Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Contagious ecthyma, also known as orf, is an infectious disease of sheep and goats caused by orf virus (ORFV), the prototype of the genus Parapoxvirus (PPV) of the family Poxviridae. Current vaccines against the disease contain virulent virus, are empirically produced through skin scarification of live lambs and present questionable efficacy. Likewise, the epidemiology of the infection, especially the mechanisms used by the virus to be perpetuated in herds and possible genetic and antigenic variations are poorly understood. Thus, the objectives of this study were: a. Development and efficacy testing of a vaccine produced in tissue culture; b. Investigation of viral persistence in experimentally infected lambs and, c. Phylogenetic analysis of Brazilian strains. Chapter 1 describes the development and testing of a ORFV vaccine produced in tissue culture. For this, ORFV strain IA-82 was submitted to 21 passages in BHK-21 cells and used to immunize lambs (n=30) through skin scarification of the internal face of the hind limb. Vaccination produced localized pustules and scabs lesions in 16 out of 30 animals, indicating an adequate replication of the vaccine virus. Ninety days after vaccination, vaccinated (n=16) and control lambs (n=16) were inoculated with a virulent ORFV strain in the labial commissure. Vaccinated and control lambs developed typical orf lesions, characterized by hyperemia, vesicles, pustules and scab formation. Nonetheless, vaccinated animals developed milder lesions compared to controls and the clinical scores were significantly lower (p<0.05) between days 10 and 22 post-challenge. In addition, the mean duration of clinical disease was significantly reduced in vaccinated animals (p<0.05). Furthermore, vaccinated animals excreted much less virus (p<0.05) and for a significantly shorter period of time than did the controls (13.4 days versus 22.6 days, p<0.001). These results demonstrate partial protection by the experimental vaccine and, upon improvement of immunization and protection indices, are promising towards the use of tissue culture-based ORFV vaccines. Chapter 2 presents the investigation of ORFV persistence in experimentally infected lambs. For this, infected lambs were monitored for virus and viral DNA at different intervals after infection. Concomitantly, virus viability in scabs maintained at environmental temperatures was monitored. During acute infection, virus produced typical lesions of ecthyma in all inoculated lambs (n=10), with lesions during over 22 days. Infectious virus was recovered from lesions in titers up to 105.5 TCID50/ml, with peaks of virus excretion between days 10 and 12 post inoculation (pi). The virus was detected continuously in lesions of all animals up to day 24 pi; four lambs shed virus until day 44 pi and one up to day 51 pi. Viral DNA was detected by PCR in all skin biopsies up to day 37 pi, in four animals at day 51, in three animals at day 65 and one at day 79 pi. Infectious virus was detected in scabs maintained under environmental temperatures for up to 6 months. These results demonstrate that ORFV may be maintained and excreted for a long period by infected animals. Chapter 3 presents the sequence analysis of the major envelope glycoprotein gene (B2L) of nine Brazilian ORFV strains from sheep and goats obtained between 2008 and 2011 and three vaccine strains. Comparative sequence analysis revealed that Brazilian strains were highly related among themselves and with vaccine strains. Brazilian strains shared 97.7- 100% and 96.1-100% sequence identity of nucleotides and amino acids, respectively. With vaccine strains, Brazilian ORFVs showed 98.7-100% nucleotide identity and 97.7-100% amino acid similarity. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences showed that the Brazilian strains from sheep and vaccine strains clustered in the same branches; goat strains clustered into a separate branch. In summary, the obtained results contribute to the knowledge about the ORFV biology and epidemiology and are promising towards the use of a tissue culture based vaccine. / O ectima contagioso, também conhecido como Orf, é uma enfermidade contagiosa que afeta principalmente ovinos e caprinos e que está mundialmente distribuída. O agente da enfermidade, vírus do Orf (ORFV), é o protótipo do gênero Parapoxvirus (PPV), família Poxviridae. As vacinas atuais contra a doença apresentam eficácia questionável e são produzidas por métodos cruentos. Da mesma forma, a epidemiologia da infecção, especialmente os mecanismos utilizados pelo vírus para se perpetuar nos rebanhos e as suas possíveis variações genéticas e antigênicas são pouco conhecidas. Assim, os objetivos do presente trabalho foram: a. Desenvolvimento e teste de eficácia de uma vacina para o ORFV produzida em cultivo celular, b. Investigação da persistência viral em ovinos infectados experimentalmente, c. Análise filogenética de amostras brasileiras. O capítulo 1 relata a produção e teste de eficácia de uma vacina produzida em cultivo celular. Para isto, a cepa IA- 82 do ORFV foi submetida a 21 passagens em cultivo de células BHK-21 e usada para vacinar ovinos jovens (n=30), por escarificação cutânea na face interna da coxa. A vacinação produziu pústulas e crostas em 16 dos 30 ovinos vacinados, indicando imunização adequada em 53% dos animais. Noventa dias após a vacinação, ovinos vacinados (n=16) e controles (n=16) foram inoculados com uma cepa virulenta do ORFV (106,9DICC50/mL) após escarificação na comissura labial. Todos os animais desenvolveram lesões típicas de ectima, incluindo hiperemia, vesículas, pústulas e crostas. No entanto, os animais vacinados desenvolveram lesões mais leves e passageiras do que os controles, e os escores clínicos foram estatisticamente diferentes (p<0,05) entre os dias 10 e 22 pós-desafio. Além disso, o tempo de duração da doença foi significativamente inferior (p<0,05) nos animais vacinados. Os animais vacinados também excretaram menor quantidade de vírus (p<0,05) e por um período significativamente mais curto do que os controles (13,4 dias versus 22,6 dias, p<0,001). Esses resultados demonstram a proteção parcial conferida pela vacina experimental e, dependendo da melhoria dos índices de imunização e proteção, são promissores no sentido da utilização de vacinas contra o ORFV produzidas em cultivo celular. O capítulo 2 relata a investigação da persistência do ORFV em ovinos infectados experimentalmente. Para isto, ovinos inoculados com a cepa IA-82 foram submetidos a pesquisa de vírus e de DNA nas lesões a diferentes intervalos após a inoculação. A viabilidade do vírus também foi investigada em crostas de animais infectados mantidas à temperatura ambiente. Durante a infecção aguda, o vírus produziu lesões típicas de ectima em todos os animais inoculados (n=10), com duração de aproximadamente 22 dias. O vírus foi detectado continuamente nas lesões de todos os animais até o dia 24 pós inoculação (pi); quatro animais excretaram vírus até o dia 44 pi e um deles ainda excretava vírus no dia 51 pi. O vírus foi excretado em títulos de até 105,5 DICC50/ml, com picos de excreção viral entre os dias 10 e 12 pi. O DNA viral foi detectado por PCR em biópsias coletadas de todos os animais no dia 37 pi, e em um animal o DNA viral foi detectado até o dia 79 pi. O vírus foi recuperado, por isolamento viral, nas crostas mantidas a temperatura ambiente por até seis meses após a coleta. Esses resultados demonstram que o ORFV pode persistir e ser excretado por longo período em animais infectados, mesmo após a resolução clínica das lesões. O capítulo 3 relata a análise filogenética de nove amostras brasileiras de ORFV obtidas de ovinos e caprinos entre 2008 e 2011, além de três cepas vacinais. A sequência parcial do gene B2L, que codifica para uma proteína de envelope altamente imunogência, foi amplificada por PCR e o fragmento gerado (594 bp) foi submetido ao sequenciamento. A análise das sequências revelou que as amostras brasileiras possuem um alto grau de similaridade, quando comparados entre si e com as cepas vacinais. As amostras brasileiras apresentaram um grau de similaridade de nucleotídeos de 97, 7 a 100% e de aminoácidos de 96,1 a 100%. Quando comparadas com as cepas vacinais, as amostras analisadas apresentaram um grau de similaridade de nucleotídeos de 98,7 a 100% e de aminoácidos de 97,7 a 100%. A análise filogenética baseada na sequência deduzida de aminoácidos mostrou que as amostras de ovinos se agruparam junto com as cepas vacinais, e as amostras de caprinos se agruparam separadamente. Conjuntamente, esses resultados contribuem para o conhecimento acerca da biologia e epidemiologia do ORFV, e são promissores no sentido do uso de vacinas produzidas em cultivo celular.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Contagious ecthyma (orf) is a cutaneous disease that affects sheep and goats, and may be occasionally transmitted to humans. The disease is caused by orf virus (ORFV). ORFV infection produces croustous and proliferative lesions, usually on the nostrils and labial commissures of lambs, and also in the udder, teat skin and coronary bands of adults animals. The pathogenesis of ORFV infection is poorly understood and a search for an adequate animal model is required, yet the disease has been already reproduced in sheep, goats and rabbits. This dissertation relates the clinical, virological and pathological aspects of ORFV infection in rabbits and mice experimental inoculated. Ten rabbits, ten mice and two lambs were inoculated intradermally after skin scarification with an hypodermic needle. A viral suspension of ORFV IA-82 strain (108.5TCID50/mL) was inoculated in the internal face of the ear, back skin and labial commissure of rabbits; internal face of the ear of mice. Lambs were inoculated in the labial commissures and in the internal face of hind limbs. All animals were monitored clinically, virologically, and pathologically for 21 days. All rabbits developed clinical signs in the inoculation sites, begining with mild hyperemia that evolved to macules, papules, vesicle, pustules and scabs. Lesions appeared at days 3 and 4 post-inoculation (pi) and lasted to 3 to 10 days. Viral shedding was detected from days 2 to 14pi. Histological examination of lesions revealed focal proliferative dermatitis with ballooning degeneration and eosinophilic intracytoplasmic inclusions in keratinocytes, histological hallmarks of contagious ecthyma in sheep. A similar, albeit much milder clinical course was observed in 5 out of 10 inoculated mice. All lambs presented characteristic contagious ecthyma clinical and histopathologycal lesions from days 3 to 18pi, and the virus was recovered from lesions between days 2 and 19pi. At day 28pi, seroneutralization test (SN) was unable to detect neutralizing antibodies in all inoculated animals. These findings show that ORFV replicates and produce local lesions in rabbits and mice. However, rabbits are more susceptible to infection and disease, and may be used as an animal model to study some aspects of ORFV pathogenesis. / O ectima contagioso (ou orf) é uma doença infecto-contagiosa de pele que afeta principalmente ovinos e caprinos, e que ocasionalmente pode acometer o homem. O seu agente etiológico é o vírus da orf (ORFV). O ORFV produz lesões proliferativas, geralmente na comissura labial e no plano naso-labial de cordeiros, e também na pele do úbere, nos tetos e no rodete coronário dos cascos de animais adultos. A patogenia da infecção pelo ORFV é pouco conhecida, embora a doença já tenha sido reproduzida em ovinos, caprinos e coelhos. Essa dissertação relata os achados clínicos, virológicos e histopatológicos da infecção experimental de coelhos e camundongos pelo ORFV. Para isso, coelhos, camundongos e cordeiros foram inoculados pela via intradérmica (ID), após escarificação da pele com agulha hipodérmica. A inoculação dos cordeiros serviu como controle positivo. Uma suspensão viral da cepa IA-82 do ORFV (108,5DICC50/mL) foi inoculada na face interna da orelha, na pele do dorso e na comissura labial dos coelhos; na face interna da orelha dos camundongos; e na comissura labial e face interna do membro pélvico dos cordeiros. Os animais foram monitorados por 21 dias nos aspectos clínicos, virológicos e patológicos. Todos os coelhos inoculados apresentaram lesões semelhantes nos locais de inoculação, iniciando com hiperemia, evoluindo para máculas, pápulas, vesículas, pústulas e crostas. Os sinais surgiram 3 a 4 dias pós inoculação (pi) e duraram por 3 a 10 dias. Excreção viral foi detectada entre os dias 2 e 14pi. A análise histológica das lesões revelou dermatite focal proliferativa, com degeneração balonosa e corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos eosinofílicos nos queratinócitos, semelhante às alterações histológicas observadas nos cordeiros. Lesões similares, mas de menor intensidade foram observadas em 5 de 10 camundongos. Os cordeiros, utilizados como controles positivos, apresentaram lesões clínicas e histopatológicas características de ectima contagioso entre os dias 3 e 18pi, sendo que o vírus foi recuperado das lesões entre os dias 2 e 19dpi. No dia 28pi, pelo teste de soroneutralização (SN), não foram detectados anticorpos neutralizantes no soro dos animais inoculados. Esses resultados demonstram que a inoculação de ORFV resulta em replicação viral e produção de lesões em coelhos e camundongos, porém a doença é reproduzida de forma mais consistente em coelhos. Portanto, sugere-se que coelhos possam ser utilizados como modelos para estudos in vivo com o ORFV.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Orf virus (ORFV), the type member of the genus Parapoxvirus of the family Poxviridae, is the etiologic agent of orf or contagious ecthyma, a contagious and ubiquitous disease of sheep and goats. ORFV genome consists of a double stranded DNA molecule with approximately 138 Kb, and contains 131 putative genes. Among those, 15 are novel genes, unique to parapoxviruses, which lack homology to other known viral or cellular genes. In the present study we describe the functional characterization of three of these genes, ORFV024, ORFV002, and ORFV121. Results presented here demonstrate that the proteins encoded by these genes inhibit the activation of the nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway. ORFV-encoded ORFV024 inhibits activation of the NF-κB signaling pathway in the cell cytoplasm by inhibiting phosphorylation of the IκB kinases, IKKα and IKKβ, consequently inhibiting the activation of the IKK complex. Deletion of ORFV024 from the ORFV genome had no significant effect on disease severity, progression or time to resolution in sheep, indicating that ORFV024 does not contribute to ORFV virulence. ORFV-encoded ORFV002 functions in the cell nucleus, where it interacts with the NF-κB subunit NF-κB-p65, inhibiting its acetylation, a p300-mediated modification of NF-κB-p65 which modulates its transcriptional activity. Similarly to ORFV024, deletion of ORFV002 from the ORFV genome had no significant effect on ORFV virulence and disease pathogenesis in sheep. ORFV-encoded ORFV121 functions in the cell cytoplasm, where it binds to and inhibits phosphorylation and nuclear translocation of NF-κB-p65. Deletion of ORFV121 from the ORFV genome resulted in a marked attenuated disease phenotype in sheep, indicating that ORFV121 is a determinant of virulence of ORFV in the natural host. These results indicate that ORFV, like other poxviruses, has evolved multiple strategies to modulate NF-κB, targeting different steps of the signaling pathway. Results obtained in the pathogenesis studies performed here suggest that multiple NF-κB inhibitors encoded by ORFV may exert complementary and/or redundant functions to effectively block host cell responses regulated by the NF-κB signaling pathway. Additionally, it is possible that ORFV-encoded NF-κB inhibitors modulate distinct cellular processes regulated by NF-κB in vivo. A better understanding of ORFV-host interactions may provide valuable insights for the development of improved vaccines against orf, or yet for the development of novel ORFV-based therapeutic agents and vaccine vectors with enhanced safety and efficacy, and a broader applicability. / O vírus da orf (ORFV), protótipo do gênero Parapoxvirus da família Poxviridae, é o agente etiológico da orf ou ectima contagioso, uma enfermidade contagiosa de distribuição mundial que afeta primariamente ovinos e caprinos. O genoma do ORFV consiste de uma molécula de DNA de fita dupla com aproximadamente 138 Kb, que contém presumidamente 131 genes. Dentre estes, 15 são genes novos, identificados apenas nos parapoxvírus e que não possuem homologia com outros genes de origem viral ou celular. O presente estudo descreve a caracterização funcional de três destes genes, ORFV024, ORFV002 e ORFV121. Os resultados apresentados no presente estudo demonstram que as proteínas codificadas pelos genes ORFV024, ORFV002 e ORFV121 inibem a ativação da via de sinalização do fator de transcrição nuclear-kappa B (NF-κB). O produto da ORFV024 bloqueia a ativação da via do NF-κB no citoplasma celular, inibindo a fosforilação das quinases IκB (IKK), IKKα e IKKβ e, consequentemente inibindo a ativação do complexo IKK. A deleção do gene ORFV024 do genoma do ORFV não alterou a severidade, a progressão, ou o tempo de resolução das lesões produzidas pelo ORFV em ovinos, indicando que o produto deste gene não contribui para a virulência do vírus. O gene ORFV002 codifica um inibidor do NF-κB que atua no núcleo das células. O produto do ORFV002 interage com a subunidade NF-κB-p65 do NF-κB, inibindo a sua acetilação, uma modificação pós-traducional do NF-κB-p65 mediada pela acetiltransferase p300 que regula a sua atividade transcripcional. Semelhante ao ORFV024, a deleção do gene ORFV002 do genoma do ORFV não afetou a virulência do vírus nem alterou a patogenia da enfermidade em ovinos. O produto do gene ORFV121 atua no citoplasma das células, onde esta proteína viral interage com o NF-κB-p65 inibindo sua fosforilação e translocação nuclear. A deleção do gene ORFV121 do genoma do ORFV reduziu significativamente a severidade, a progressão e o tempo de resolução da doença em ovinos, indicando que este produto viral constitui-se em um fator de virulência para o ORFV em seu hospedeiro natural. Estes resultados demonstram que, assim como outros poxvírus, o ORFV também desenvolveu múltiplas estratégias para modular a via de sinalização do NF-κB, codificando proteínas que atuam em diferentes eventos desta complexa via de sinalização intracelular. Os resultados obtidos nos estudos de patogenia sugerem que os inibidores do NF-κB codificados pelo ORFV desempenham funções complementares e/ou redundantes, provavelmente, para promover um bloqueio efficiente dos processos biológicos regulados pelo NF-κB. Além disso, estes produtos virais podem modular diferentes processos biológicos controlados pelo NF-κB in vivo. Um melhor entendimento das interações do ORFV com o seu hospedeiro pode favorecer o desenvolvimento de vacinas mais eficazes para o ectima contagioso, ou ainda, promover o desenvolvimento de vacinas vetoriais ou imunoterápicos, baseados no ORFV, mais eficazes e com uma maior espectro de aplicações.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Orf virus (ORFV) belongs to the family Poxviridae, subfamily Chordopoxvirinae and genus Parapoxvirus and is the agent of contagious ecthyma, a mucocutaneous disease that affects mainly young sheep and goats and, occasionally, may affect people. The clinical lesions progress through stages of hyperemia, papules, vesicles, pustules, ulcers and proliferative and scabby lesions, located mainly on the labial commissure, lips and nostrils. Variable clinical lesions with different degrees of severity often occur in sheep and goats, and may be associated with host and/or viral genetics. The present study aimed to investigate the phenotype in vivo and to characterize virulence genes of four ORFV isolates recovered from contagious ecthyma outbreaks in Rio Grande do Sul State, Brazil. Twenty sheep, aged 6 and 8 months, were divided into five groups of four animals each and inoculated in the labial commissure with homogenates of scabs (viral titers 105.6TCID50/ml) obtained from different outbreaks: SV269/11, SV252/11, SV581/11 and SV820/10-Canguçu. The animals were evaluated for 30 days in clinical and virological aspects by clinical inspection and swab collection for virus isolation. A clinical score was established for each animal and group. All ORFV inoculated animals developed classical ecthyma contagious lesions, characterized by hyperemia, papules, macules, vesicles, pustules and scabs in varied degrees and duration. SV269/10 and SV820/10-Canguçu isolates induced more severe lesions resulting in higher clinical scores and longer duration of lesions. The animals inoculated with SV581/11 developed milder lesions and clinical scores significantly lower than other groups, but they shed virus for a longer period of time. For genetic analyses, PCR amplification and nucleotide sequencing of three virulence genes (VEGF, VIR and IL-10v) were performed. Deletion and mutations on VEGF and IL-10v amino acid sequence of SV581/11 and SV252/11 isolates were identified. The degree of amino acid identity among ORFV sequences was variable, and the lowest homology was found in the VEGF gene of SV581/11 when compared with the standard strains and other viruses. Thus, the present results showed that SV581/11 and SV252/11 isolates, particularly the former, are less virulent in sheep than SV269/11 and SV820/10-Canguçu. Possibly, the variable phenotypic observed in vivo is due to genetic alterations detected in the analyzed virulence genes. / O vírus da orf (ORFV) pertence à família Poxviridae, subfamília Chordopoxvirinae gênero Parapoxvirus e é o agente etiológico do ectima contagioso, uma doença mucocutânea que afeta principalmente ovinos e caprinos jovens e pode, ocasionalmente, afetar pessoas. Clinicamente, a enfermidade evolui com a formação de áreas hiperêmicas, vesículas, pústulas, úlceras e lesões proliferativas e crostosas sobre a pele dos lábios, comissura labial e narinas. Apresentações clínicas variáveis, com diferentes graus de severidade, ocorrem frequentemente e podem estar associadas a características do hospedeiro e, principalmente, a características genéticas do agente. O presente trabalho teve como objetivo investigar o fenótipo in vivo e caracterizar genes de virulência de quatro amostras de ORFV oriundas de surtos no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Para isso, foram utilizados vinte ovinos, com idade entre 6 e 8 meses, divididos em cinco grupos de quatro animais cada. Os ovinos foram inoculados na comissura labial com homogeneizados de crostas (títulos virais 105,6 DICC50/ml) obtidas dos surtos (amostras SV269/11, SV252/11, SV581/11 e SV820/10-Canguçu). Os animais foram avaliados durante 30 dias com relação aos aspectos clínicos e virológicos, por inspeção clínica e coleta de suabes das lesões para detecção da excreção viral. As manifestações clínicas foram convertidas em um escore clínico, para cada animal e para os grupos. Os animais inoculados com os as quatro amostras desenvolveram lesões típicas de ectima contagioso, caracterizadas por hiperemia, pápulas, máculas, vesículas e pústulas, e formação de crostas em diferentes graus de intensidade e duração. As amostras SV269/10 e SV820/10-Canguçu induziram lesões mais graves, escores clínicos maiores e maior tempo de duração das lesões. Os animais inoculados com a amostra SV581/11 desenvolveram lesões e escores clínicos significativamente inferiores aos demais grupos, mas excretaram o vírus por período mais longo. Para a caracterização genética, foi realizada a amplificação por PCR e sequenciamento de nucleotídeos de três genes de virulência (VEGF, VIR e IL-10v). Foram identificadas deleções e mutações nas sequências dos genes VEGF e IL-10v das amostras SV581/11 e SV252/11. O grau de identidade de aminoácidos entre as amostras foi variável, sendo que a menor homologia foi encontrada no gene VEGF da amostra SV581/11, quando comparado com os demais vírus e a cepa padrão. Assim, os resultados obtidos demonstram que as amostras SV581/11 e SV252/11, em especial a primeira, foram menos virulentas em ovinos do que as amostras SV269/11 e SV820/10-Canguçu. Possivelmente essa diferença fenotípica observada in vivo seja resultado das alterações genéticas detectadas nos genes de virulência.