadores biológicos específicos del perfil lípidico, se estudió la composición de ácidos grasos plasmáticos, totales y de fosfolípidos de una muestra representativa de la población catalana. La técnica analítica utilizada fue la cromatografía de gases rápida, campo en el que se pusieron a punto tres novedosos métodos análiticos. Esta tesis permitió identificar los alimentos que contribuyen en mayor medida al porcentaje de energía procedente de los lípidos en la población catalana actual. El aceite destacó con un 7% de energía relativo a los lípidos totales, y el queso en cuanto a la grasa saturada, a diferencia de los productos lácteos, que eran los mayores contribuyentes de grasa saturada en la pasada década en esta población. La evaluación del índice de calidad de la dieta mediterránea mediante un enfoque metodológico a priori concluyó que un 64% de la población catalana se halla en el rango de cumplimiento de las características principales de la dieta mediterránea, presentando tan sólo un 5% de la población una baja adhesión a este patrón alimentario. En cuanto al grado de cumplimiento con los objetivos nutricionales, conviene destacar el elevado porcentaje de cumplimiento en relación a las frutas y verduras, superior al 75%, y el bajo porcentaje en cuanto a hidratos de carbono, inferior al 3% en cuanto a las recomendaciones europeas de aportar un 55% de la energía diaria. También se concluyó que las mujeres presentaban mayor grado de cumplimiento en relación a los ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados, atribuible a su mayor consumo de aceite de oliva y de pescado respectivamente. Según los resultados obtenidos, la ingesta media de pescado en la población catalana es del orden de 80 g/dia, siendo tan sólo un 25% debido a pescado azul, que es el más rico en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. La relación entre el contenido plasmático de EPA y DHA y los factores de riesgo cardiovascular clásicos mostró una relación inversa significativa entre el EPA y los niveles de colesterol total, trigliceridos e insulina, pero ninguna relación con los niveles de DHA. Paralelamente se estudió el efecto de un consumo moderado de aceite de oliva, principal componente de la dieta mediterránea, en individuos de cinco poblaciones europeas con diferentes hábitos alimentarios, concluyéndose que 25 ml/día de aceite de oliva pueden ser una herramienta útil para disminuir la presión sistólica en hombres europeos. / The lipid composition of the human body reflects the endogenous lipid formation as well as the dietary lipid intake. An excess of energy, not only from lipids but also from the other macronutrients can lead to an increase in the cardiovascular disease risks.The increasing scientific evidence suggests that some dietary patterns can positively influence CVD risk factors. Among the healthy dietary patterns the Traditional Mediterranean Diet is highlighted. There is a need to maintain and promote this diet in the European population, without exception of the Mediterranean countries where it originated. This thesis focused on the evaluation of the nutritional status, compliance with the current European and national nutritional objectives, and adherence to the Mediterranean Diet by the current Catalan population. As specific biomarkers of the lipid profile, the fatty acid profile in total and phospholipids was evaluated in plasma. The analytic technique in use was fast gas chromatography, having developed three new analytic methods in this research field. The thesis allowed the identification of those foods which contribute most to the lipid profile in the current Catalan diet. Oil was the major contributor with 7% of relative energy from total lipids. Cheese is the food that contributes to the current Catalan diet with a higher percentage of saturated fat energy. The evaluation of the Mediterranean Quality Dietary Index in the representative Catalan sample suggested an appropriate adherence of the Catalan population to the Mediterranean dietary pattern. Furthermore, the current Catalan population follows most of the Spanish and European nutritional objectives. An increase of the carbohydrate intake should be recommended due to the fact that less than 3% accomplish the European nutritional objectives for this macronutrient. Nevertheless, a high compliance of fruit and vegetable intake was highlighted. According to our results, blue fish intake was estimated in only one portion per week, implying a future need to promote an increase in its consumption. In addition, the multicentric randomized cross-over study in 5 European populations, concluded that a moderate olive oil administration of 25 ml/day could be a useful tool to reduce the blood pressure in healthy men from European populations.

Con el objetivo de hacer los preparados para lactantes lo más parecido posibles a la leche materna, éstos se suplementan con ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA), principalmente araquidónico (AA) y docosahexaenóico (DHA), que son importantes para el óptimo desarrollo cerebral y visual del lactante. Por otro lado los LC-PUFA son muy susceptibles a la oxidación en este tipo de productos. En este trabajo se evalúa la estabilidad en diversos preparados para lactantes en polvo suplementados con diferentes fuentes de LC-PUFA: fosfolípidos de huevo, aceite de pescado microencapsulado y aceites sintetizados por microorganismos unicelulares. Además se estudian diversas fórmulas infantiles comerciales. / In order to bringing the composition of infant formula closer to that human milk, it is supplemented with long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA), mainly arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA), which have an important role for the optimal visual and neural development of the newborn. In the other hand LC-PUFA are very susceptible to oxidation in this kind of food products. In this work it is evaluated the stability of several infant milk-base formulae supplemented with different sources of LC-PUFA: egg yolk phospholipids, microencapsulated fish oil and single cell oils. Besides several commercial infant formulae are studied.

La finalitat d'aquest treball ha estat continuar caracteritzant els efectes aprimadors de l'oleoïl-estrona (OE), aprofundint en el coneixement del seu mecanisme d'acció, i de com els seus efectes sobre la ingesta, la composició corporal i la millora de la sensibilitat a la insulina, poden ser modulats al ser combinada amb altres fàrmacs, comprovant especialment la seguretat d'aquestes combinacions.El nostre grup de treball, basant-se en el model homeostàtic postulat per Kennedy per explicar la complexitat dels mecanismes de regulació del pes corporal, va descobrir l'oleoïl-estrona, una molècula que indueix una pèrdua de pes de manera dosi depenent deguda a la disminució de la ingestió d'aliment mantenint la despesa energètica i facilitant així la mobilització de greixos. L'OE va ser proposada com a possible senyal ponderòstat i com a possible base d'una teràpia farmacològica per a l'obesitat.En un primer objectiu es pretenia demostrar si els efectes de la OE sobre el balanç energètic eren mitjançats a través dels receptors d'estrògens, pel que es va realitzar un estudi en el que s'administrava un ampli rang de dosis d'estrona lliure comprovant la diferència d'efectes metabòlics existents entre aquesta i l'OE. Continuant amb la mateixa línia, es va realitzar una administració conjunta de l'OE amb el tamoxifè, un antagonista dels receptors d'estrògens àmpliament utilitzat, el que ens permetria confirmar que el tamoxifè no evita els efectes aprimadors de l'OE, suggerint que el bloqueig d'aquests receptors no impedeix l'acció de l'OE, i per tant, que aquesta no actua a través de les vies estrogèniques.En un segon objectiu es va combinar l'OE amb altres agents aprimadors (sibutramina, dexfenfluramina, fentermina, un agonista dels receptors beta-3-adrenèrgics (CL316,243), i rimonabant), fet que ens va permetre caracteritzar una possible teràpia farmacològica combinada efectiva i segura per al tractament de l'obesitat i aproximar-nos de manera indirecta al coneixement del mecanisme d'acció de l'OE.En un tercer objectiu, mitjançant la combinació de l'OE amb la rosiglitazona es va estudiar els mecanismes a través dels quals aquests dos compostos milloren la sensibilitat a la insulina. Malgrat que la rosiglitazona i l'OE presenten efectes metabòlics pràcticament oposats, la seva combinació es presenta con una bona alternativa per al tractament de la diabetis mellitus de tipus 2 en els pacients que presenten obesitat.Finalment, per tal d'aprofundir en els efectes moduladors de l'OE sobre la ingesta, es van analitzar els efectes d'aquesta sobre l'expressió dels principals pèptids gastrointestinals que regulen la ingestió d'aliments a curt termini. Es va comprovar com l'administració d'OE provoca una ràpida i marcada inhibició de l'expressió del pèptid orexigènic ghrelina, amb efectes pràcticament nuls sobre l'expressió dels pèptids anorexigènics CCK, PYY i GLP-1. / SUMMARU:The aim of this work was to continue the characterization of the the slimming effects of oleoyl-estrone (OE) studying its mechanism of action and whether its effects on food intake, energy balance and insulin sensitivity could be modulated by its combination with other drugs. Possible synergisms and risks of the combination of OE with known drugs were studied. Our research group discovered OE, a molecule synthesized in white adipose tissue that elicits a marked dose-dependent loss of body weight. OE treatment reduces food intake while maintaining energy expenditure thus creating an energy gap filled by the expense of body fat stores. OE was proposed as a possible ponderostat signal and a possible agent for obesity treatment. Initially, we focused our study in determining if OE's effects were mediated by the estrogen receptor. First, a wide range of estrone doses were tested in order to evaluate differences between estrone and OE on the energetic balance. Later, we studied the combined effects of OE and tamoxifen, a estrogen receptor antagonist, in order to prove that OE does not act through estrogenic pathways. Tamoxifen does not prevent the mobilization of body lipids elicited by OE.Secondly, OE was combined with other drugs regularly used to treat obesity (sibutramine, dexfenfluramine, phentermine, a specific b3-adrenergic receptor agonist (CL316,243) and rimonabant), in order to characterize an effective and safe pharmacological therapy. This set of experiments also provided insights regarding the mechanism of action of OE.Afterwards, we combined OE and rosiglitazone in order to study how these two agents improve insulin sensitivity. Despite their diverging effects on body mass fat, the combination of OE and rosiglitazone may be positive for type 2 diabetics that are obese or show a marked predisposition to the accumulation of fat.Finally, in order to elucidate the effects of OE on food intake we analyzed the expression of several gut peptides that affect short-term feeding behavior. Results showed that the ghrelin expression was markedly reduced by OE administration. However its effects on the anorexigenic peptides studied (CCK, GLP-1 and PYY) are practically non-existent.

Fermented meats play an important part in many diets and are very appreciate by the consumer. However, these products are an important source of fat and salt, associated to chronic cardiovascular diseases. Therefore, it is necessary to develop new strategies in the manufacture of fermented meats in order to innovate in this area to obtain healthier products / Els embotits fermentats-curats (EFC) estan presents en moltes dietes i són molt apreciats pel consumidor, però a la vegada constitueixen una font important de greix i sal, responsables de malalties cardiovasculars. Per tant, és necessari el desenvolupament de noves estratègies en la fabricació d’EFC per innovar en aquest camp, en benefici de la promoció de la salut del consumidor

INTRODUCTIONDuring the past decade, Nutrition research has been subjected to a shift of focus, from epidemiology and physiology to the comprensión of the molecular basis of nutrients actions.Thus, the new "-omics" disciplines transcriptomics, proteomics or metabolomics, provide the tools to understand the molecular mechanisms involved in the modulation of gene expression by nutrients. The study of the beneficial properties of wine procyanidins has not avoided this shift of focus. Thus, from the initial studies which defined the "French paradox", to nowadays, a wide array of studies have been focused in defining the properties of the non-alcoholic components of red wine, mainly flavonoids, a family of polyphenolic compounds. The objectives of this thesis have been to define the molecular mechanisms by which grape procyanidins modulate the hepatic metabolism of lipoproteins, reducing the risk of cardiovascular disease and other pathologies which basis is found in the dysregulation of the lipoprotein metabolism.SUMMARYIn the present thesis, the effect of procyanidins in the hepatic lipoprotein metabolism has been studied. With this objective, HepG2, HeLa and CV-1 cells have been used as invitro models. In vivo studies have been performed in Wistar rats and C57BL6 mice, wild-type and transgenic mice lacking SHP (NR0B2) and FXR (NR5H1).RESULTS1. Procyanidins improve plasma lipid profile in the postprandial phase in rats. A single oral dose of procyanidins decreases plasma triglycerides and ApoB levels to 50% of control values. In addition LDL-Cholesterol is significantly reduced, thus improving the atherosclerotic risk index.2. Procyanidins display a triglyceride-lowering effect both in vivo and in vitro. In rat and mouse, procyanidin treatment triggers a hypotriglyceridemic response. In HepG2 cultures, procyanidins down-regulate the secretion of triglycerides and ApoB, thus showing that these flavonoids act directly on hepatic cells. This fact strongly suggests that, in vivo, a direct action of procyanidins on the liver contributes to their hypotriglyceridemic response.3. Nuclear receptor Small Heterodimer Partner (SHP) is a target of procyanidins in hepatic cells. Procyanidins modulate the expression of SHP, rapidly increasing its expression in rat liver as well as in HepG2 cultured cells.4. SHP mediates the triglyceride-lowering activity of procyanidins in vitro and in vivo. When SHP expression is silenced in HepG2 or abolished in SHP-null mice, procyanidins lose their hypotriglyceridemic activity. In contrast, in SHP-silenced HepG2 cells, procyanidins are still able to reduce apoB secretion. Hence, procyanidins reduce triglyceride via a SHP-dependent mechanism, whereas they reduce apoB in a SHPindependent manner.5. Nuclear receptor Farnesoid X Receptor (FXR) is an essential mediator of the hypotriglyceridemic action of procyanidins upstream SHP. Oral gavage of procyanidins to FXR-null mice have not a hypotriglyceridemic effect. Moreover, luciferase based in vitro assays showed that procyanidins increase the transcriptional activity of FXR. Thus, FXR is an essential component of the signalling pathway used by procyanidins to elicit the triglyceride lowering effect.6. Key genes of the inflammation process are targets of procyanidins in liver, in the postprandial phase. Oral administration of procyanidins to rats rapidly downregulates the expression, in liver, of transcription factor Egr1, a mediator of the hepatic inflammatory response, and several acute-phase proteins, namely haptoglobin, fibrinogen B and alpha-1 antitrypsin. In addition, expression of DUSP6, a component of the ERK1/2 subfamily of MAPK, is repressed by this treatment. Nfkbia, a repressor of NF-kB activity, is overexpressed upon procyanidin treatment. This expression pattern strongly suggests that procyanidins attenuate the pro-inflammatory state associated to the postprandial phase. / INTRODUCCIÓNDurante la pasada década, la investigación en nutrición se ha visto sujeta a un cambio en sus objetivos, pasando de los estudios basados en la fisiología y la epidemiología a la comprensión de las bases moleculares implicadas en las acciones biológicas de los nutrientes. Así, las nuevas disciplinas, como la biología molecular o las "-omics", transcriptómica, proteómica o metabolómica, proporcionan las herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la modulación génica por nutrientes.El estudio de las propiedades beneficiosas del vino no ha evitado este cambio de foco. Así, desde los primeros estudios que definieron la "paradoja francesa", hasta la actualidad, una ámplia gama de estudios se han dedicado a definir las propiedades de los componentes no alcohólicos del vino, mayoritariamente, los Flavonoides, una familia de compuetos polifenólicos. El objetivo de esta tesis ha sido definir los mecanismos moleculares mediante los cuales las procianidinas de uva modulan el metabolismo de lipoproteínas en el hígado, disminuyendo así el riesgo cardiovascular y diferentes patologías cuya base se encuentra en la desregulación del metabolismo lipoproteico.MEMORIADurante esta tesis se ha estudiado el efecto de las procianidinas sobre el metabolismo lipoproteico en el hígado. Con este objetivo se han usado líneas celulares como modelo in vitro, tanto hepatocitos (HepG2) como líneas accesorias (HeLa y CV-1). Como modelos para el estudio de las procianidinas in vivo se han usado ratas de la cepa Wistar y ratones de la cepa C57BL6, tanto wild-type como dos líneas de transgénicos, Knockout para SHP (NR0B2) y FXR (NR5H1).RESULTADOSSe han obtenido los siguientes resultados:Las procianidinas de uva disminuyen los niveles de lipoproteínas ricas en triglicéridos, así como mejoran los índices de riesgo cardiovascular en ratas.Estos efectos se deben a la modulación de la expresión génica en el hígado, tejido adiposo y músculo entre otras acciones.El mecanismo por el cual las procianidinas disminuyen las lipoproteínas ricas en triglicéridos ha sido estudiado in Vitro (HepG2) e in vivo (C57BL6 wild-type y knockout para SHP). Se han definido dos mecanismos principales. El primero implica la señalización de las procianidinas por una vía dependiente de SHP (Small heterodimer partner, NR0B2), un receptor nuclear. El segundo mecanismo es independiente de SHP e inhibe la expresión de MTP (enzima controlador de la síntesis de lipoproteínas) y consecuente secreción de un menor número de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).Por encima de SHP, se ha definido FXR (Farnesoid X receptor) como sensor de las procianidinas mediante el uso de ratones C57BL6 KO para FXR y sistemas reporter basados en luciferasa. Estableciendo que el mecanismo de señalización de las procianidinas pasa por FXR, que a su vez induce la expresión de SHP y este inhibe la expresión de SREBP1, factor de transcripción clave para la síntesis de lípidos, disminuyendo así la cantidad de lípidos hepáticos y, consecuentemente, la secreción de lipoproteínas.DISCUSIÓNLa modulación del metabolismo de lipoproteínas es el principal objetivo para el tratamiento de las diferentes patologías relacionadas con dislipemias. Así, la definición de las procianidinas de uva como agentes hipolipidémicos, las convierte en un componente de la dieta de alta importancia para prevenir y mejorar una ámplia gama de patologías, desde la aterogénesis hasta otros estados metabólicos alterados, causantes de la resistencia a la insulina o el síndrome metabólico.Por otro lado, el establecimiento de los mecanismos moleculares implicados en los efectos de las procianidinas de uva, aumenta el conocimiento sobre estos compuestos, así como su aplicabilidad en diferentes estados metabólicos alterados. De esta manera, se ha propuesto que la activación de FXR podría usarse como una estrategia en el tratamiento de la hiperlipidemia o la resistencia a la insulina. Así, las procianidinas emergen como un importante agente terapéutico, cuya importancia radica en la amplia presencia de estos compuestos en la dieta.