The present dissertation aim a contributing to both agricultural economics and marketing literature by addressing specific issues related to discrete choice models and choice experiments. More precisely, this thesis focuses on two main issues: 1) new tools to tackle with preference heterogeneity; and 2) new response formats to allows researchers to take into account the information provided by no chosen profiles. These two issues have generated three studies, which form the main core of this thesis: two are related to issue 1) (Chapters 2 and 3), while the third one is related to the issue 2) (Chapter 4). In the first one, we evaluate consumers' preferences heterogeneity using a methodological framework with two novelties over past studies: 1) it accounts for both preference heterogeneity around the mean and the variance of random parameters; and 2) it considers both socio-demographic characteristics of consumers as well as their attitudinal factors. Results suggest that the proposed framework significantly increase the good-of-Fit and provides more useful insights for policy analysis. The most important attribute affecting consumers' preferences towards extra virgin olive oil are the price and the product's origin. The consumers perceive the organic olive oil attribute negatively, as they think that it is not worth paying a premium for a product that is healthy in nature. The second paper hypothesizes that differences in consumers' personality traits, such as food-related personality traits, purchasing habits and lifestyles, affect consumers' preferences for extra virgin olive oil. The methodological framework is based on the specification of an extended hybrid choice model (HCM), which was estimated following a two-step procedure. In the first step, a structural equation model was estimated to test hierarchical relationships between latent variables to explain purchasing intentions towards an organic olive oil. In the second step, the resulting latent variables were introduced in a random parameter logit (RPL) model to investigate the main determinants of consumers' choices related to extra virgin olive oil. The results from this study reinforce the need to include the psychological characteristics of consumers to better explain how individuals make food choices and to better understand the decision maker's process. Interestingly, Catalan consumers perceive a disutility from the organic attribute compared to other production system alternatives (conventional and PDO), while subjective norms and a higher perception of behavioural control only partially mitigate this effect. Environmental or health concerns seem to not be relevant to consumers' choices related to organic olive oil as the conventional olive oil is already perceived as a healthy product per se. In the third paper, we compares the ability of hypothetical and non-hypothetical choice experiment respect to incentive compatible ranking conjoint analysis and incentive compatible sequential best worst scaling. The comparison done in terms of estimated partworths, internal and external predictive power, estimated WTP, and participants' response consistency. In general, the results reveal higher preferences regularity between the respondents across the different treatments implying not statistically difference in the marginal participants' WTP. Additionally, the participants behave similarly whether there are asked to choose or to state their most preferred through the two ranking elicitation mechanism. The best worst scaling (BWS) format has been revealed to outperform the other formats in terms of predictive power as its cognitive process seems to better fits the natural tendency of humans at identifying the extreme values. / Esta tesis doctoral trata de realizar algunas contribuciones relevantes para el campo de la Economía y el Marketing Agroalimentario en el diseño de los experimentos de elección y en la estimación de los modelos de elección discreta. Concretamente, la tesis aborda dos cuestiones principales: 1) la utilización de nuevas herramientas de estimación que tengan en cuenta la heterogeneidad de las preferencias de los consumidores; 2) el diseño de nuevos formatos de respuesta en los que se tenga en cuenta la información proporcionada por las opciones de productos no elegidas en los conjuntos de elección. Estas dos cuestiones se han abordado en los tres capítulos centrales en los que se estructura la tesis. Los dos primeros capítulos están relacionados con la heterogeneidad de las preferencias (capítulo 2 y 3), mientras que el tercero está relacionado con la segunda cuestión (capítulo 4). En el Capítulo 2, el análisis de la heterogeneidad de las preferencias se ha basado en la utilización de dos herramientas novedosas en relación a la literatura existente: 1) la consideración explícita de la heterogeneidad de la preferencia en torno tanto a la media como a la varianza de los parámetros aleatorios; y 2) la inclusión no sólo de las características socio-demográficas de los consumidores sino también de las lexicográficas. Los coeficientes estimados y los momentos de la distribución de la Disposición a Pagar (DAP) han sido comparadas con las obtenidas en el modelo más utilizado en la literatura, el modelo Logit de parámetros aleatorios (RPL). Los resultados indican que el marco metodológico propuesto permite incrementar significativamente la bondad del ajuste, por lo que se obtienen estimaciones más precisas sobre las que orientar las posibles estrategias de marketing. Desde el punto de vista aplicado, el precio y el origen del producto son los atributos que más influyen en las preferencias de los consumidores hacia el aceite de oliva virgen extra. Los consumidores perciben negativamente el atributo oliva ecológico ya que piensa que no merece la pena pagar un sobreprecio para un producto que ya es considerado como sano en sí mismo. El Capítulo 3 se dedica especialmente a una cuestión que en el capítulo anterior sólo se consideró parcialmente, y es el efecto de las variables psicográficas y las actitudes en el proceso de toma de decisiones de compra por parte de los consumidores. La hipótesis de partida es que los rasgos de la personalidad de los consumidores así como sus hábitos de compra y estilos de vida, determinan sus preferencias; en este caso, hacia el aceite de oliva virgen extra. El marco metodológico adoptado se basa en la especificación de un modelo de elección híbrida extendido (HCM), que se estimó siguiendo un procedimiento a dos etapas. En la primera etapa, se estimó un modelo de ecuaciones estructurales para determinar las relaciones jerárquicas entre las variables latentes con el objetivo de explicar las intenciones de compra de los consumidores hacia el aceite de oliva ecológico. En la segunda etapa, las variables latentes resultantes fueron introducidas en un modelo Logit de parámetros aleatorios (RPL) con el fin de estudiar los factores determinantes de la elección del aceite de oliva virgen extra por parte de los consumidores. Los resultados de este Capítulo refuerzan la idea de la necesidad de tener en cuentas factores de personalidad y actitudes a la hora de analizar las preferencias de los consumidores y sus procesos de toma de decisiones. Consistente con el capítulo anterior, el atributo ecológico no es relevante a la hora de elegir un aceite de oliva en relación a otros sistemas de producción (convencional y Denominación de Origen Protegida), mientras que las normas subjetivas y una mayor percepción de control del comportamiento sólo atenúan parcialmente este efecto. Las preocupaciones ambientales o de salud parecen no tener ningún impacto relevante en las elecciones de los consumidores del aceite de oliva ecológico. En el Capítulo 4 se hace una revisión de los diferentes formatos de respuesta que se han venido utilizando en la literatura en el análisis conjunto, prestando atención especial a los formatos de ranking (RCA) y de escalas mejor/peor (BWS). En un contexto no hipotético se comparan estos dos formatos con el experimento de elección tradicional, tomando como referencia el experimento tradicional hipotético. La comparación se hace teniendo en cuenta los parámetros estimados, la capacidad predictiva tanto interna como externa, la consistencia de las respuestas de los participantes y los valores calculados de la Disposición a Pagar. En general, los resultados revelan una cierta consistencia de los resultados, al menos en términos de la Disposición a Pagar. Asimismo, los dos métodos basados en un ranking generan resultados similares, tanto si se considera únicamente la opción preferida como la totalidad del ranking. Sin embargo, globalmente, el método de escalas mejor/peor (BWS) parece comportarse mejor en relación al resto de formatos en términos de capacidad predictiva, lo que parece confirmar que este tipo de formato se adapta mucho mejor a la tendencia natural de los seres humanos a la identificación de los valores extremos

Tesi per compendi de publicacions. La consulta íntegra de la tesi, inclosos els articles no comunicats públicament per drets d'autor, es pot realitzar prèvia petició a l'Arxiu de la UPC / Saccharomyces cerevisiae is one of the yeasts with major economic, social, and health significance in human culture. Depending on the growth conditions experienced by the cell, S. cerevisiae growth can proceed via fermentative, respirative, or respirofermentative metabolism. Scar formation, unequal division, a limited replicative lifespan, and increase in cell size commensurate with the cell's replicative age are individual characteristics of this yeast affecting the performance of bioprocesses. These characteristics increase the complexity of predictive models and introducing them with ease into a continuous model is not realistic. Nevertheless, an individual-based model is able to accommodate this complexity in a single computational model. Once an individual model is implemented, it has to be parameterized, calibrated, and its adequacy assessed. All these processes ideally require a high number of both individual and system-level experimental observations. The aim of the present thesis is to advance the development of an individual-based methodology to tackle the study of microbial systems driven by the relevant yeast S. cerevisiae. The adequacy of INDISIM-YEAST, an existing individual-based model of a generic budding yeast, is first assessed. In order to obtain valuable individual-based observations to support the desired individual-based methodology, the diversity of S. cerevisiae in experimental individually-oriented observations under different growth conditions and at different stages of the growth curve is verified and assessed. A quantitative individual-based model focusing on the fermentative (anaerobic) growth of the yeast S. cerevisiae has been designed, implemented in Fortran 90, and termed INDISIM-Saccha. The developed model is parameterized, calibrated, its adequacy evaluated, and used to assess in silico ethanol production by means of virtual experiments. The calibration procedure, and the performance and analysis of the data from the virtual experiments is undertaken using the statistical programming language R. The model adequacy is assessed by testing several model predictions both at a system level (glucose depletion, population growth curves) and single-cell level (fraction of budded cells, genealogical age distribution, and cell diameter distribution evolutions). Individual cell diameter observations obtained within the present thesis play a significant role in this assessment. Results of the virtual experiments suggest that differences in cell size distribution can drastically affect the performance and productivity of fermentations, and encourage routine characterization of the inocula in the biotechnological industry. INDISIM-Saccha is also adapted to take into account the aerobic growth of S. cerevisiae and contrasted with two experimental trials with different oxygen levels in the medium. The preliminary simulated results achieved with the model suggest that the approach also has the potential for reproducing aerobic batch cultures of S. cerevisiae. This represents a further step in obtaining a microbial individual-based model to account for the whole set of metabolic alternatives experienced by S. cerevisiae. In order to communicate efficiently, increase accessibility, and favour usability of the INDISIM-Saccha methodology developed, the present thesis also designs and implements INDISIM-YEAST-NL in the freely available programming environment NetLogo. The implementation of this streamlined model in NetLogo lays the foundations for a deeper understanding of the developed methodology and microbial individual-based models in general, and will facilitate future interactions with potential users of INDISIM-Saccha. / El Saccharomyces cerevisiae és un dels llevats que gaudeix de més significació econòmica, social i per a la salut humana. Depenent de les condicions experimentades, el llevat S. cerevisiae pot créixer mitjançant un metabolisme fermentatiu, respiratori o respirofermentatiu. La formació de cicatrius, una divisió desigual, una vida replicativa limitada i un increment de la mida de la cèl.lula amb l’edat replicativa són característiques individuals d’aquest llevat que afecten el comportament dels bioprocessos. Aquestes característiques incrementen la complexitat dels models predictius i dificulten, per tant, la seva inclusió en un model continu de manera realista. No obstant això, un model basat en l’individu sí que és capaç d’acomodar tota aquesta complexitat en un únic model computacional. Una vegada implementat, un model basat en l’individu ha de ser parametritzat, calibrat i la seva adequació ha de ser avaluada. Tots aquests processos requereixen idealment un gran nombre d’observacions experimentals, tant individuals com a nivell del sistema estudiat. L’objectiu general de la tesi present és avançar en el desenvolupament d’una metodologia basada en l’individu per estudiar sistemes microbians conduïts pel llevat S. cerevisiae. Primerament s’avalua l’adequació de INDISIM-YEAST, un model basat en l’individu, ja existent, focalitzat en un llevat genèric. Es verifica i s’avalua la diversitat del S. cerevisiae en observacions experimentals orientades a l’individu en diferents condicions de creixement i en diversos estadis de la corba de creixement de la població. Això permet obtenir observacions basades en l’individu molt valuoses a l’hora de donar suport a la metodologia desitjada. Es desenvolupa i s’implementa en Fortran 90 INDISIM-Saccha, un model quantitatiu basat en l’individu i focalitzat en el creixement fermentatiu (anaerobi) del S. cerevisiae. El model desenvolupat és parametritzat, calibrat, la seva adequació és avaluada i és utilitzat per estudiar in silico la producció d’etanol mitjançant experiments virtuals. El procés de calibratge, l’obtenció i l’anàlisi de les dades dels experiments virtuals s’han realitzat utilitzant el programari estadístic R. L’adequació del model s’avalua testejant diferents prediccions del model a nivell de sistema (corbes de disminució de la glucosa i de creixement de la població) i a nivell de la cèllula individual (evolucions temporals de la fracció de cèl.lules gemades, de la distribució d’edats genealògiques i de la distribució dels diàmetres cel.lulars). Les observacions del diàmetre de les cèl.lules individuals obtingudes a la tesi present juguen un paper significatiu en aquesta avaluació. Els resultats dels experiments virtuals suggereixen que les diferències en la distribució de mides cel.lulars poden afectar dràsticament l’evolució i la productivitat de les fermentacions i suggereixen una caracterització rutinària de l’inòcul a la indústria biotecnològica. L’INDISIM-Saccha també és adaptat per tenir en compte el creixement aeròbic del S. cerevisiae i és contrastat mitjançant dos assajos experimentals amb dos nivells d’oxigen al medi. Els resultats preliminars de la simulació denoten que aquesta aproximació també té el potencial de reproduir cultius discontinus aerobis del S. cerevisiae. Això representa un pas endavant cap a l’obtenció d’un model basat en l’individu que tingui en compte tot el conjunt d’alternatives metabòliques experimentades pel S. cerevisiae. Finalment, aquesta tesi també dissenya i implementa INDISIM-YEAST-NL en l’ambient de programació lliure anomenat NetLogo per tal de comunicar de manera eficient, d’incrementar l’accessibilitat i d’afavorir l’ús de la metodologia INDISIM-Saccha. La implementació d’aquest model simplificat amb NetLogo posa les bases per a una comprensió més alta de la metodologia desenvolupada, i dels models microbians basats en l’individu en general, i facilitarà futures interaccions amb usuaris potencials de l’INDISIM-Saccha.

La obesidad y los trastornos de la conducta alimentaria (TCA) constituyen los mayores problemas que debe afrontar la salud pública en adolescentes, no solo por su alarmante prevalencia, sino también debido a sus serias consecuencias tanto físicas como psicosociales. Asimismo, se ha demostrado que la obesidad es un factor de riesgo para el desarrollo de los TCA, y que algunos de estos (principalmente aquellos de tipo bulímico) a su vez pueden favorecer el desarrollo y el mantenimiento de la obesidad. Todo esto sugiere un solapamiento en los factores de riesgo para la obesidad y los TCA. El hecho de comer o no comer, conlleva consecuencias, en el exceso como en la restricción, ocasionando enfermedades como la obesidad, el trastorno por atracón, la bulimia y la anorexia nerviosa. El presente trabajo está focalizado en el estudio de dichas patologías, las cuales son integradas bajo el rótulo de problemas relacionados con el peso y la alimentación. El objetivo central de esta tesis ha sido esclarecer la definición fenotípica-nosológica de los problemas relacionados con peso-alimentación. Para tal fin, se han llevado a cabo 4 estudios, mediante los que se analizaron semejanzas y diferencias entre pacientes con distintas patologías alimentarias (obesos con y sin TCA y TCA con y sin obesidad), en cuanto a psicopatología general, sintomatología alimentaria y personalidad (estudios 1 y 2); buscando además identificar factores de riesgo y factores asociados, específicos y compartidos (estudios 3 y 4) entre ambas patologías. Resultados: 1 La presencia de múltiples problemas relacionados con peso-alimentación (pe. TCA, Obesidad), a lo largo de la vida, es frecuente y va asociado a mayor gravedad psicopatológica y sintomatológica. 2 La obesidad sin TCA ocupa una posición intermedia en cuanto a psicopatología (general y alimentaria) entre controles en normo-peso, con menor psicopatología, y los TCA, en el extremo opuesto. 3 El perfil de personalidad de los obesos presenta similitudes con el perfil de los TCA, principalmente con BN y TA. Rasgos de personalidad disfuncionales como alta evitación del daño y baja autodirección están presentes en obesidad y en TCA pero con diferencias cuantitativas (apareciendo más acentuados cuanto mayor es la sintomatología alimentaria). 4 En cuanto a los aspectos socioculturales y familiares, algunas influencias alimentarias de la infancia, como un ambiente familiar negativo y las burlas de amigos sobre la figura corporal, fueron compartidas entre las situaciones extremas de peso (TCA en bajo peso y obesidad), mientras que otros factores fueron específicos de cada uno de ellos. 5 Determinados patrones alimentarios durante la infancia fueron especialmente relevantes en individuos obesos. 6 La asociación hallada entre BDNF y conciencia interoceptiva confirma la existencia de interacciones entre factores biológicos y psicopatológicos en conductas alimentaria anormales. Los resultados obtenidos van en concordancia con las evidencias empíricas que indican la existencia de nexos de unión entre los TCA y la obesidad. El solapamiento de distintos factores de riesgo y factores asociados entre ambas patologías aporta evidencia sobre la necesidad de tener en cuenta dichos nexos de unión en programas, tanto de prevención primaria como secundaria. / Introduction Obesity and eating disorders are, currently, the major problems among the teenager population that has to face social security. Not only due to its alarming prevalence, but also because of its serious physical and psychosocial consequences. Eating or not eating leads to consequences, both as excess or restriction, that cause diseases such as obesity, binge eating disorders (BED), bulimia nervosa (BN) and anorexia nervosa. The job presented here is focused in the study of such pathologies, which are integrated under the labeling of weight-related problems. Objectives: With the main objective of clarifying the phenotypic-nosological definition of weight-related problems, the thesis presented here aims at: 1- Analyze clinical variables (eating symptomatology and psychopathology) and traits of personality, common and specific, among people with different eating pathologies (Obese with or without ED and ED with or without obesity). 2- Identify risk and associated factors for weight-related problems. For this purpose, 4 independent but complementary research studies were developed: 1. Lifetime Obesity in Patients with Eating Disorders: Increasing Prevalence, Clinical and Personality Correlates. 2. Loss of Control Over Eating: a Description of the Eating Disorder/Obesity Spectrum 3. Eating Related Environmental Factors in Underweight Eating Disorders and Obesity: Are there Common Vulnerabilities during Childhood and Early Adolescence? 4. Correlation of BDNF Blood Levels with Interoceptive Awareness and Maturity Fears in Anorexia and Bulimia Nervosa Patients. Results: The results obtained are in agreement with the empirical evidences that point to the existence of commons links between ED and obesity. The presence of multiple lifetime weight-related problems is frequent and is associated with increased psychopathological and symptomatological severity. Obesity without ED occupies an intermediate position, in relation to psychopathology, among control group, with lower psychopathology, and the ED, in the opposite end. Dysfunctional personality traits such as high Harm Avoidance and low Self-Directedness are present in obesity and in ED but with quantitative differences (being worst when the eating symptomatology is more severe). Conclusion: The overlap of distinct risk and associated factors among both pathologies provides evidence for the need to take into account such links in prevention and treatment programs.

Endoplasmic reticulum (ER) stress response, also called UPR (Unfolded Protein Response), has an important role either in liver lipid metabolism and hepatic steatosis, which is the hepatic manifestation of the Metabolic Síndrome (MS). It has been reported that some polyphenols reduce lipid acumulation in vitro and in vivo. In contrast, saturated fatty acids rich-diet promotes UPR activation and hepatic steatosis in vivo. Due to the intersection of the ER stress signaling pathways and hepatic lipid metabolism, we hypothesized that the polyphenols ability to reduce lipid accumulation induced by saturated fatty acids treatment could be mediated by a reduction in the UPR in vivo and in vitro. The results suggest that grape seed proantocianidins extract (GSPE) and docosahexaenoic acid (DHA) are able to reduce ER stress in a rat model of diet-induced obesity. Surprisingly, in HepG2 cells acute treatments, resveratrol (RSV) enhanced both toxicity and apoptosis induced by palmitate. Elucidation of the molecular mechanisms that participate in this effect led us to study the membrane saturation and, specifically, the enzyme SCD1 as an important target in the action of this polyphenol. The impairment in the capacity to “mobilize” the cellular saturation activated UPR mechanisms and the related apoptosis. In contrast to what obtained in acute treatments, the chronic RSV preconditioning has a protective effect in palmitate-induced ER stress in HepG2 cells due to a decrease in pro-apoptotic molecules (PUMA, CHOP) expression and, thus, an improvement in the adaptive ability of these cells against stronger ER stress inducers. / La respuesta a estrés de retículo endoplasmático (RE), también conocida como UPR (del inglés, Unfolded Protein Response), tiene un papel muy destacado en el metabolismo lipídico hepático, así como en la esteatosis hepática. Se ha descrito que los polifenoles reducen la acumulación lipídica in vitro e in vivo. Por otra parte, se ha observado que una dieta rica en ácidos grasos saturados promueve la activación de la UPR y la esteatosis hepática in vivo. Debido a la interacción existente entre las vías de señalización de estrés del RE y la regulación de la lipogénesis hepática, en esta tesis nos planteamos demostrar si la capacidad de los polifenoles para reducir la acumulación lipídica inducida por el tratamiento con ácidos grasos saturados podría ser mediada en parte por una disminución en la respuesta a estrés de RE in vivo e in vitro. En conclusión, los resultados de esta tesis sugieren que las proantocianidinas de la pepita de uva (GSPE) y el DHA tienen capacidad para reducir el estrés de RE en ratas modelo de obesidad. Sorprendentemente, los tratamientos agudos con resveratrol (RSV) en células HepG2 exacerbaron la toxicidad y apoptosis producida por el palmitato. La elucidación de los mecanismos moleculares que participan en dicho efecto apuntó a la saturación de la membrana y concretamente a la enzima SCD1 como diana importante en la acción del polifenol. La afectación en la capacidad de “movilización” de la saturación celular disparó los mecanismos de estrés de RE y la correspondiente apoptosis. En contraposición a lo obtenido en experimentos agudos, el precondicionamiento crónico con RSV tiene un efecto protector frente al estrés de RE inducido por palmitato en células HepG2 debido a una disminución en la expresión de moléculas proapoptóticas (CHOP, PUMA) y, por tanto, a una mejora en la capacidad adaptativa de estas células frente a posibles inductores de estrés de mayor magnitud.

Els peixos carnívors estan adaptats a la utilització d'elevades quantitats de proteïnes. Aquestes són el component essencial de la seva dieta natural. D'altra banda, els peixos carnívors presenten una certa intolerància a la glucosa, ja que tenen una baixa capacitat per aprofitar els carbohidrats de la dieta. Aquesta característica queda reflectida en l'elevada hiperglicèmia postprandial que s'observa en alimentar els peixos carnívors amb dietes d'elevat contingut en carbohidrats. Pel que fa a la producció de peixos en cultiu, dietes d'elevat contingut en proteïnes resulten en un increment del cost de producció, així mateix condueixen a problemes ecològics. L'alliberament, junt amb excretes, d'elevades quantitats d'amoni condueixen a l'eutrofització de les aigües. D'altra banda, la necessitat de proteïnes per a la preparació de pinsos, està produint a nivell global una creixent esquilmació de les espècies d'origen marí.La glucoquinasa (GCK) és un l'enzim que participa en la primera reacció de la glucòlisi fosforilant la glucosa a glucosa -6- fosfat. És un enzim essencial per al manteniment de la homeòstasi de la glucosa. Regula un dels cicles substrat clau de les vies glucòlisi/gluconeogènesi. Inicialment, una de les hipòtesi que s'havia suggerit per explicar la baixa utilització de la glucosa pels peixos carnívors, era l'absència d'activitat GCK en fetge d'aquestes espècies. El clonatge i posterior expressió del cDNA que codifica per a la GCK hepàtica d'orada (Sparus aurata) ha permès demostrar la seva existència i funcionalitat en peixos carnívors. Estudis recents han demostrat que l'expressió de la GCK d'orada i d'altres espècies de peixos carnívors està regulada en funció de les condicions nutricionals, tals com: estats de dejuni-realimentació, restricció energètica, composició de la dieta o regulació postprandial. Aquests estudis permeten descartar, per tant, la hipòtesi que suggeria l'absència de la GCK en fetge de peixos com a causa de la intolerància d'aquests animals a la glucosa.Per tal d'aprofundir en les bases moleculars que regulen el metabolisme de carbohidrats en peixos carnívors, ens vam plantejar l'estudi de la regulació de l'expressió del gen GCK en fetge d'orada. Específicament ens vam proposar clonar i caracteritzar el promotor d'aquest gen. La realització d'experiments de transfecció transitòria i assajos de retardació en gel ens han permès determinar que els factors de transcripció SREBP-1a, Sp1 i Sp3 estan implicats en la regulació transcripcional de GCK. Mitjançant diferents experiments, hem demostrat que SREBP-1a és un factor de transcripció que pot ser molt important en l'activació transcripcional de gens que codifiquen per enzims clau en el metabolisme de carbohidrats. A més de l'efecte observat com a activador de la GCK hepàtica d'orada, hem detectat que SREBP-1a també transactiva el promotor de la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa (PFKFB1) de fetge d'orada, enzim clau en la regulació de les vies glucòlisi-gluconeogènesi.Així mateix, ens vam proposar estudiar els processos moleculars que condueixen a l'activació transcripcional de GCK a través d'insulina. El factor de transcripció Sp1 actua com a mediador de l'acció de la insulina sobre l'expressió de la GCK hepàtica d'orada.D'altra banda, altres resultats obtinguts ens suggereixen que la localització subcel·lular de la GCK hepàtica d'orada podria estar regulada per una proteïna homòloga a la proteïna reguladora de la GCK (GKRP) de mamífers. / Carnivorous fish have poor ability to use dietary carbohydrates and control blood glucose levels. Compared with mammals, these animals show prolonged hyperglycemia after a glucose load or when feeding on high carbohydrate diets. The relative inability of carnivorous fish to use carbohydrates has being reported as being due, in part, to absence of glucokinase (GCK) activity in the liver. The cDNA coding for GCK was isolated from piscine liver and the functionality of the fish GCK was shown. We showed that gilthead sea bream (Sparus aurata) tolerates partial replacement of dietary protein by carbohydrates through a mechanism that involves modulation of the hepatic expression of key enzymes in intermediary metabolism. The expression of GCK is strictly regulated at the transcriptional level by hormonal and nutritional status. To study the mechanism underlying the transcriptional regulation of GCK expression in this species, we isolated the promoter region of S. aurata GCK, and showed that transcription factor Sp1 enhances GCK transcription through binding to a Sp box. Furthermore we provided the evidence that the Sp1/Sp3 ratio in the liver may mediate the insulin regulation of GCK transcription. In this regard, the participation of Sp1 as an effector of insulin signaling pathways is a topic of rising interest. We demonstrated that SREBP-1a binds and transactivates the S. aurata GCK promoter and presented evidence suggesting that Sp1, rather SREBP-1a, mediates insulin-dependent simulation of GCK transcription, and addressed the involvement of Sp1 in insulin-dependent activation of GCK transcription.

La sobre expressió de les hidrofilines STF2 i SIP18 en soques de laboratori, tenen un efecte positiu en la tolerància a la deshidratació i rehidratació. A més, la sobre expressió de SIP18 en quatre soques comercials de llevat industrial mostra el mateix fenotip que les soques de laboratori sense alterar els paràmetres de la fermentació. Aquests resultats ens permeten proposar la sobre expressió de SIP18 com una possible forma de millorar la viabilitat en el llevat sec actiu (LSA) i obtenir així un inòcul d'alta qualitat per les empreses alimentàries. A més es disminuirien els costos d'emmagatzematge i transport. La sobre expressió de la hidrofilina SIP18 "preadapta" les cèl·lules incrementant la capacitat de tolerància a la deshidratació i posterior rehidratació degut tan a l'acumulació intracel·lular de SIP18 com als canvis d'expressió proteica que la sobre expressió de SIP18 comporta. Nosaltres hem mostrat l'expressió diferencial de 45 proteïnes que incrementen la seva abundància i 27 que disminueixen durant l'estrès com a conseqüència de la sobre expressió de SIP18. Algunes d'aquestes proteïnes han estat identificades en el procés d'assecat i rehidratació per primera vegada. Hem identificat altres molècules involucrades en aquest procés d'estrès mitjançant una anàlisi de QTL de dos soques de llevat comercials. Entre els onze gens caracteritzats que van mostrar diferències en la seqüència d'aminoàcids, només la sobre expressió de cinc d'ells mostra un canvi en la viabilitat després de la imposició a l'estrès en els dos contextos genètics analitzats. Aquests resultats mostren que la tolerància a la deshidratació no només depèn de l'activació o inhibició de determinats gens implicats en el procés d'estrès estudiat, sinó també de la seqüència aminoacídica dels al·lels. Els resultats presentats en aquesta tesi doctoral aprofundeixen en el coneixement dels mecanismes moleculars i els metabòlits involucrats en la tolerància a la deshidratació per a la producció adequada de LSA. No obstant això, també serveix com a model per a futures recerques en l'emmagatzematge de teixits en condicions de deshidratació. / La sobre expresión de las hidrofilinas STF2 y SIP18 en cepas de laboratorio, tienen un efecto positivo en la tolerancia a la deshidratación y rehidratación. Además, la sobre expresión de SIP18 en cuatro cepas comerciales de levadura industrial muestra el mismo fenotipo que las cepas de laboratorio sin alterar el proceso fermentativo. Estos resultados nos permiten proponer la sobre expresión de SIP18 como una posible forma de mejorar la viabilidad en la levadura seca activa (LSA) y obtener así un inóculo de alta calidad para las industrías alimentarias. Además se disminuirían los costes de almacenamiento y transporte. La sobre expresión de la hidrofilina SIP18 "preadapta" las células incrementando la capacidad de tolerancia a la deshidratación y posterior rehidratación debido no sólo a la acumulación intracelular de SIP18, sino también a los cambios de expresión proteica que la sobre expresión de SIP18 conlleva. Nosotros hemos mostrado la expresión diferencial de 45 proteínas que incrementan su abundancia y 27 que disminuyen durante el estrés como consecuencia de la sobre expresión de SIP18. Algunas de éstas proteínas han sido identificadas en el proceso de secado y rehidratación por primera vez. Hemos identificado otras moléculas involucradas en este proceso de estrés mediante un análisis de QTL de dos cepas de levadura comerciales. Entre los once genes caracterizados que mostraron diferencias en la secuencia aminopeptídica, sólo la sobre expresión de cinco de ellos muestra un cambio en la viabilidad después de la imposición al estrés en los dos contextos genéticos analizados. Estos resultados muestran que la tolerancia a la deshidratación no sólo depende de la activación o inhibición de determinados genes implicados en el proceso de estrés estudiado, sino también de la secuencia de los alelos. Los resultados presentados en ésta tesis doctoral profundizan en el conocimiento de los mecanismos moleculares y los metabolitos involucrados en la tolerancia a la deshidratación para la producción adecuada de LSA. Sin embargo, también sirve como modelo para futuras investigaciones en el almacenamiento de tejidos en condiciones de deshidratación. / Over expression of STF2 and SIP18 hydrophilin in laboratory has a positive effect on desiccation tolerance. Moreover, over expression of SIP18 in four commercial wine yeast strains produced the same desiccation phenotype as in the laboratory strain without altering fermentative performance. These common results lead us to propose the over expression of SIP18 as a possible way of improving the viability in Active Dried Wine Yeast (ADWY) formulations resulting in savings in transport and storage costs and some extend develope a high-quality inoculum for the food industry. Over-expression of the SIP18 hydrophilin ‘preadapts’ cells by increasing their capacity to overcome and enhance dehydration and rehydration stress. This cell preadaptation is due both to SIP18 accumulation and to changes in the expression of the membrane’s proteomic profile as a consequence of SIP18 accumulation. We shown that 45 proteins increased in numbers after stress imposition and 27 were found to be down regulated, some of which were identified for the first time in this study. Other molecules playin a leading role in enhancing dehydration tolerance were identified using QTL analysis in two commercial wine yeast strains. Characterization of genes with sequence changes between alleles showed that only over expression of five out of eleven genes had different viability for both genetic backgrounds. These results led us to suggest that dehydration tolerance is not gene induced but rather depends on the specific amino acid sequence of each allele in conjunction with other genes activating or inhibiting their function. The results present in this doctoral thesis not only deepen our understanding of the molecular mechanisms and metabolites involved in desiccation tolerance for the production of ADWY, but also serve as a model for future research in tissue storage without the need for a hydric solution.

La pectina va ser descoberta en 1790 quan Vauquelin va trobar primerament una substància soluble dels sucs de fruita. El científic francès Braconnot va continuar el treball de Vauquelin qui va trobar que "una substància àmpliament disponible de plantes vives i ja observada en el passat, tenia propietats gelificants quan se li afegia àcid a la seva solució". La va anomenar "pectina àcida" del grec "pectos" que significa sòlid, coagulat. (The Apple. The Pectin, Herbstreith). La pectina va ser definida per Kertesz (1951) com els àcids pectínics solubles en aigua de grau de metilació variat que són capaços de formar gels amb sucre i àcid sota condicions determinades. Aquesta definició abasta la gelificació amb calci dels àcids pectínics, definits per Kertesz (1951) o com els àcids poligalacturònicos coloidals aïllats de plantes contenint una certa proporció de grups metilèster. Per aquest motiu també el terme pectina s'usa col·lectivament per a incloure àcid pèctic, la forma de pectina completament desestirificada. Les formes de pectina són generalment reconegudes com segures per l'O.S. Food and Drug Administration (Food and Nutrition Encyclopedia, 1983). Les especificacions legals per a pectines estan enunciades internacionalment (Copenhagen Pectin) / La pectina fué descubierta en 1790 cuando Vauquelin encontró primeramente una sustancia soluble de los zumos de fruta. El científico francés Braconnot continuó el trabajo de Vauquelin y encontró que "una sustancia ampliamente disponible de plantas vivas y ya observada en el pasado, tenía propiedades gelificantes cuando se le añadía ácido a su solución". La llamó "pectina ácida" del griego "pectos" que significa sólido, coagulado. (The Apple. The Pectin, Herbstreith).La pectina fué definida por Kertesz (1951) como los ácidos pectínicos solubles en agua de grado de metilación variado que son capaces de formar geles con azúcar y ácido bajo condiciones determinadas. Esta definición abarca la gelificación con calcio de los ácidos pectínicos, definidos por Kertesz (1951) o como los ácidos poligalacturónicos coloidales aislados de plantas conteniendo una cierta proporción de grupos metiléster. De ahí que también el término pectina se usa colectivamente para incluir ácido péctico, la forma de pectina completamente desesterificada.Las formas de pectina son generalmente reconocidas como seguras por la U.S. Food and Drug Administration (Food and Nutrition Encyclopedia, 1983). Las especificaciones legales para pectinas están enunciadas internacionalmente (Copenhagen Pectin)

Teniendo en cuenta la importancia del aroma en la aceptación de los alimentos por parte del consumidor, en esta Memoria abordamos el estudio de la fracción aromática del zumo de naranja, así como las posibles alteraciones que pueda sufrir durante el procesado industrial. El análisis de componentes volátiles totales se realiza mediante la aplicación de la destilación- extracción simultánea (SDE). Esta técnica es favorable en la recuperación de componentes de menor volatilidad que el disolvente orgánico utilizado, por lo que es adecuado para el análisis de hidrocarburos terpénicos, así como aldehídos, alcoholes y ésteres de elevado peso molecular. La microextracción en fase sólida se aplica para el análisis de componentes volátiles en espacio de cabeza, empleando para ello dos recubrimientos poliméricos, uno de naturaleza apolar PDMS (polidimetil siloxano) y otro de naturaleza polar PA (poliacrilato). El estudio de la fracción aromática del zumo de naranja exprimido a mano muestra la elevada eficiencia de la microextracción en fase sólida para la determinación de los componentes volátiles frente a la destilación-extracción simultánea. En el análisis de componentes volátiles totales, treinta y seis componentes son identificados frente a los cuarenta y ocho detectados en espacio de cabeza. Estas diferencias se asocian a las pérdidas de los componentes de elevada volatilidad durante la destilación y posterior concentración. El análisis de la fracción aromática presente en el zumo de naranja exprimido a mano y el zumo pasteurizado revela la importancia de la riqueza del zumo en constituyentes de elevada volatilidad. El zumo pasteurizado presenta un perfil aromático pobre en estos componentes y una mayor abundancia en constituyentes característicos del aceite esencial de la naranja, incorporados al zumo durante el proceso de extracción industrial. Este efecto queda más remarcado cuando se emplea polidimetil siloxano que poliacrilato como recubrimiento polimérico. Se deduce la importancia del empleo de un tipo de fibra u otro dependiendo de la composición y naturaleza de la muestra a estudiar. La incidencia del procesado industrial sobre la fracción aromática muestra un efecto positivo en la disminución de la concentración de determinados componentes como decanal y terpineol que a elevadas concentraciones desarrollan aromas desagradables, frente a la pérdida de los componentes de mayor volatilidad caracterizados por conferir al zumo el aroma frutal. Se estudia la afinidad de los distintos componentes aromáticos hacia la pulpa fina y el suero, resaltando la asociación de la mayoría de los constituyentes de la fracción aromática a la pulpa. Se determina la composición aromática en la pulpa gruesa, destacando que esta podría ser utilizada como fuente para enriquecer la fracción aromática de los zumos de naranja procesados en la industria. El índice de madurez de la fruta afecta a la calidad de la fracción aromática del zumo. Se observa el incremento de la concentración de acetaldehído, etanol y acetato de etilo, componentes definitorios de la calidad de la fruta fresca, y la disminución de los aldehidos característicos del aceite esencial de la naranja, valeraldehído, octanal, nonanal, decanal y neral, frente a un aumento de la concentración de carvona, considerada como índice de degradación de la fracción aromática del zumo. / The importance of the aroma in food is known because of the acceptance by the consumer. For this reason, in this work we study the aromatic fraction present in orange juice, as well as, the changes that could happen during the industrial processing. In the analysis of volatile compounds we used steam-distillation-extraction (SDE) device. This technique is suitable for the determination of components with lower volatility than the solvent used. Solid phase-microextraction (SPME) has been chosen for the analysis of the head-space in orange juice. Two polymeric fibers coatings were used: Polidymeti1xilosane (PDMS) y Polyacrilate (PA). The study of volatile components in hand-squeezed orange juice by SPME shows the high efficiency of this device. 48 components were isolated, while 36 by SDE. These differences are associated with the leaks which happened during the distillation and the subsequent concentration step. The comparative analysis between hand-squeezed and pasteurised orange juice shows the importance of the components with high volatility in the juice aroma. Pasteurised orange juice presents a poor profile in these components and a high concentration in charactetistic essential oil components, these are incorporated during the extraction process. These differences were more indicated when PDMS was applied This highlights the importance of the polymeric coating in the analysis of volatile components. The influence of the industrial processing on the aromatic fraction shows a positive effect, since it is favourable in the decrease of the concentration of certain compounds like decanal and -terpineol When these components are present in a high concentration, they develop a typical of fflavour. However, there is a big loss in the presence of components with high volatility, which are characterised to produce the delicate fresh orange juice flavour. Another parameter studied is the distribution of voIatile compounds between the pulp and the serum, and most of them are associated with the pulp.The aromatic fraction isolated from the thick pulp, confirm that these products can be used as a source of volatile components to improve the aroma in the processed orange juice. The ripening ratio in fue fruit describes the aroma quality of the fruit juice, in this way, we observed an increase in the concentration of acetaldehyde, ethanol and ethyl acetate (components which define the fresh fruit quality). However, a decrease in the characteristics components of the essential oil, like valeraldehyde, octanal, nonanal y decana! was determined. Carvona increases its concentration. This compound has been considered as a degradation index of fue aromatic fraction.

Antecedents: L'aparell digestiu del nounat és ràpidament colonitzat després del naixement. El tipus d'alimentació podria influïr aquest procés. Les fórmules infantils tracten d'imitar l'efecte bifidogènic de la llet humana mitjançant l'addició de prebiòtics. Encara que estudis previs han avaluat els efectes dels prebiòtics en nounats, cap d'ells, va estudiar l'efecte de Orafti Synergy1 (inulina enriquida amb oligofructosa) durant els primers 4 mesos de vida. Objectiu: Demostrar l'eficàcia, seguretat i tolerància d'una fórmula infantil suplementada amb 0,8 g/dl de SYN1 durant els primers 4 mesos de vida. Mètodes: Diseny a doble cec, prospectiu, aleatoritzat i paral·lel amb 2 grupos de neonats alimentats amb fórmula infantil amb o sense (control) suplementació (0.8 g/100ml SYN1) durant 4 mesos. En paral·lel, també s'ha fet el seguiment d'un grup de nens alimentats amb llet materna (LM). Es va avaluar: antropometria, balanç hídric, paràmetres sanguinis, ingesta i acceptació de la fórmula, símptomes digestius, efectes adverses, comportament del nen, malalties, dermatitis atòpica, freqüència i consistència de les deposicions i microbiota fecal. Resultats: 252 nounats van ser assignats al grup control o grup suplementat (124 controls i 128 SYN1) i 131 al grup LM. Els nadons del grup suplementat (SYN1) van mostrar una composició de la microbiota més propera a la dels nadons amb LM, amb una tendència a un major recompte de Bifidobacteries. Les deposicions van ser més toves i la freqüència de deposicions va ser més alta en comparació amb els controls. No hi va haver diferències entre les fórmules en qualsevol dels paràmetres de seguretat i tolerància. Conclusió: Una fórmula infantil suplementada amb SYN1 0.8 g/dL durant els primers 4 mesos de vida és ben tolerada, segura i eficaç. / Antecedentes: El aparato digestivo del recién nacido es rápidamente colonizado después del nacimiento. El tipo de alimentación podría influir este proceso. Las fórmulas infantiles tratan de imitar el efecto bifidogénico de la leche materna mediante la adición de prebióticos. Aunque estudios previos han evaluado los efectos de los prebióticos en recién nacidos, ninguno de ellos, estudió el efecto de Orafti Synergy1 (inulina enriquecida con oligofructosa) durante los primeros 4 meses de vida. Objetivo: Demostrar la eficacia, seguridad y tolerancia de una fórmula infantil suplementada con 0,8 g/dl de SYN1 durante los primeros 4 meses de vida. Métodos: Diseño a doble ciego, prospectivo, aleatorizado y paralelo con 2 grupos de neonatos alimentados con fórmula infantil con o sin (control) suplementación. En paralelo, también se ha hecho el seguimiento de un grupo de niños alimentados con leche materna (LM). Se evaluó: antropometría, balance hídrico, parámetros sanguíneos, ingesta y aceptación de la fórmula, síntomas digestivos, efectos adversos, comportamiento del niño, enfermedades, dermatitis atópica, frecuencia y consistencia de las deposiciones y microbiota fecal. Resultados: 252 recién nacidos fueron asignados al grupo control o grupo suplementado (124 controles y 128 SYN1) y 131 al grupo LM. Los bebés del grupo suplementado (SYN1) mostraron una composición de la microbiota más parecida a la de los bebés con LM, con una tendencia a un mayor recuento de bifidobacterias. Las deposiciones fueron más blandas y la frecuencia de deposiciones fue más alta en comparación con el grupo control. No hubo diferencias entre las fórmulas en cualquiera de los parámetros de seguridad y tolerancia. Conclusión: Una fórmula infantil suplementada con SYN1 0.8 g/dL durante los primeros 4 meses de vida es bien tolerada, segura y eficaz. / Background: The newborn digestive tract is rapidly colonized after birth. Feeding type could influence this process. Infant formulas try to mimic the bifidogenic effect of human milk by addition of prebiotics. Although previous studies assessed the effects of prebiotics in newborns, none of these, to our knowledge, studied the effect of Orafti Synergy1 (oligofructose-enriched inulin) during the firsts 4 months of life. Aim: To demonstrate the efficacy, safety and tolerance of a 0.8 g/dL SYN1 supplemented infant formula during the firsts 4 months of life. Methods: In a double-blind, randomized, placebo-controlled and parallel trial, formula fed healthy term newborns were randomized to receive a control (controls) or SYN1 supplemented infant formula (SYN1). Breastfed newborns (BF) were also followed up for comparison. Anthropometry, water balance, blood parameters, formula intake and acceptance, digestive symptoms, adverse events, child’s behaviour, infant’s illnesses, atopic dermatitis, stools frequency and characteristics and faecal microbiota were assessed. Results: A total of 252 formula fed infants were randomized at birth (124 controls, 128 SYN1) and 131 BF infants were recruited; after 4 months 68 controls, 63 SYN1 and 57 BF completed the study. SYN1 infants showed a microbiota composition closer to that of BF infants, with a trend towards higher Bifidobacterium cell counts, softer stools and a higher deposition frequency compared to controls. There were no differences between formulas in any of the safety parameters such as growth, relevant adverse events, water balance or blood parameters. Conclusion: A 0.8 g/dL SYN1-supplemented infant formula during the first 4 months of life is well tolerated, safe and effective, promoting a gut microbiota closer to that promoted by breastfeeding.

Alcoholic fermentation is a complex microbial process that is characterized by a succession of different species of yeasts. Yeasts with low fermentation activity, such as Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. and Kluyveromyces spp., are predominant in grape musts and during the early stages of fermentation. Subsequently, Saccharomyces cerevisiae proliferates, dominates and completes the wine fermentation. Non-Saccharomyces spp. can contribute to the aroma properties and chemical composition of the resulting wine. However, they can be both beneficial and harmful. For a good control of the wine making process, cellars need fast, simple and reliable methods for identifying and typing yeasts as well as for detecting and enumerating yeasts.The objectives of this thesis were: (i) to develop molecular techniques for characterization, identification and quantification of wine yeasts, (ii) to evaluate the usefulness of these techniques to identify and quantify yeasts isolated from natural samples of wine fermentation. For this purpose, we used the oligonucleotides based on the repetitive extragenic palindromic (REP) and enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) elements described in bacteria to characterize reference yeast strains. We also evaluated the usefulness of the complementary primers to ISS (intron splice site) for the same objective. We also developed real-time, or quantitative, PCR (QPCR) to rapidly detect and quantify the total number of yeasts, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in wine without culturing and we also performed a reverse transcriptase QPCR (RT-QPCR) assay from rRNA for total viable yeast quantification. We later validated all these techniques with natural samples of wine.We characterized 41 reference strains belonging to 15 species by three PCR methods: PCR-ISS, ERIC-PCR and REP-PCR. We demonstrated the reproducibility of the techniques, but some problems of reproducibility were sometimes detected with the REP-PCR. The REP-PCR amplification patterns from strains of the same species were identical and some polymorphism was detected by PCR-ISS and ERIC-PCR in strains of the same species. In spite of this intraspecific variability, the strains of the same species showed enough species-specific bands to enable yeast identification. Therefore, all three techniques are useful for rapid, simple and relatively cheap yeast identification. Afterwards, we proved the usefulness of these PCR techniques to monitor yeast diversity during industrial wine fermentation. We evaluated how the growth dynamics of non-Saccharomyces yeasts is affected by new winemaking practice of cold maceration, and by grape maturity. Half of the isolates were ascribed to Candida stellata, Hanseniaspora uvarum and H. osmophila. The other isolates we identified were identified as minor species. As general conclusions we could indicate that the higher the degree of ripeness, the higher the proportion of C. stellata in the grape must. Also, it seemed that cold maceration favored the presence of H. osmophila, C. tropicalis and Z. bisporus. We also developed a QPCR assay for detecting and quantifying the total yeast population, Saccharomyces spp. and Hanseniaspora spp. in a sample of wine. The QPCR assays were first conducted on reference yeast strains from pure cultures to detect the specificity of the primers. We later validated this technique with artificially contaminated and natural samples of wine and compared the results with those obtained from plating to determine effectiveness of QPCR. We obtained a very good correlation between the predicted number of cells determined by QPCR and by plating. The detection of RNA by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is considered to be a better indicator of cell viability than the detection of DNA. We compared total yeast quantification by plating and by QPCR using DNA as template with Saccharomyces cerevisiae quantification using RNA. The counts obtained by the three methods were similar. / La fermentació alcohòlica és un procés microbià complex que es caracteritza per una successió de diferents espècies de llevats. Llevats amb una baixa activitat fermentativa, com són Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. i Kluyveromyces spp., són predominants en el most i durant els primers dies de fermentació. Posteriorment, Saccharomyces cerevisiae prolifera, domina i completa la fermentació alcohòlica. Els llevats anomenats no-Saccharomyces spp. poden contribuir a les propietats aromàtiques i composició química del vi resultant. No obstant, aquests llevats poden ser tant beneficiosos com perjudicials. Per a un bon control del procés de vinificació, els cellers necessiten mètodes ràpids, senzills i fiables per a la identificació i tipificació de llevats a l'igual que per detectar i enumerar llevats.Els objectius d'aquesta tesi eren: (i) desenvolupar tècniques moleculars per a la caracterització, identificació i quantificació llevats vínics, (ii) avaluar la utilitat d'aquestes tècniques per identificar i quantificar llevats aïllats de mostres reals de fermentacions alcohòliques. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar els oligonucleòtids basats en repeticions d'elements palindròmics extragèniques (REP) i repeticions d'elements consensus entobacterials intergènics (ERIC) descrits en bacteris per caracteritzar soques de llevats de referència. També vam avaluar la utilitat dels primers complementaris a ISS (intron splice site) amb el mateix objectiu. També vam desenvolupar la PCR a temps real o PCR quantitativa (QPCR) per detectar i quantificar de manera ràpida el nombre total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en vi sense cultiu en placa i també vam realitzar la reacció de la transcriptasa inversa i posteriorment QPCR (RT-QPCR) a partir de rRNA per a la quantificació de llevats totals viables. Posteriorment, vam validar totes aquestes tècniques amb mostres reals de vi.Vam caracteritzar 41 soques de referència pertanyents a 15 espècies amb tres tècniques: PCR-ISS, ERIC-PCR i REP-PCR. Vam demostrar la reproduïbilitat de les tècniques, però amb la tècnica REP-PCR vam detectar alguns problemes de reproduïbilitat. Els patrons d'amplificació REP-PCR de soques de la mateixa espècie eren idèntics i amb la PCR-ISS i ERIC-PCR vam detectar alguns polimorfismes en soques de la mateixa espècie. Malgrat aquesta variabilitat intraespecífica, les soques de la mateixa espècie mostraven força bandes espècie-específiques que permetien la identificació del llevat. Per tant, les tres tècniques són útils per a una ràpida, senzilla i relativament barata identificació de llevats.Posteriorment, demostràrem la utilitat d'aquestes tècniques per monitoritzar la diversitat de llevats durant una vinificació industrial. Vam avaluar com la dinàmica de creixement dels llevats no-Saccharomyces spp. podia veure's afectada per la pràctica de la maceració en fred, i per el grau de maduresa del raïm. La meitat dels aïllats eren Candida stellata. Hanseniaspora uvarum i H. osmophila. Els altres aïllats eren identificats com a espècies minoritàries. Com a conclusions generals, podem indicar quecom més alt el grau de maduresa, més alta la proporció de C. stellata en el most. També, sembla que la maceració en fred afavoreix la presència de H. osmophila, C. tropicalis i Z. bisporus.També vam desenvolupar la tècnica de la QPCR per detectar i quantificar la població total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en una mostra de vi. Els assaigs de QPCR eren conduits primer sobre cultius purs de soques de llevats de referència per tal de detectar l'especificitat dels primers. Més tard, validàrem aquesta tècnica amb vi contaminat artificialment i amb mostres reals de vi i comparàrem els resultats obtinguts amb aquells obtinguts per cultiu en placa per determinar l'eficàcia de la QPCR. Vam obtenir una bona correlació entre el número predit de UFC per QPCR i per plaqueig. La detecció de RNA mitjançant PCR prèvia reacció de la transcriptasa inversa (RT-PCR), es considera un millor indicador de viabilitat que la detecció de DNA. Vam comparar la quantificació dels llevats totals per plaqueig i per QPCR utilitzant DNA i utilitzant RNA. El recompte obtingut amb els tres mètodes fou similar.