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Intracellular recordings were made from neurones of the rat locus coeruleus (lc) contained within a brain slice maintained <i>in vitro</i>. When applied to the slice in known concentrations, K opioid receptor agonists produced a concentration-dependent, naloxone-reversible depression of the electrically evoked excitatory post-synaptic potential (epsp). This effect of K agonists was observed in the absence of changes in the membrane potential or input resistance of the post-synaptic cell. Similarly, the K agonists had no effect on the tetrodotoxin-resistant action potential waveform. Naloxone antagonised the response to U50488 with an apparent dissociation equilibrium constant (K<SUB>d)</SUB> of 28 nM, consistent with the response being mediated via K opioid receptors. In contrast, u opioid receptor agonists caused a membrane hyperpolarisation concomitant with a fall in neuronal input resistance, and depressed the tetrodotoxin-resistant action potential. These effects were concentration-dependent and antagonised by naloxone; the hyperpolarising action of [D-Ala<SUP>2</SUP> , NMePhe<SUP>4</SUP> , Gly-ol<SUP>5</SUP> ] enkephalin (DAGO) was antagonised by naloxone with a K<SUB>d</SUB> of 1.5 nM. These findings are in agreement with previous reports that u receptor activation increases a potassium conductance in lc neurones. The epsp was depressed, but not abolished, by the excitatory amino acid antagonists, 2-amino-5-phosphonovaleric acid (2APV) and kynurenic acid, suggesting that the epsp was at least partly mediated by an excitatory amino acid. U50488 did not depress the depolarisation produced by local application of L-glutamic acid. In addition to the epsp, a noradrenergic inhibitory post-synaptic potential (ipsp) could be evoked in lc neurones. U50488 depressed the ipsp, but this effect was not reversed by naloxone and therefore not mediated via opioid receptors. U50488 had no effect on the all or nothing depolarising potential which could be evoked in a proportion of lc neurones. The effect of U50488 on the epsp was reduced when experiments were performed in the presence of agents - either barium, quinine or 4-aminopyridine - which block potassium conductances. An <i>in vitro</i> autoradiographic study of <SUP>3</SUP> H bremazocine binding within the lc revealed that the majority of binding was displaced by a combination of unlabelled DAGO and [D-Ser<SUP>2</SUP> ] Leu enkephalin Threonine (DLSET) and so represented u sites. A significant proportion however, was displaceable by unlabelled U50488 and thus represented K binding sites. It is concluded that K opioid receptors are situated pre-synaptically within the lc and when activated depress excitatory synaptic transmission.

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Endomorphin (Endo) 1 and 2, two tetrapeptides isolated from the bovine and human brain, have been proposed to be the endogenous ligand for the μ- opiate receptor. A multi-disciplinary study was undertaken to address the issues of localization, release and biological action of Endo with respect to the rat dorsal horn. First, immunohistochemical studies showed that Endo-1- or Endo-2-like immunoreactivity (Endo-1- or Endo-2-LI) is selectively expressed in fiber-like elements occupying the superficial layers of the rat dorsal horn, which also exhibit a high level of μ-opiate receptor immunoreactivity. Second, release of immunoreactive Endo-2-like substances (irEndo) from the in vitro rat spinal cords upon electrical stimulation of dorsal root afferent fibers was detected by the immobilized antibody microprobe technique. The site of release corresponded to laminae I and II where the highest density of Endo-2-LI fibers was localized. Lastly, whole- cell patch clamp recordings from substantia gelatinosa (SG) neurons of rat lumbar spinal cord slices revealed two distinct actions of exogenous Endo-1 and Endo-2: (1) depression of excitatory and/or inhibitory postsynaptic potentials evoked by stimulation of dorsal root entry zone, and (2) hyperpolarization of SG neurons. These two effects were prevented by the selective μ-opiate receptor antagonist β-funaltrexamine. The localization of endomorphin-positive fibers in superficial layers of the dorsal horn and the release of irEndo upon stimulation of dorsal root afferents together with the observation that Endo inhibits the activity of SG neurons by interacting with μ-opiate receptors provide additional support of a role of Endo as the endogenous ligand for the μ-opiate receptor in the rat dorsal horn.

Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.

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Eine langdauernde Vorinkubation des GPI bzw. des MVD mit Morphin-haltiger Nährlösung (unter in vitro-Bedingungen wird anstelle von Morphin häufig Normorphin verwendet) führte zur Entwicklung von Toleranz und im Falle des GPI zu einer zusätzlichen Abhängigkeits-ähnlichen Reaktion. Die Toleranz manifestierte sich als verminderte Ansprechbarkeit gegenüber dem in Anwesenheit des Morphins akut applizierten Normorphin, während die Gewebeabhängigkeit sich als starke Naloxon-induzierte Kontraktion bemerkbar machte. Diese Kontraktion beruhte auf einer massiven Ausschüttung von Acetylcholin aus den postganglionär parasympathischen Nervenendigungen. Als Erklärung wurde hinzugezogen, dass Naloxon das Morphin von seinen Rezeptoren verdrängt und eine entzugsähnliche Reaktion auslöst. Da nicht nur eine in vitro-Vorinkubation mit Morphin in den beiden Präparaten zur Empfindlichkeitsabnahme gegenüber Morphin/Normorphin führte sondern auch die mehrtägige, subkutane Implantation eines Morphin-Pellets oder einer Opioid-Lösung enthaltenden osmotischen Minipumpe, haben wir über den letzteren Weg selektive Toleranz gegenüber μ- (Morphin, Fentanyl), δ- (DADLE) und κ-Agonisten (Ethylketocyclazocin, MR 2034, MRZ) hervorgerufen. Nach in vivo-Behandlung mit den genannten Substanzen wurde das GPI präpariert, in einer Nährlösung, die den jeweiligen Agonisten in der ungefähr 80-fachen Toleranz-induzierenden Kon-zentration enthielt, aufgehängt und mit Feldelektroden elektrisch stimuliert. Die Reizparameter wurden so gewählt (supramaximale Spannung, 0.5 ms Reizbreite, 0.1 Hz Frequenz), dass ausschließlich das neuronale Gewebe stimuliert wurde, nicht aber der Glattmuskel. In vorhergehenden Experimenten konnte die Rezeptorausstattung des GPI nicht eindeutig identifiziert werden. Mit der Erzeugung der selektiven Toleranz an µ-Rezeptoren wurde die akute Wirkung von sowohl μ- als auch δ-Rezeptor-Agonisten wesentlich vermindert. Demgegenüber, übten κ-Rezeptor-Agonisten ihre Wirkung in unveränderter Intensität aus. Die vollständige Kreuz-Toleranz zwischen Morphin und DADLE schloss das Vorhandensein eines δ-Rezeptors aus, während die fehlende Kreuz-Toleranz zwischen Normorphin/DADLE einerseits und Ethylketocyclazocin andererseits das Vorhandensein eines κ-Rezeptors belegte. Es bedarf einer Erklärung, weshalb die in vivo-Behandlung mit Fentanyl nur geringe Toleranz gegenüber Normorphin auslöste und vice versa (wenig Kreuz-Toleranz), obwohl sich eine hochgradige Toleranz gegenüber derselben Substanz entwickelte. Es wurde geschlussfolgert, dass es verschiedene Subtypen von μ-Rezeptoren gibt, eines mit Empfindlichkeit gegenüber Morphin/Normorphin und ein anderes gegenüber Fentanyl.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis…………………………………………………………………………… 2 Wissenschaftlicher Anteil der Promovendin an der Publikation……………………….. 3 Bibliographische Beschreibung……………………………………………………………. 4 I. Einleitung………………………………………………………………………………… 5 Grundlegende Erklärungen……………………………………………………………. 5 Multiple Opioidrezeptoren……………………………………………………………… 5 II. Wissenschaftlicher Hintergrund………………………………………………………..8 Eigene Publikationen…………………………………………………………………… 8 Fragestellungen der Dissertation………………………………………………………8 III. Zusammenfassung der Arbeit…………………………………………………………. 9 IV. Originalmitteilungen…………………………………………………………………... 3 V. Derzeitiger Stand der Opioidforschung……………………………………………31 Opioidrezeptortypen…………………………………………………………………… 31 Transduktionsmechanismen der Opioidrezeptoren; Toleranz und Abhängigkeit…………….. 32 Zentrale und periphere Opioidanalgesie…………………………………………….. 38 Schlussfolgerungen……………………………………………………………………. 39 VI. Literaturverzeichnis……………………………………………………………………. 40 Eigenständigkeitserklärung……………………………………………………………….. 44 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis…………………………………………… 45 Danksagung………………………………………………………………………………… 49