Durant el curs d'aquest treball s'han realitzat l'expressió de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) sota en control del promotor FLD1 en el llevat Pichia pastoris i s'ha desenvolupat una estratègia de cultiu en semi-discontinu lliure de metanol. En primer lloc es va realitzar la construcció d'un vector d'expressió que conté el gen de la ROL i el promotor FLD1. Aquest vector va ser subseqüentment transformat a P. pastoris. Els cultius en discontinu en bioreactor van revelar l'efecte sinèrgic del metanol i la metilamina com a substrats inductors sobre el promotor FLD1. A més, l'ús de sorbitol com a font de carboni, combinat amb la metilamina, ha resultat ser una combinació atractiva per evitar l'ús de metanol en cultius a altes densitats cel·lulars.En segon lloc es va desenvolupar una estratègia de cultiu en semi-discontinu fent servir sorbitol i metilamina com a fonts de carboni i nitrogen respectivament. Es van dur a terme tres cultius a diferents velocitats específiques de creixement, 0.005 h-1, 0.01 h-1, i 0.02 h-1. El nivell més alt de proteïna recombinant es va obtenir al cultiu realitzat a 0.02 h-1. Malgrat això la velocitat específica de producció a tots tres cultius es va disminuir després d'arribar a un màxim a prop de les 30 hores de cultiu. Per tal d'analitzar els potencials colls d'ampolla al procés de plegament i secreció, i la possible activació de la resposta a estres per proteïnes mal plegades (UPR) durant l'expressió de ROL, es van analitzar els nivell de la xaperona BiP, indicativa d'estres. També es van analitzar els nivells intracel·lulars de ROL. Es va utilitzar la immunofluorescència, combinada amb la citometria de flux per analitzar els nivells d'aquestes proteïnes. El increment dels nivells intracel·lulars de BiP i ROL durant la fase d'inducció dels cultius va indicar una possible activació de la resposta d'estres.Es va proposar una estratègia d'enginyeria metabòlica per tal alleujar els possibles colls d'ampolla en la via de plegament i secreció. El gen HAC1 de Saccaromyces cerevisiae es va clonar i expressar constitutivament a les cèl·lules de P. pastoris co-expressant ROL. El gen HAC1 codifica per un factor de transcripció el qual és responsable de l'activació del gens relacionats amb el UPR. Els resultats dels cultius amb les soques que expressen constitutivament el gen HAC1 van mostrar un increment en els nivells d'expressió de ROL, demostrant l'efecte positiu sobre el plegament i la secreció d'aquesta modificació. Per altra banda, una segona modificació es va realitzar per a millorar l'eficiència de secreció. El gen GAS1, el qual codifica per a una glycoproteïna ancorada a la membrana plasmàtica la qual realitza els unions entre els ?-glucans de la paret cel·lular va ser disruptat. La deleció d'aquest gen va provocar un canvi a la conformació de la paret cel·lular, fent-la més permeable al pas de proteïnes, fet que va resultar en un increment en els nivells de ROL extracel·lular. També es va dur a terme l'estudi dels nivells de transcripció de determinats gens de d'interès rellevant de P. pastoris. Concretament es van quantificar els nivells de transcripció del gen de l'alcohol oxidasa (AOX1), la formaldehid deshidrogenase (FLD1), la protein disulfide isomerase (PDI), la proteina BiP (gen KAR2), el 26S rRNA, i el gen de la proteïna ROL. Els nivells de transcripció d'aquests gens es van quantificar fent servir el sandwich hybridization assay basat en la immobilització específica dels mRNAs sobre esferes magnètiques i la seva posterior detecció mitjançant fluorimetria. La velocitat específica de producció va resultar ser un factor clau en els nivells de transcripció dels gens analitzats; a més, els resultats van aportar noves evidencies que l'expressió de ROL activa la resposta a estres. Finalment, amb l'objectiu de determinar la localització intracel·lular a P. pastoris del producte recombinant, el gen de la ROL es va fusionar amb el de la green fluorescent protein d'Aequorea victoria. En cultius en discontinu els nivells d'expressió de la proteïna de fusió van ser deu vegades inferiors als del cultiu control expressant solament ROL. A més, es va observar que la fluorescència d'un producte associat al creixement de P. pastoris, probablement la riboflavina, es superposava al senyal de la GFP al medi extracel·lular. Per altra banda es va observar una acumulació intracel·lular de la proteïna de fusió localitzada a l'espai periplasmàtic i dins de compartiments cel·lulars amb aparença vacuolar. Aquest estudi ha permès el desenvolupament i la millora del sistema d'expressió de P. pastoris basant-se en l'ús del promotor FLD1 com a alternativa al clàssic AOX1. / During the course of this work, the expression of a Rhizopus oryze lipase (ROL) under the control of the FLD1 promoter in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, as well as the development of methanol-free cultivation processes and metabolic engineering strategies for process improvement has been carried out. First, an expression vector containing the ROL gene and the FLD1 promoter from P. pastoris was constructed and subsequently transformed in P. pastoris. Bioreactor batch cultivations revealed the synergetic effect of methanol and methylamine on the FLD1 promoter induction. Moreover, the use of sorbitol as carbon source, combined with methylamine as nitrogen source, was found to be an attractive alternative to the use of methanol for high cell density cultivations. Second, a new fed-batch fermentation strategy was developed using sorbitol and methylamine as carbon and nitrogen source, respectively. Three fed-batches were performed at different specific growth rates, 0.005 h-1, 0.01 h-1, and 0.02 h-1. The specific growth rate was controlled during induction phase in the 0.005 h-1, 0.01 h-1 fermentations by implementing an exponential feeding rate at limiting substrate concentration. The highest lipase productivity was obtained in the fed-batch performed at the 0.02 h-1 specific growth rate. However, product production rate of all three fermentations dropped soon after reaching a maximum at about 30 hours of culture. Third, in order to analyze potential bottlenecks in the protein folding or secretion pathway and, in particular, the potential activation of the unfolded protein response (UPR) during ROL overexpression and intracellular accumulation, the levels of a reticle endoplasmatic-resident chaperone (BiP), its induction has been related to the activation of the UPR, as well as the intracellular levels of ROL were analyzed by immunofluorescence staining combined with flow cytometry. The increase of BiP and ROL levels during the induction phase of fed-batch cultivations indicated the possible activation of the UPR. Fourth, a metabolic engineering strategy was proposed to alleviate the supposed bottleneck in the folding and secretion pathway. The Saccharomyces cerevisiae HAC1 gene was cloned and constitutively expressed in P. pastoris co-expressing ROL. The HAC1 gene codifies for a transcriptional factor which activates the UPR related genes expression. The constitutively activation of the UPR was aimed at sustaining a better protein folding and secretion efficiency. Results from the HAC1-engineered strain showed an increase in the product expression, demonstrating the positive effect of such modification on protein folding and secretion.Besides, a transcriptional analysis of some bioprocess-relevant genes of the ROL-expressing P. pastoris strains was carried out. In particular, the alcohol oxidase 1 (AOX1), formaldehyde dehydrogenase (FLD1), protein disulfide isomerase (PDI), binding protein (KAR2), 26S rRNA and the recombinant product (ROL) mRNA levels were monitored in both shake flask and fed-batch cultivations. The mRNA levels of these genes were quantified by using a sandwich hybridization assay based on immobilization of the desired mRNA on magnetic beads and subsequent detection by a fluorescence-based technique. The specific growth rate showed to be a key factor in the transcriptional level of the analyzed genes; moreover, the results gave additional evidence to the hypothesis that ROL triggers the UPR. Fifth, a second genetic modification was carried out in order to improve the secretion efficiency of ROL. The P. pastoris GAS1 gene, which codifies for a glycoprotein anchored to the outer layer of the plasma membrane performing cross links between the cell wall ?-glucans, was disrupted. The deletion of this gene provoked a change in the cell wall conformation, causing an increase of the cell wall porosity and permeability, i.e. allowing for a better release of the recombine product. Finally, in order to gain further insights on the potential accumulation of the recombinant product, ROL gene was fused with the Aequorea victoria green fluorescence protein (GFP) gene and expressed in P. pastoris. In batch culture the expression of the ROL as a fusion protein caused an important decrease in the extracellular levels of the recombinant lipase activity when compared with the control. Also, the presence of growth-related product, probably riboflavin, was found to interfere with the extracellular GFP signal. Besides, an intracellular accumulation of the fusion protein was observed both in the cell's periplasm and in vacuolar-like compartments. Overall, this study has allowed the development and improvement of the P. pastoris expression system based on the formaldehyde deshydrogenase promoter as an alternative to the classic methanol inducible alcohol oxidase promoter.

Els nostres avantpassats conservaven la carn amb sal per tenir disponibilitat de productes carnis durant tot l’any. Les impureses en nitrat que aquesta sal contenia donaven lloc a un producte carni curat amb un color vermellós característic. Avui en dia se sap que el nitrat afegit a les carns es redueix a nitrit i aquest és el responsable del típic color de curat degut a la seva reacció amb la mioglobina. El nitrit també actua com antimicrobià i prevé front l'oxidació. Malgrat els efectes desitjables del nitrit, la seva utilització pot ser un problema de salut pública degut a la formació de nitrosamines. D’altra banda, la preocupació d’alguns consumidors cap als sistemes de producció intensiva, ha comportat el creixement del mercat de productes ecològics. Els consumidors conceben que aquests productes són més saludables i de major qualitat i alhora respecten el medi ambient i els animals. Per cobrir aquesta demanda la indústria càrnia produeix aquest tipus de productes. Tot i així, la producció de productes carnis curats sense nitrats o nitrits no és possible ja que els productes resultants tindrien un color poc agradable pel consumidor i s’augmentaria l’oxidació i el risc microbiològic. Per això, la Unió Europea ha establert uns límits màxims d’addició de NaNO3 o NaNO2 de 80 mg /kg i uns límits residuals màxims de NaNO3 o NaNO2 de 50 mg/kg, per a productes carnis curats ecològics fins que no es trobi un substitutiu d’aquests. Una alternativa a la utilització de nitrats i nitrits en forma d’additiu són les fonts naturals riques en nitrats. Els sucs o els concentrats vegetals són rics en nitrats, estan disponibles al mercat i poden ser usats en productes ecològics. Per això, semblen indicats per a l’elaboració de productes carnis curats. Degut a que aquestes fonts naturals contenen alts continguts de nitrats i no de nitrits, sembla apropiat usar-los conjuntament amb bacteris iniciadors de la fermentació amb activitat nitrat reductasa. Basat en aquests antecedents, l’objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser avaluar la possibilitat de produir un producte carni curat utilitzant aquests concentrats vegetals com agent curant conjuntament amb l’ús de bacteris amb activitat nitrat reductasa. Concretament, es va elaborar un producte carni cru curat (llonganissa) per estudiar com afectava a la qualitat la menor concentració de nitrats i nitrits emprada en productes carnis ecològics. A més, es va valorar la utilització d’un concentrat d’api com a font natural de nitrats i la utilització d’un bacteri d’elevada activitat nitrat reductasa. També es va avaluar la inclusió d’aquests concentrats vegetals rics en nitrats en productes carnis curats i cuits (botifarra catalana) i les condicions de fermentació a les quals s’havien de sotmetre els bacteris iniciadors de la fermentació amb activitat nitrat reductasa per obtenir un producte de qualitat similar al curat convencional. Els resultats mostren que les concentracions de nitrats i nitrits permeses en productes ecològics no afecten a la qualitat del producte carni curat. A més, l’ús de concentrats vegetals rics en nitrats no només minimitza els processos oxidatius i produeix un color vermell similar als productes curats amb additius sinó que a més, són ben acceptats pels consumidors. Tot i així, especialment en productes curats cuits on les reaccions de curat succeeixen d’una forma ràpida, la inclusió d’un bacteri d’elevada activitat nitrat reductasa (Staphylococcus carnosus) és necessària per reduir ràpidament el nitrat a nitrit i produir les característiques de color que el consumidor desitja. A més amb aquests cultius s’aconsegueixen concentracions de nitrats residuals molt baixes. Com a conclusió, l’ús de concentrats vegetals en combinació amb Staphylococcus carnosus és una bona alternativa a l’ús d’additius per produir productes carnis curats de qualitat. / Nitrite is responsible for the fixation of cured meat color through its reaction with myoglobin. Moreover, it acts as an antimicrobial and helps to prevent oxidation. Despite these desirable effects of nitrite, the formation of carcinogenic nitrosamines from both nitrate and nitrite sources is a health concern. Nowadays, the market for organic food is growing rapidly. Although nitrite-free cured meat products have been produced, consumers dislike them because of the lack of color in the product. In addition, cured meat products without nitrite could mean also a poor microbiological quality and high oxidative status. An alternative to the addition of chemical grade nitrates or nitrites is the addition of natural sources containing nitrate and/or nitrite, such as vegetable juices or powders. The aim of this thesis was to assess the possibility of producing a cured meat product using a nitrate-rich vegetable concentrate and a starter culture with intense nitrate reductase activity following the standards for organic products. Results showed that the concentrations of nitrate and nitrite permitted in organic meat products seemed to do not affect meat product quality parameters. In addition, the use of vegetable concentrates rich in nitrate minimize oxidative processes and lead to similar redness in meat products in the same way than additives would do. Besides, these vegetables concentrates are well accepted by consumers. However, especially in cured-cooked products in which the curing reactions take place in a short period of time, a starter culture with intense nitrate reductase activity (Staphylococcus carnosus) is required to reduce nitrate to nitrite quickly. Moreover, the addition of this starter culture causes very low residual nitrate content. In conclusion, these results confirm that the use of vegetable concentrates together with the use of Staphylococcus carnosus in cured meat products are a good strategy as an alternative to additives to produce cured meat products with good quality characteristics.

Entender la influencia de la alimentación en la salud y enfermedades humanas es uno de los mayores objetivos de la nutrición moderna. La nutrimetabolómica se define como la disciplina “ómica” que estudia cómo afecta la dieta al conjunto del metaboloma; siendo propuesta como poderosa herramienta para explorar la relación entre nutrición y salud. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal contribuir en la identificación de biomarcadores nutricionales de consumo (biomarcadores de ingesta) así como su impacto en la salud (biomarcadores de efecto), y la huella metabólica que producen sobre el perfil urinario desde distintas aproximaciones metabolómicas mediante Resonancia Magnética Nuclear. Para la consecución de este objetivo se estudió el metaboloma desde la ingesta de diferentes componentes alimentarios (alimento, complemento alimenticio y patrones alimentarios). En el caso del estudio en un alimento se utilizó vino, vino desalcoholizado y ginebra para evaluar el efecto de la matriz alimentaria de las diferentes fracciones del alimento. El análisis del metaboloma mostró tanto metabolitos provenientes del food metabolome (tartrato, etanol, manitol), endógenos (3-metil-2-oxovalerato), y derivados de la acción de la microbiota intestinal (hipurato y 4-hidroxifenilacetato). En cuanto a la matriz alimentaria, se observó una posible interacción entre el alcohol y los biomarcadores relacionados con los metabolitos de la microbiota intestinal. Seguidamente, se propuso estudiar los biomarcadores de ingesta de un alimento, y para ello se detectaron en un estudio de intervención (vino) y se determinó el poder predictivo mediante la evaluación de su sensibilidad y especificidad. Se evaluaron de forma individual, observando finalmente que la combinación de dos de ellos (tartrato+etilglucurónido) ofrecía un mayor poder predictivo (área bajo la curva [AUC]:90.7%) que individualmente. Se realizó una validación en otra población (estudio observacional), viéndose una reproducibilidad de los resultados (AUC: 92.4%) con una alta sensibilidad (≥84%) y especificidad (>90%) en ambas poblaciones. Para evaluar sobre el fenotipo metabólico el efecto de una intervención con un alimento, se estratificó una población con alto riesgo cardiovascular atendiendo a sus parámetros clínicos. Se evaluó el efecto de la ingesta de polifenoles del vino en los clúster más discriminantes (“obesos y diabéticos” vs. “sanos con riesgo”). Se observó en el metaboloma un comportamiento diferencial para la excreción del 4-hidroxifenilacetato (microbiota intestinal) en el clúster que se clasificó como “obeso y diabético” frente al clúster “sano con riesgo”, exhibiéndose en los primeros una posible alteración de la microbiota intestinal después del consumo de vino. En la evaluación de los patrones alimentarios, se analizó el perfil metabólico de una población al inicio, 1 año y 3 años de seguimiento de un patrón de Dieta Mediterránea (MD) suplementada con aceite de oliva/nueces frente a una dieta baja en grasa. Se detectaron varios metabolitos endógenos relacionados con el metabolismo energético (glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, β-oxidación), derivados de la microbiota, así como también del food metabolome. Asimismo, se pudo asociar ciertos metabolitos con patrones de dieta, viéndose asociadas las dos MD a un mayor consumo de vegetales, mientras que la dieta baja en grasa presentaba una mayor asociación al consumo de carne roja. En la evaluación del impacto en la salud, se administró un complemento alimenticio (probiótico) a mujeres lactantes con mastitis y se observó una mejoría y una reducción del estado inflamatorio (seguimiento médico), lo que provocó una deserción voluntaria de fármacos (ibuprofeno y paracetamol), hecho que se reflejó en el metaboloma urinario. También se vio un aumento en la excreción de creatina y de metabolitos derivados de la microbiota intestinal (hipurato y trimetilamina-N-óxido). Esta Tesis Doctoral presenta diferentes estrategias nutrimetabolómicas para el desarrollo y estudio de biomarcadores nutricionales y su impacto en la salud. / Understanding the link between nutrition and health is one of the major goals of modern nutrition. Nutrimetabolomics is an “omics” science that studies the effect of diet through the metabolome. It is a powerful tool for exploring the relationship between nutrition and health. The aim of this PhD thesis is to contribute to the identification of biomarkers related to food consumption (biomarkers of intake) and their impact on health (biomarkers of effect). To achieve this goal, the human metabolome was studied by nuclear magnetic resonance (NMR) after the intake of different food components (food, supplements and dietary patterns). Wine, dealcoholized wine and gin were used to evaluate the food matrix effect. Results showed metabolites from the food metabolome, endogenous and gut microbiota, pointing to a potential interaction between alcohol and gut microbiota. To study food exposure biomarkers, the predictive power in the wine interventional study concluded that a model combining two biomarkers (tartrate+ethyl glucuronide) has greater predictive power than the individual markers. Reproducible results also were shown in epidemiological data (AUC>90%). Furthermore, high cardiovascular risk individuals were stratified based on their clinical parameters. The effect of wine polyphenols intake in the metabolic phenotype for the two most discriminant clusters (“obese-diabetics” vs. “healthier”) was evaluated, and different excretion of gut microbiota metabolite 4-hydroxyphenylacetate was observed. Concerning the dietary patterns, the metabolic footprint after 3-years follow-up with Mediterranean diet vs. low-fat pattern was analyzed. Several metabolites (i.e. energy pathway-metabolites), and dietary patterns association with certain metabolites were also observed. To assess the impact on health, a probiotic supplement was administered to breastfeeding women with mastitis. The reduction of inflammation (medical test) and voluntary desertion of pharmacological drugs was revealed in the urinary metabolome. This Doctoral Thesis presents different nutrimetabolomics strategies to study nutritional biomarkers and improve the understanding of their impact on human health.

La composición de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL) en los tejidos humanos es esencial para mantener las funciones metabólicas y la salud. Diferentes patologías, incluidas las enfermedades atópicas, han sido relacionadas con los niveles de AGPI-CL. Además de la dieta, un factor que influye en la composición de los AGPI-CL en los tejidos humanos es la síntesis de novo de los mismos. En este proceso, los AGPI-CL son sintetizados a partir de AG esenciales a través de diferentes etapas de desaturación y elongación. Las enzimas que participan son las desaturasas: Δ5-desaturasa (D5D, codificada por el gen FADS1) y Δ6-desaturasa (D6D, codificada por el gen FADS2), y las elongasas: Elongasa-2 (codificada por el gen ELOVL2) y Elongasa-5 (codificada por el gen ELOVL5). Por otro lado, existe un escaso conocimiento sobre la relación de los ácidos grasos trans (AGT) con el desarrollo de las enfermedades atópicas. Se ha sugerido que los AGT pueden modificar el metabolismo de los AGPI-CL, teniendo efectos beneficiosos los AGT procedentes de fuentes naturales [ácido t-vaccénico (VA) y ácido ruménico (RA)] respecto a los AGT de fuentes industriales [ácido elaídico (ELA)]. El objetivo principal de esta tesis fue investigar sí la composición plasmática de AG, durante la vida fetal y postnatal, afecta al desarrollo de las enfermedades atópicas en los niños. En base al Proyecto INMA de la Cohorte de Sabadell (Cataluña, España) los resultados más importantes son: Desarrollo del método que nos permitió identificar, separar y cuantificar los AG de los fosfolípidos plasmáticos y de la leche materna, especialmente los AGT (ELA, VA y RA). Se usaron placas de extracción en fase sólida (SPE) de 96 pocillos para las muestras de plasma, y se optimizó la cantidad de muestra para la leche materna. Una adecuada precisión y recuperación garantizan la validez del método. Pudimos observar que durante el primer trimestre del embarazo, niveles de ELA se correlacionan negativamente con los AGPI-CL n-3, mientras que niveles altos de ácido ruménico ayudan a una mejor metabolización de los AGPI-CL en el plasma materno. Una exposición temprana del feto a altos niveles de VA puede tener un efecto protector frente al desarrollo del eczema atópico en el primer año de vida. Además, se observó que bajos niveles de AGLP-CL n-3, especialmente EPA y DHA en el plasma del cordón umbilical están asociados con el aumento del riesgo de eczema atópico en el primer año de vida. También, bajos niveles de la suma total de AGPI-CL fueron encontrados en el plasma de madres alérgicas, lo que nos indica que la dieta durante el embarazo junto con la transferencia de los AG al feto juega un papel crítico en el desarrollo de la enfermedad. Por otro lado, se encontró que las variantes genéticas de los genes que codifican a las desaturasas y elongasas, FADS y ELOVL, en las madres y los niños determinan la composición de AG en el nacimiento y están asociadas con el desarrollo de eczema atópico y sibilancias. Finalmente, se observó que los niños de 4 años de edad con eczema atópico tienen una baja expresión de los genes FADS2 y ELOVL5. Además, se pudo comprobar que los niveles de DGLA y la actividad enzimática de la D6D están directamente influidos por los cambios de expresión del gen FADS2. En resumen, los resultados presentados en esta tesis sostienen la hipótesis de que existe una relación causal entre los ácidos grasos plasmáticos de la madre y el niño y el desarrollo de enfermedades atópicas como el eczema atópico, y que además las variantes genéticas de madre e hijo, juegan un papel crucial en la evolución de la enfermedad. / This thesis has been focused on the study of the TFA [elaidic (ELA), t-vaccenic (VA) and rumenic acid (RA)] and LC-PUFAS plasmatic composition, during fetal and postnatal life and its relation with the development of atopic diseases during childhood. An efficient fast gas chromatographic method for simultaneous determination of EA, VA and RA contents in human plasma phospholipids and human milk was optimized and validated. The study of the plasmatic levels of specific TFA in maternal plasma shows that EA correlated negatively with n-3 LC-PUFAs (EPA and DHA) and RA positively with both n-3 and n-6 LC-PUFAs in maternal plasma. Regarding to atopic diseases, high VA concentrations in maternal plasma may protect offspring against atopic eczema in infancy. Thus the FA status of the fetus during pregnancy has an important role in the development of atopic eczema in early childhood. The prevalence of this atopic disorder is related to lower cord blood plasma levels of FA belonging to n-3 series, especially DHA. The conversion of essential fatty acids to longer chain, biological active metabolites is regulated by the enzymes desaturases [5-desaturase (D5D) and 6-desaturase (D6D) encoded by genes FADS1 and FADS2, respectively] and elongases (Elongase 2 and Elongase5 encoded by genes ELOVL2 and ELOVL5, respectively). In this study we have verified that mother and child genetic variation in FADS and ELOVL genes determines FA composition at birth and is associated with the risk of developing atopic eczema and wheeze in early childhood. Moreover, we observed that changes in the mRNA-expression levels of FADS1 and 2 directly affect blood DGLA levels and D6D activity. Finally, this study suggests that low mRNA-expressions of FADS2 and ELOVL5 are associated with high risk of atopic eczema in childhood. In summary, the results presented in this thesis support the hypothesis that there is a causal relationship between plasma fatty acids composition of the mother and child and the development of atopic diseases such as atopic eczema, and additionally, that genetic variants of both mother and child play a crucial role in the evolution of the disease.

The present doctoral dissertation deals with the study of the effect of food preservation technologies, such as high pressure (HP) treatments and biopreservation with nisin, on the behaviour of Listeria monocytogenes during the shelf-life of ready-to-eat (RTE) cured and cooked meat products. Several challenge tests were designed and performed through a product-oriented approach and results were mathematically modelled. In cured meat products such as cured ham, an HP treatment was combined with nisin applied directly on the product surface or through interleavers (i.e. active packaging) to assess the effectiveness against Listeria monocytogenes during the product shelf-life.Regarding cooked meat products, besides quantifying and modelling the immediate HP-inactivation of L. monocytogenes, the pathogen behaviour after HP and during the refrigerated storage (between 4 and 12ºC) was also characterised / El treball tracta de l’estudi de l’efecte de diferents tractaments de conservació dels aliments, altes pressions (HP) i/o l’addició de bacteriocines, en el comportament de Listeria monocytogenes durant la vida útil de dues tipologies diferents de productes carnis llestos per al consum (RTE), crus-curats i cuits. Per a tal fi es van realitzar diversos challenge tests, amb un enfoc orientat a producte, que van permetre tractar els resultats obtinguts mitjançant la modelització matemàtica. En pernil curat es va avaluar l’efecte d’un tractament per HP sol o combinat amb nisina (aplicació directa o mitjançant envasat actiu) vers Listeria monocytogenes, durant la vida útil del producte. En productes cuits es va quantificar i modelitzar la cinètica d’inactivació per HP de Listeria monocytogenes obtenint un model predictiu d’inactivació per HP, i posteriorment es va caracteritzar el comportament del patogen després del tractament per HP i durant l’emmagatzematge en refrigeració a diferents temperatures

Segons la Organització Mundial de la Salut (OMS), més d’un quart de la població mundial pateix algun tipus de malaltia relacionada amb el sistema circulatori. Actualment, les malalties cardiovasculars (CV) són la principal causa de mort i discapacitat en els països desenvolupats. Només a Espanya, l’any 2012, les malalties del sistema circulatori van causar 122.097 morts, que representen un 33.3% del total de defuncions. La prevenció, més que el tractament, és una prioritat màxima per les agències de salut pública, que s’esforcen per sensibilitzar a la població amb l’objectiu de trencar aquesta tendència. El nostre paper com a investigadors en el camp de la salut és estudiar els factors de risc d’aquestes malalties i buscar la manera de reduir-los, per exemple, amb un canvi d’estil de vida i de dieta. La dieta mediterrània (DM) i altres dietes riques en fruites i hortalisses s’han considerat una bona manera de reduir la majoria de factors de risc de malalties CV ja que són riques en components bioactius, vitamines i minerals, fibra, i àcids grassos mono i poliinsaturats. En aquest estudi ens hem focalitzat en els polifenols, un grup de compostos que ens aporten la major part d’antioxidant de la dieta i que s’ha demostrat que tenen efectes beneficiosos per a la salut ja que milloren alguns factors de risc com ara l’aterosclerosi, la resistència a la insulina, els biomarcadors d’inflamació, o la pressió arterial, entre d’altres. Els polifenols són un grup de compostos molt heterogeni i nombrós: hi ha centenars de molècules descrites en diferents aliments i begudes. Aquesta varietat és un problema a l’hora d’estudiar-ne l’efecte, la biodisponibilitat o els mecanismes que expliquen els seus beneficis i, sovint, s’opta per escollir només un polifenol o un grup reduït de polifenols i estudiar-lo amb detall. No obstant, això impedeix tenir una visió global i els grups de polifenols més minoritaris han quedat sistemàticament exclosos dels estudis. Així doncs, aquest treball pretén, en primer lloc, estimar el contingut de polifenols totals ingerits a través de la dieta en la població espanyola de l’estudi PREDIMED (PRevención con DIeta MEDiterránea) i valorar l’associació d’aquests amb el risc de patir una malaltia CV i el risc de mortalitat. Els qüestionaris de freqüència de consum (QFC) són una eina àmpliament utilitzada en estudis nutricionals. No obstant, els biomarcadors nutricionals són un bon complement ja que cobreixen les limitacions pròpies dels qüestionaris. Aquesta tesi fa una revisió dels últims avenços en biomarcadors de consum de polifenols i s'explica un mètode colorimètric ràpid i senzill, adaptat del mètode de Folin-Ciocalteu (F-C), per determinar polifenols en orina. La hipertensió és un dels factors de risc CV més freqüents i estudiats. Es coneix que la ingesta d'aliments rics en polifenols pot ajudar a disminuir la pressió arterial (PA) i per tant, evitar un d’aquests factors de risc. En aquesta tesi es revisen les últimes evidències sobre la influència dels polifenols sobre la PA i els mecanismes d'acció que explicarien aquest efecte. Aquests coneixements s'han aplicat en la població PREDIMED per demostrar que, efectivament, la disminució de la PA està mediada per l’increment dels nivells d’òxid nítric (NO) en plasma. Les begudes alcohòliques han estat tradicionalment una font de conflicte quan es tracta d’establir recomanacions nutricionals o dietètiques, ja que la línia entre el benefici i el risc és molt fina i els efectes dels excessos d’alcohol han suposat una mala publicitat per al sector. Volíem doncs, aportar més informació sobre el consum, sempre moderat, de vi i la síndrome metabòlica, un desordre metabòlic que resulta de la combinació dels principals factors de risc CV: obesitat, hipertensió, dislipèmia i hiperglucèmia. / According to the World Health Organization (WHO), more than a quarter of the world’s population suffers from a circulatory system-related disease. Nowadays, cardiovascular (CV) diseases are the leading cause of mortality and disability in developed countries. Our role as researchers is to study the risk factors of these diseases and how to reduce them. In this study, we focused on polyphenols, a large and heterogeneous group of compounds with proven benefits for our health. Such variety becomes a problem when studying their effects. This is the reason why usually only one polyphenol or a group of polyphenols is chosen to study in detail. However, this does not allow a global view and minor polyphenol groups have been systematically excluded from the studies. Therefore, this thesis aims, firstly, to estimate the total intake of polyphenols in the Spanish PREDIMED (PRevención con DIeta MEDiterránea) population and to evaluate the association of dietary polyphenols with a lower risk of CV disease or mortality. Food Frequency Questionnaires (FFQ) are widely used in nutritional studies. However, nutritional biomarkers are good complements because they cover the limitations of FFQ. This thesis reviews recent evidences on biomarkers of polyphenol intake. Moreover, a new, fast and simple method to determine polyphenols in urine is explained. This method was an adaptation of the colorimetric Folin-Ciocalteu (F-C) method. Hypertension is a very frequent and much studied CV risk factor. It is known that consumption of polyphenol-rich foods helps to decrease blood pressure (BP). We reviewed the last evidences about the influence of polyphenols on BP and the mechanisms of action that explain this effect. This knowledge has been applied to the PREDIMED population to demonstrate that, indeed, the BP decrease was mediated by the increase in plasma nitric oxide (NO). Alcoholic beverages have traditionally been a source of conflict when it comes to establishing dietary recommendations, since the consequences of excessive alcohol intake create a bad image for the products. Therefore, our aim was to provide more information about moderate wine consumption and metabolic syndrome, a disorder arising from a combination of the main CV risk factors: obesity, hypertension, dyslipidaemia and hyperglycaemia.

Las distintas fracciones de flavanoles en el vino ejercen una influencia directa sobre la astringencia, pudiendo variar su proporción y concentración debido a ciertas labores enológicas, es por esta razón que el objetivo del presente trabajo fue estudiar los flavanoles de uvas y vinos de los cv. Cabernet Sauvignon y Sauvignon Blanc y la influencia que presentan algunos factores enológicos sobre sus características químicas y sensoriales. En uvas del cv. Cabernet Sauvignon, el precio de esta no tiene relación con el contenido de compuestos fenólicos, solo presentando una tendencia a un mayor contenido de taninos totales en las pieles de las bayas. La concentración de proantocianidinas difiere ampliamente dependiendo del método utilizado. Por su parte, la fracción polimérica de flavanoles ejerce una influencia directa sobre la astringencia del vino afectando su aceptabilidad. Finalmente los manejos enológicos en vinos blancos y tintos tienen directa relación sobre la concentración de compuestos fenólicos, produciendo además cambios en la concentración y en la proporción de las distintas fracciones de flavanoles. / The different proanthocyanidins fractions in wine have a direct influence on the astringency and certain oenological practices could be affect their proportion and concentration. For this reason the aim of this work was to study the proanthocyanidins in grapes and wines from cv. Cabernet Sauvignon and Sauvignon Blanc and the influence on chemical and sensory characteristics using some oenological practices on their chemical and sensorial properties by using some oenological factors. The price of Cabernet Sauvignon grapes is not related with the phenolic composition only presenting a tendency to a higher content of total tannins in the grape skins. Proanthocyanidins concentration differs widely depending of the methodologies utilized. Moreover, the proanthocyanidin polymeric fraction has a direct influence on wine astringency affecting the consumer acceptance. Finally the oenological practices in white and red wines are directly related to the concentration of phenolic compounds producing changes in the concentration and proportion of the different proanthocyanidin fractions.

Crystallization of honey is a common process of the honey industry. Liquid honey is preferred by most of the consumers and by food companies for ease of handling. Honey is commonly heated during pasteurization in order to liquefy it and inhibit any microbial growth. However, heating can degrade the main quality parameters of honey. A better method compared to expensive and time-consuming heating is desirable to pasteurize, accelerate the liquefaction and retard the crystallization process in honey. The present thesis documents the work done at investigating the effect of the ultrasounds (US) in honey liquefaction, quality alteration and honey decontamination. Firstly, in Chapter 1, the effect of different combinations of US treatment (power, temperature and duration) on honey liquefaction were evaluated by studying the rheological properties of honey; viscosity behaviour, crystal content, tendency to re-crystallization and thermal properties. Secondly, in Chapter 2, the effects of US on the hydroxymethylfurfural concentration and diastase activities in honey were determined by chemical analysis and compared with that for standard heat-treated honey samples. Thirdly, in Chapter 3, US treatment was investigated for honey decontamination. In addition, the in vitro antimicrobial and antifungal activities of ultrasonicated honey against several types of microorganisms were evaluated. The results obtained in this research point to a successful application of the ultrasound technology for the liquefaction of honey, as it speeds up its liquefaction, do not degrade the quality and the intrinsic biological activity of honey was neither affected.

La hipertensió és un dels principals factors de risc cardiovascular, sent el problema més important de salut pública i la principal causa de mort i discapacitat en els països desenvolupats. El primer pas per a prevenir la hipertensió és seguir una dieta saludable, com és la dieta Mediterrània i millorar l'estil de vida, augmentant l'activitat física o reduint el pes corporal. Diversos estudis epidemiològics relacionen de manera inversa el consum d'aliments rics en polifenols com el cacau, fruites, verdures i hortalisses (F&V), te, oli d'oliva verge, nous o vi, i el risc de mortalitat total o malalties cardiovasculars. L'objectiu principal del present treball ha estat posar a punt i validar la metodologia per a l'anàlisi dels polifenols totals en mostres d'orina i la seva correlació amb la hipertensió i la pressió arterial sistòlica i diastòlica en pacients d'alt risc cardiovascular.S'ha desenvolupat un mètode sensible, específic, ràpid i senzill per a la quantificació de polifenols totals en un gran nombre de mostres d'orina obtinguda de forma puntual, amb un tractament de mostra molt senzill. Aquest mètode és més barat i respectuós amb el medi ambient en utilitzar menys reactius que els mètodes anteriors. La validació del mètode es basa en els resultats obtinguts a partir d'un estudi prospectiu aleatoritzat, creuat, amb diferents períodes d'intervenció i es va corroborar en un estudi transversal amb 60 voluntaris amb una població free-living. En aquests estudis es van trobar associacions positives entre els polifenols totals excretats en l'orina del matí, el consum de polifenols totals i el consum total de F&V; pel que es va poder considerar als polifenols totals excretats en orina com a biomarcador del consum de polifenols totals.S'ha avaluat l'efecte del consum dels polifenols en la hipertensió arterial en 263 homes i 326 dones amb alt risc cardiovascular, amb edats compreses entre 55 i 80 anys, dins d'un sub-estudi transversal amb dades de l'estudi PREDIMED. En els individus en el quartil més alt d'excreció de polifenols totals, el risc d'hipertensió va disminuir en un 36% a comparació amb el quartil més baix d'excreció de polifenols totals. La ingesta de polifenols totals, avaluats a través de la seva excreció en orina, es va associar negativament amb els nivells de pressió arterial sistòlica i diastòlica. En un altre treball es van revisar els principals estudis epidemiològics que relacionen el consum de polifenols totals i la pressió arterial. En l'últim treball es presenta un sub-estudi d'intervenció amb 1139 participants d'alt risc cardiovascular dins de l'estudi PREDIMED. Els participants van ser assignats a una dieta baixa en greix (dieta control), n=379 o a dues dietes estil mediterrània, una suplementada amb oli d'oliva verge, n=394 i l'altra amb fruits secs, n=366. La dieta mediterrània suplementada amb fruits secs o oli d'oliva verge es va correlacionar positivament amb els polifenols totals excretats en les mostres d'orina puntual. Novament els increments estadísticament significatius en l'excreció de polifenols totals, en un estudi d'intervenció, es van associar negativament amb la pressió arterial sistòlica i diastòlica, en una població mediterrània d'avançada edat. Per tant, una intervenció dietètica dirigides a incrementar la ingesta d'aliments rics en polifenols, podria ser eficient en la prevenció i el tractament de la hipertensió, unit a una disminució la pressió arterial, per tal de reduir el seu risc cardiovascular. / "The polyphenols present in food as functional components in the prevention and possible treatment of hypertension". TEXT:Hypertension is a major cardiovascular risk factors, being the most important problem of public health and the leading cause of death and disability in developed countries. The first step to prevent hypertension is to follow a healthy diet as the Mediterranean and improving lifestyle. The main objective of this study was to develop and validate the methodology for the analysis of total polyphenols (TP) in urine samples to evaluate if the TP in urine are correlated with polyphenol intake, to be considered as a marker of intake of these compounds, and its correlation with hypertension and systolic and diastolic blood pressure in patients at high cardiovascular risk.We have developed a sensitive, specific, rapid and simple assay for quantification of polyphenols in a large number of spot urine samples. This method is cheaper and environmentally friendly by using less reactive than previous methods. It was performed a prospective randomized crossover trial and one cross-sectional study with 60 volunteers from the PREDIMED trial. These studies found positive associations between TP excreted in spot urine samples and consumption of TP, and with total fruits and vegetables intake.We evaluated the effect of consumption of polyphenols in arterial hypertension in 589 patients at high cardiovascular risk, within the PREDIMED study. In individuals in the highest quartile of excretion of TP, the risk of hypertension decreased by 36% compared with the lowest quartile. The TP intake assessed by excretion in urine was negatively associated with levels of systolic and diastolic blood pressure. In the sub-intervention study (1139 participants), participants were assigned to a low-fat diet (n=379) or two Mediterranean-style diet. The Mediterranean diet supplemented with nuts (n=366) or virgin olive oil (n=394) were positively correlated with TP content excreted. Statistically significant increases in the excretion of TP were negatively associated with systolic and diastolic blood pressure after the Mediterranean diet supplemented. Therefore, a dietary intervention aimed at increasing the intake of foods rich in polyphenols, may be efficient in the prevention and treatment of hypertension, coupled with a decrease in blood pressure, to reduce their cardiovascular risk.

Se investiga la presencia de larvas de anisákidos por los métodos de disección y digestión en 1960 especímenes de pescado fresco capturados durante diferentes periodos en la zona pesquera de Tarragona (España), al noroeste del mar Mediterráneo.Las ocho especies sometidas a estudio son sardinas (Sardina pilchardus) (160 ejemplares), boquerones (Engraulis encrasiocholus) (153 ejemplares), bacaladillas (Micromesistius poutassou) (166 ejemplares), merluzas (Merluccius merluccius) (267 ejemplares), brótolas (Phycis blennoides) (123 ejemplares), fanecas (Trisopterus minutus capelanus) (84 ejemplares), caballas (Scomber scombrus) (456 ejemplares) y jureles (Trachurus trachurus) (155 ejemplares).No se hallan larvas en sardinas ni en boquerones. La presencia de anisákidos se detecta en bacaladilla con prevalencias entre 18,7% y 28,4% según el periodo, merluza (14,2%-19%), caballa (9,5%-18,5%) y en menor proporción en brótola (4,7%-8,4%), jurel (7,1%) y faneca (1.2%). La intensidad media de infección más elevada corresponde a las caballas con 6,3 larvas y a las brótolas con 5, mientras que el resto de especies, presentan entre 1 y 3,3 larvas.Las localizaciones preferentes de las larvas de anisákidos en el pescado son sobre todo la cavidad pertoneal, el hígado (principalmente en merluza y bacaladilla) y la serosa digestiva (caballa, jurel y brótola). Se presentan en mucha menor proporción en la musculatura.El género Anisakis es el más común y frecuente identificado mientras que los géneros Contracaecum e Hysterothylacium se observaron en porcentajes menores. Además, el género Hysterothylacium es el único que se presenta en brótolas y fanecas.Se confirma que en algunas especies de pescado estudiadas (merluza), la presencia de anisákidos varía proporcionalmente con la edad del pez. La edad se deduce mediante las variables de la longitud y del peso.En algunas especies de pescado (bacaladilla y caballa) también se aprecian fluctuaciones debidas a factores temporales a lo largo de los periodos en los que se realiza el estudio.