2-Cys Prx compõem um grupo de enzimas antioxidantes homodiméricas que atuam na decomposição de hidroperóxidos utilizando uma cisteína reativa (cisteína peroxidásica - CysP). A alta reatividade da CysP é alcançada com o envolvimento de dois aminoácidos vicinais à CysP: uma treonina e uma arginina, que constituem a tríade catalítica. Após a decomposição do hidroperóxido, a CysP forma um dissulfeto intermolecular com um segundo resíduo de cisteína (cisteína de resolução - CysR), o qual é reduzido pela tiorredoxina (Trx). Durante o ciclo redox, estas enzimas sofrem alterações estruturais, mas os mecanismos envolvidos neste processo eram pouco compreendidos. Neste trabalho foi obtida a estrutura cristalográfica de Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, uma 2-Cys Prx. Através de abordagens envolvendo bioquímica e biologia molecular, foi verificada a importância de aminoácidos envolvidos na reatividade e em transições da estrutura terciária e quaternária. Por fim, foram realizados esforços para a determinação da estrutura cristalográfica de mutantes obtidos neste trabalho. / 2-Cys Prx constitute a group of homodimeric antioxidant enzymes that act in the decomposition of hydroperoxides using a reactive cysteine (peroxidase cysteine - CysP). The high reactivity of the CysP is achieved by the participation of two vicinal amino acids: a threonine and an arginine, which constitute the catalytic triad. After the decomposition of hydroperoxide, the CysP forms an intermolecular disulfide with a second cysteine residue (resolving cysteine - CysR), which is reduced by the thioredoxin (Trx). During the redox cycle, these enzymes undergo to changes in the structure, but the molecular mechanisms involved in this process were poorly understood. In this study we have obtained the crystallographic structure of the 2-Cys Prx enzyme Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae. By means of biochemical and molecular biology approaches, the importance of amino acids involved in reactivity and structural transitions were determined. Finally, efforts have been performed to the determination of the crystallographic structures of mutant proteins obtained in this study.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

Os receptores tireoidianos (TRs) são proteínas envolvidas em várias funções fisiológicas importantes para os organismos, pois são potentes reguladores do desenvolvimento, divisão e diferenciação celular, metabolismo e homeostase. Eles são responsáveis pela regulação da transcrição de genes-alvo específicos, mediando efeitos pleiotrópicos de hormônios lipofílicos nas células. Na ausência de ligantes essas proteínas estão complexadas a correpressores, impedindo a transcrição de genes por elas regulados. Por outro lado, a presença do ligante induz à transcrição através da ligação a elementos responsivos do DNA e coativadores. Nesse trabalho alguns aspectos do TR foram evidenciados, permintindo-se um melhor conhecimento acerca do funcionamento e estrutura desse receptor. Os experimentos de oligomerização revelaram a presença dos tetrâmeros do TR, os quais estavam restritos ao Receptor X Retinóico, sugerindo mecanismos novos na regulação do receptor. Os ensaios de raios-X a baixos ângulos resultaram nos primeiros modelos estruturais de baixa resolução de construções maiores do TR, demonstrando o correto posicionamento de seus domínios em sua estrutura geral, o que forneceu informações importantes sobre sua estrutura geral. Os experimentos de fluorescência avaliaram a ligação desses receptores a diversos elementos responsivos, em termos de constantes de dissociação e seletividade para cada um deles. E, por fim, os experimentos de troca de hidrogênio por deutério revelaram a movimentação que ocorre no domínio de ligação do ligante do receptor antes e após a adição do ligante T3. Esses resultados ampliam um pouco mais os conhecimentos sobre os mecanismos de ação e sobre a estrutura quaternária dos TR, promovendo um melhor entendimento dos conceitos básicos envolvidos na atuação dessas macromoléculas, as quais estão inseridas em redes complexas de regulação e interação com outras proteínas. / The thyroid receptors (TRs) are proteins, which are involved in diverse and important physiological functions in the organisms, since they are regulators of development, cell divison and differentiation, metabolism and homeostasis. They are responsible by the regulation of specific gene transcription, through pleiotropic effects of lipophilic hormones in the cells. In the absence of the ligand these proteins are complexed to correpressors and block the transcription of genes that are regulated by them On the other hand, in the presence of the ligand transcription is induced through the binding of the receptors to DNA response elements and coactivators. New findings about TR described in this study helped to improve the understanding of the function and structure of the receptor. This was accomplished by: oligomerization experiments which showed the presence of TR tetramers, a quarternary structure described before only for the Retinoid Receptor X, and suggested new regulation mechanisms for the receptors; the small angle X-ray scattering assays which resulted in the first low resolution structural models of bigger constructions of TR, showing the correct position of TR domains and providing important information about the global TR structure; the anisotropy fluorescence experiments which evaluated the binding of these receptors to diverse response elements, in terms of dissociation constants and selectivity for each one of the HREs tested; and finally, the hydrogen/deuterium experiments which revealed the ligand binding domain mobility before and after the ligand addition. In summary, we can say that these results all together extended the knowledge about the TR action mechanisms and its quarternary strucuture, providing better understanding of the basic concepts involved in these macromolecules behavior, which are inserted into a complex network of regulation and interaction with other proteins.

Os receptores tireoidianos (TRs) são proteínas envolvidas em várias funções fisiológicas importantes para os organismos, pois são potentes reguladores do desenvolvimento, divisão e diferenciação celular, metabolismo e homeostase. Eles são responsáveis pela regulação da transcrição de genes-alvo específicos, mediando efeitos pleiotrópicos de hormônios lipofílicos nas células. Na ausência de ligantes essas proteínas estão complexadas a correpressores, impedindo a transcrição de genes por elas regulados. Por outro lado, a presença do ligante induz à transcrição através da ligação a elementos responsivos do DNA e coativadores. Nesse trabalho alguns aspectos do TR foram evidenciados, permintindo-se um melhor conhecimento acerca do funcionamento e estrutura desse receptor. Os experimentos de oligomerização revelaram a presença dos tetrâmeros do TR, os quais estavam restritos ao Receptor X Retinóico, sugerindo mecanismos novos na regulação do receptor. Os ensaios de raios-X a baixos ângulos resultaram nos primeiros modelos estruturais de baixa resolução de construções maiores do TR, demonstrando o correto posicionamento de seus domínios em sua estrutura geral, o que forneceu informações importantes sobre sua estrutura geral. Os experimentos de fluorescência avaliaram a ligação desses receptores a diversos elementos responsivos, em termos de constantes de dissociação e seletividade para cada um deles. E, por fim, os experimentos de troca de hidrogênio por deutério revelaram a movimentação que ocorre no domínio de ligação do ligante do receptor antes e após a adição do ligante T3. Esses resultados ampliam um pouco mais os conhecimentos sobre os mecanismos de ação e sobre a estrutura quaternária dos TR, promovendo um melhor entendimento dos conceitos básicos envolvidos na atuação dessas macromoléculas, as quais estão inseridas em redes complexas de regulação e interação com outras proteínas. / The thyroid receptors (TRs) are proteins, which are involved in diverse and important physiological functions in the organisms, since they are regulators of development, cell divison and differentiation, metabolism and homeostasis. They are responsible by the regulation of specific gene transcription, through pleiotropic effects of lipophilic hormones in the cells. In the absence of the ligand these proteins are complexed to correpressors and block the transcription of genes that are regulated by them On the other hand, in the presence of the ligand transcription is induced through the binding of the receptors to DNA response elements and coactivators. New findings about TR described in this study helped to improve the understanding of the function and structure of the receptor. This was accomplished by: oligomerization experiments which showed the presence of TR tetramers, a quarternary structure described before only for the Retinoid Receptor X, and suggested new regulation mechanisms for the receptors; the small angle X-ray scattering assays which resulted in the first low resolution structural models of bigger constructions of TR, showing the correct position of TR domains and providing important information about the global TR structure; the anisotropy fluorescence experiments which evaluated the binding of these receptors to diverse response elements, in terms of dissociation constants and selectivity for each one of the HREs tested; and finally, the hydrogen/deuterium experiments which revealed the ligand binding domain mobility before and after the ligand addition. In summary, we can say that these results all together extended the knowledge about the TR action mechanisms and its quarternary strucuture, providing better understanding of the basic concepts involved in these macromolecules behavior, which are inserted into a complex network of regulation and interaction with other proteins.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

A eletroquímica direta de enzimas redox depende da distância entre os sítios redox da proteína e a superfície do eletrodo e também da eficiência na imobilização dessas enzimas na superfície eletródica. Dessa forma, a obtenção de enzimas mais hidrofóbicas possibilita a melhora na interação entre elas e a superfície de eletrodos sólidos, como os de carbono. Neste estudo, foi desenvolvida uma rota para a obtenção da glicose oxidase oligomerizada (Ol-GOx) com o objetivo de melhorar a interação entre a enzima e a superfície de fibras de carbono, uma vez que enzimas oligomerizadas contêm suas porções hidrofóbicas expostas.Para tanto, diferentes ácidos de Brønsted foram utilizados, sendo que a enzima obtida a partir da reação com o ácido trifluorometanosulfônico (TFMS) foi a que se manteve ativa cataliticamente. A Ol-GOx se mostrou um biocatalisador promissor devido a sua hidrofobicidade e seu tamanho, os quais permitiram uma imobilização mais eficiente em superfícies de carbono. Após a caracterização estrutural, concluiu-se que a Ol-GOx é formada por um oligômero composto por 10 unidades de GOx nativa com raio hidrodinâmico de aproximadamente 96 nm. Por voltametria cíclica estudou-se a transferência direta de elétrons (TDE) entre o cofator dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD) e a superfície das fibras de carbono, sendo observado um aumento de 7 vezes nas correntes faradaicas em relação ao obtido para a GOx nativa. Além disso, as propriedades bioeletrocatalíticas foram melhoradas em 30% quando analisada a oxidação da glicose. Concluiu-se ainda que quanto maior a quantidade de folhas-β presente na estrutura proteica, maior a TDE observada entre a enzima e a superfície das fibras de carbono. / The direct electrochemistry of redox enzymes is dependent on the distance between the active centers of the protein and the electrode surface, and also on the efficiency in the immobilization of these enzymes on the electrodic surface. Thus, the synthesis of more hydrophobic enzymes could lead to better interaction between the redox enzymes and the solid electrode surfaces, such as carbon electrodes. In this study, it was proposed a chemical route to obtain oligomerized glucose oxidase (Ol-GOx), aiming to improve the interaction between the enzyme and the surface of carbon fibers, since oligomerized proteins have their hydrophobic chains exposed. After structural characterization, it was concluded that Ol-GOx is formed by 10 dimeric units of native GOx with a hydrodynamic radius corresponding to approximately 96 nm. By cyclic voltammetry, it was studied the direct electron transfer (DET) between the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor and the surface of carbon fibers, where it was observed an increase of 7-fold in the faradaic currents in comparison to that observed for native GOx. Besides, bioelectrocatalytic properties are 30% improved, when analyzed the glucose oxidation by cyclic voltammetry. It was also concluded that the greater the β-sheet content in protein structure, the higher the DET observed between the enzyme and the carbon fibers surface.

Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) pertencem à superfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores transcricionais. Eles exercem um papel fundamental em processos que envolvem, principalmente, o metabolismo lipídico, em resposta à ativação por ligantes naturais e sintéticos como os ácidos graxos e os fibratos, respectivamente. A crescente descoberta de importantes funções fisiológicas, coordenadas pelos PPARs, e a necessidade de se conhecer como os agonistas, atualmente disponíveis, atuam nesses receptores, têm incitado pesquisas que vislumbram sua melhor exploração nos tratamentos de doenças metabólicas e inflamatórias, minimizando os efeitos adversos de ativações suprafisiológicas. Nesse cenário, o presente trabalho buscou compreender melhor as bases estruturais envolvidas nas funções atribuídas aos PPARs e explicar como as interações com seus ligantes ocorrem. Para isso, foram realizadas a subclonagem do domínio de ligação ao ligante do PPARα, sua expressão e purificação, seguidas de ensaios cristalográficos e biofísicos, além da abordagem de testes funcionais. Uma vez que a formação de oligômeros está relacionada à funcionalidade desses receptores, foram abordados estudos de oligomerização dos PPARs α e γ, compreendendo tanto o processo de homo- quanto o de heterodimerização. Os ensaios de cristalização do hPPARα LBD complexado a ligantes naturais e sintéticos, resultaram em estruturas cristalográficas que permitiram a identificação dos resíduos envolvidos no reconhecimento dos ligantes e a caracterização de sítios de ligação nunca antes descritos. A presença de ligantes nessas regiões afeta a conformação da proteína e, consequentemente, a modulação de sua função e o recrutamento da maquinaria transcricional. Adicionalmente, as estruturas cristalográficas da proteína complexada a ácidos graxos auxiliaram na compreensão de como essa importante classe de ligantes naturais possui efeitos farmacológicos similares aos de ligantes sintéticos. Esses resultados têm imediato impacto na procura racional de agonistas para esses receptores e se inserem em uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de endocrinologia molecular. / The peroxisome proliferation-activated receptors (PPARs) belong to the nuclear receptors superfamily, acting as transcriptional factors. They play a key role in processes involving essentially lipid metabolism in response to activation by natural and synthetic ligands such as fatty acids and fibrates, respectively. The rising discovery of important physiological functions coordinated by PPARs and the necessity to know how the currently available agonists act on these receptors, have encouraged researches envisioning a better receptor exploration in the treatment of metabolic and inflammatory diseases, minimizing the adverse effects of supraphysiological activations. In this scenario, the present study aimed to better understand the structural basis involved in PPARs functions and elucidates how the interactions with their ligands takes place. For this, the ligand-binding domain of PPARα was subjected to subcloning, expression and purification steps, followed by crystallographical and biophysical assays, in addition to functional testing approaches. Since the degree of oligomerization is related to the functionality of these receptors, oligomeric studies of PPARs α and γ oligomerization were also achieved, comprising both homo- and hetero-dimerization. The co-crystallization assays of hPPARα LBD complexed with natural and synthetic ligands resulted in crystallographic structures that allowed the identification of residues involved in ligand recognition and the characterization of novel binding sites. The presence of ligands in these regions affects the conformation of the protein and thereby modulates their function and transcriptional machinery recruitment. Additionally, the crystallographic structures of the protein complexed to fatty acids were valuable for the understanding of how this important class of natural ligands has similar pharmacological effects to those of synthetic ligands. These results have direct impact on rational agonists design to these receptors and are inserted in a perspective of scientifical promotion and technological development in the field of molecular endocrinology.

Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) pertencem à superfamília de receptores nucleares que funcionam como fatores transcricionais. Eles exercem um papel fundamental em processos que envolvem, principalmente, o metabolismo lipídico, em resposta à ativação por ligantes naturais e sintéticos como os ácidos graxos e os fibratos, respectivamente. A crescente descoberta de importantes funções fisiológicas, coordenadas pelos PPARs, e a necessidade de se conhecer como os agonistas, atualmente disponíveis, atuam nesses receptores, têm incitado pesquisas que vislumbram sua melhor exploração nos tratamentos de doenças metabólicas e inflamatórias, minimizando os efeitos adversos de ativações suprafisiológicas. Nesse cenário, o presente trabalho buscou compreender melhor as bases estruturais envolvidas nas funções atribuídas aos PPARs e explicar como as interações com seus ligantes ocorrem. Para isso, foram realizadas a subclonagem do domínio de ligação ao ligante do PPARα, sua expressão e purificação, seguidas de ensaios cristalográficos e biofísicos, além da abordagem de testes funcionais. Uma vez que a formação de oligômeros está relacionada à funcionalidade desses receptores, foram abordados estudos de oligomerização dos PPARs α e γ, compreendendo tanto o processo de homo- quanto o de heterodimerização. Os ensaios de cristalização do hPPARα LBD complexado a ligantes naturais e sintéticos, resultaram em estruturas cristalográficas que permitiram a identificação dos resíduos envolvidos no reconhecimento dos ligantes e a caracterização de sítios de ligação nunca antes descritos. A presença de ligantes nessas regiões afeta a conformação da proteína e, consequentemente, a modulação de sua função e o recrutamento da maquinaria transcricional. Adicionalmente, as estruturas cristalográficas da proteína complexada a ácidos graxos auxiliaram na compreensão de como essa importante classe de ligantes naturais possui efeitos farmacológicos similares aos de ligantes sintéticos. Esses resultados têm imediato impacto na procura racional de agonistas para esses receptores e se inserem em uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de endocrinologia molecular. / The peroxisome proliferation-activated receptors (PPARs) belong to the nuclear receptors superfamily, acting as transcriptional factors. They play a key role in processes involving essentially lipid metabolism in response to activation by natural and synthetic ligands such as fatty acids and fibrates, respectively. The rising discovery of important physiological functions coordinated by PPARs and the necessity to know how the currently available agonists act on these receptors, have encouraged researches envisioning a better receptor exploration in the treatment of metabolic and inflammatory diseases, minimizing the adverse effects of supraphysiological activations. In this scenario, the present study aimed to better understand the structural basis involved in PPARs functions and elucidates how the interactions with their ligands takes place. For this, the ligand-binding domain of PPARα was subjected to subcloning, expression and purification steps, followed by crystallographical and biophysical assays, in addition to functional testing approaches. Since the degree of oligomerization is related to the functionality of these receptors, oligomeric studies of PPARs α and γ oligomerization were also achieved, comprising both homo- and hetero-dimerization. The co-crystallization assays of hPPARα LBD complexed with natural and synthetic ligands resulted in crystallographic structures that allowed the identification of residues involved in ligand recognition and the characterization of novel binding sites. The presence of ligands in these regions affects the conformation of the protein and thereby modulates their function and transcriptional machinery recruitment. Additionally, the crystallographic structures of the protein complexed to fatty acids were valuable for the understanding of how this important class of natural ligands has similar pharmacological effects to those of synthetic ligands. These results have direct impact on rational agonists design to these receptors and are inserted in a perspective of scientifical promotion and technological development in the field of molecular endocrinology.

A eletroquímica direta de enzimas redox depende da distância entre os sítios redox da proteína e a superfície do eletrodo e também da eficiência na imobilização dessas enzimas na superfície eletródica. Dessa forma, a obtenção de enzimas mais hidrofóbicas possibilita a melhora na interação entre elas e a superfície de eletrodos sólidos, como os de carbono. Neste estudo, foi desenvolvida uma rota para a obtenção da glicose oxidase oligomerizada (Ol-GOx) com o objetivo de melhorar a interação entre a enzima e a superfície de fibras de carbono, uma vez que enzimas oligomerizadas contêm suas porções hidrofóbicas expostas.Para tanto, diferentes ácidos de Brønsted foram utilizados, sendo que a enzima obtida a partir da reação com o ácido trifluorometanosulfônico (TFMS) foi a que se manteve ativa cataliticamente. A Ol-GOx se mostrou um biocatalisador promissor devido a sua hidrofobicidade e seu tamanho, os quais permitiram uma imobilização mais eficiente em superfícies de carbono. Após a caracterização estrutural, concluiu-se que a Ol-GOx é formada por um oligômero composto por 10 unidades de GOx nativa com raio hidrodinâmico de aproximadamente 96 nm. Por voltametria cíclica estudou-se a transferência direta de elétrons (TDE) entre o cofator dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD) e a superfície das fibras de carbono, sendo observado um aumento de 7 vezes nas correntes faradaicas em relação ao obtido para a GOx nativa. Além disso, as propriedades bioeletrocatalíticas foram melhoradas em 30% quando analisada a oxidação da glicose. Concluiu-se ainda que quanto maior a quantidade de folhas-β presente na estrutura proteica, maior a TDE observada entre a enzima e a superfície das fibras de carbono. / The direct electrochemistry of redox enzymes is dependent on the distance between the active centers of the protein and the electrode surface, and also on the efficiency in the immobilization of these enzymes on the electrodic surface. Thus, the synthesis of more hydrophobic enzymes could lead to better interaction between the redox enzymes and the solid electrode surfaces, such as carbon electrodes. In this study, it was proposed a chemical route to obtain oligomerized glucose oxidase (Ol-GOx), aiming to improve the interaction between the enzyme and the surface of carbon fibers, since oligomerized proteins have their hydrophobic chains exposed. After structural characterization, it was concluded that Ol-GOx is formed by 10 dimeric units of native GOx with a hydrodynamic radius corresponding to approximately 96 nm. By cyclic voltammetry, it was studied the direct electron transfer (DET) between the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor and the surface of carbon fibers, where it was observed an increase of 7-fold in the faradaic currents in comparison to that observed for native GOx. Besides, bioelectrocatalytic properties are 30% improved, when analyzed the glucose oxidation by cyclic voltammetry. It was also concluded that the greater the β-sheet content in protein structure, the higher the DET observed between the enzyme and the carbon fibers surface.