Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Contagious ecthyma (orf) is a cutaneous disease that affects sheep and goats, and may be occasionally transmitted to humans. The disease is caused by orf virus (ORFV). ORFV infection produces croustous and proliferative lesions, usually on the nostrils and labial commissures of lambs, and also in the udder, teat skin and coronary bands of adults animals. The pathogenesis of ORFV infection is poorly understood and a search for an adequate animal model is required, yet the disease has been already reproduced in sheep, goats and rabbits. This dissertation relates the clinical, virological and pathological aspects of ORFV infection in rabbits and mice experimental inoculated. Ten rabbits, ten mice and two lambs were inoculated intradermally after skin scarification with an hypodermic needle. A viral suspension of ORFV IA-82 strain (108.5TCID50/mL) was inoculated in the internal face of the ear, back skin and labial commissure of rabbits; internal face of the ear of mice. Lambs were inoculated in the labial commissures and in the internal face of hind limbs. All animals were monitored clinically, virologically, and pathologically for 21 days. All rabbits developed clinical signs in the inoculation sites, begining with mild hyperemia that evolved to macules, papules, vesicle, pustules and scabs. Lesions appeared at days 3 and 4 post-inoculation (pi) and lasted to 3 to 10 days. Viral shedding was detected from days 2 to 14pi. Histological examination of lesions revealed focal proliferative dermatitis with ballooning degeneration and eosinophilic intracytoplasmic inclusions in keratinocytes, histological hallmarks of contagious ecthyma in sheep. A similar, albeit much milder clinical course was observed in 5 out of 10 inoculated mice. All lambs presented characteristic contagious ecthyma clinical and histopathologycal lesions from days 3 to 18pi, and the virus was recovered from lesions between days 2 and 19pi. At day 28pi, seroneutralization test (SN) was unable to detect neutralizing antibodies in all inoculated animals. These findings show that ORFV replicates and produce local lesions in rabbits and mice. However, rabbits are more susceptible to infection and disease, and may be used as an animal model to study some aspects of ORFV pathogenesis. / O ectima contagioso (ou orf) é uma doença infecto-contagiosa de pele que afeta principalmente ovinos e caprinos, e que ocasionalmente pode acometer o homem. O seu agente etiológico é o vírus da orf (ORFV). O ORFV produz lesões proliferativas, geralmente na comissura labial e no plano naso-labial de cordeiros, e também na pele do úbere, nos tetos e no rodete coronário dos cascos de animais adultos. A patogenia da infecção pelo ORFV é pouco conhecida, embora a doença já tenha sido reproduzida em ovinos, caprinos e coelhos. Essa dissertação relata os achados clínicos, virológicos e histopatológicos da infecção experimental de coelhos e camundongos pelo ORFV. Para isso, coelhos, camundongos e cordeiros foram inoculados pela via intradérmica (ID), após escarificação da pele com agulha hipodérmica. A inoculação dos cordeiros serviu como controle positivo. Uma suspensão viral da cepa IA-82 do ORFV (108,5DICC50/mL) foi inoculada na face interna da orelha, na pele do dorso e na comissura labial dos coelhos; na face interna da orelha dos camundongos; e na comissura labial e face interna do membro pélvico dos cordeiros. Os animais foram monitorados por 21 dias nos aspectos clínicos, virológicos e patológicos. Todos os coelhos inoculados apresentaram lesões semelhantes nos locais de inoculação, iniciando com hiperemia, evoluindo para máculas, pápulas, vesículas, pústulas e crostas. Os sinais surgiram 3 a 4 dias pós inoculação (pi) e duraram por 3 a 10 dias. Excreção viral foi detectada entre os dias 2 e 14pi. A análise histológica das lesões revelou dermatite focal proliferativa, com degeneração balonosa e corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos eosinofílicos nos queratinócitos, semelhante às alterações histológicas observadas nos cordeiros. Lesões similares, mas de menor intensidade foram observadas em 5 de 10 camundongos. Os cordeiros, utilizados como controles positivos, apresentaram lesões clínicas e histopatológicas características de ectima contagioso entre os dias 3 e 18pi, sendo que o vírus foi recuperado das lesões entre os dias 2 e 19dpi. No dia 28pi, pelo teste de soroneutralização (SN), não foram detectados anticorpos neutralizantes no soro dos animais inoculados. Esses resultados demonstram que a inoculação de ORFV resulta em replicação viral e produção de lesões em coelhos e camundongos, porém a doença é reproduzida de forma mais consistente em coelhos. Portanto, sugere-se que coelhos possam ser utilizados como modelos para estudos in vivo com o ORFV.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The immunostimulatory properties of inactivated parapoxvirus ovis (iPPVO) have been investigated in different animal species and experimental settings. This study investigated the effects of administration of iPPVO on selected events of the innate response in mice. Neutrophil activation, phagocytic activity of macrophages, serum bactericidal activity, induction and antiviral activity of interferon type I (IFN - I) and expression of several classes of cytokines were assayed following intraperitoneal inoculation of Mus musculus with iPPVO (107 TCID50). Serum from iPPVO-treated animals showed IFN-I activity against murine encephalomyocarditis virus (EMCV) between 6 and 12 hours post infection (hpi), as shown by plaque reduction. A significant activation of neutrophils at 6hpi was observed by NBT reduction test in animals treated with the iPPVO. Peritoneal macrophages from mice treated with iPPVO demonstrated a significant increase (p<0.01) in phagocytic activity against Candida albicans both in vivo (between 12 and 96 hpi) and in vitro (24 and 72 hpi). iPPVO treated mice showed increased serum bactericidal activity against Escherichia coli (p<0.05) at two periods (24 and 72 hpi). A second study evaluated the expression of cytokines in response to inoculation of iPPVO. For this, spleens and serum samples were collected from mice treated with iPPVO at different intervals after inoculation and subjected to quantification of messenger RNA (mRNA) by real time PCR (qRT-PCR) and detection/quantification of serum cytokines by ELISA. Quantification of mRNA identified a significant and transient increase in the expression of various cytokines, with variable magnitude and kinetics. mRNA expression of proinflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α and IL-8) peaked at 24 hpi (5.4 times increase) and 48 hpi (3 and 10 times, respectively). A 15-fold increase in expression of INF-γ and 6-fold for IL-12 was observed at 48 and 24 hpi, respectively. An increase in the expression of self-regulatory cytokines (Th2) cells, especially IL-10 and IL-4 was detected at later periods (72 and 96 hpi) with peaks of 4.7 and 4.9 fold, respectively. The determination of the concentration of serum cytokines by ELISA showed an increase in IL-1β, TNF-α, IL- 12, IFN-γ and IL-10 with kinetics similar to that observed by qPCR, especially for IL-1 and INF-γ. In summary, these results demonstrate that inoculation with iPPVO stimulates transiently a number events associated with cellular and humoral innate immune responses. If taken together, these effects would likely contribute for the enhanced resistance to certain pathogens observed in animals treated with iPPVO. / As propriedades imunoestimulatórias do Parapoxvirus ovis inativado (iPPVO) têm sido verificadas em diferentes espécies animais e condições experimentais. No presente trabalho foram investigados os efeitos da administração do iPPVO sobre eventos da resposta inata de camundongos. Ativação de neutrófilos, atividade fagocítica de macrófagos, atividade bactericida do soro, indução e atividade antiviral do interferon tipo I (INF-I) e expressão de várias classes de citocinas foram investigados em diferentes intervalos após inoculação de Mus musculus pela via intraperitonial com iPPVO (dose 107 TCID50). O soro de animais tratados com iPPVO apresentou atividade de INF-I frente ao vírus da encefalomiocardite murina (EMCV) entre 6 e 12 horas pós inoculação (hpi), como demonstrado pela redução significativa de formação de placas virais. Uma significativa ativação dos neutrófilos circulantes foi observada pela técnica de redução do NBT em animais tratados com o iPPVO às 6 hpi. Macrófagos peritoneais de camundongos tratados com iPPVO demonstraram um aumento significativo (p<0,01) na atividade fagocítica frente a Candida albicans tanto in vivo (entre 12 e 96 hpi) quanto in vitro (24 e 72hpi). Camundongos tratados com iPPVO apresentaram aumento na atividade bactericida do soro frente à Escherichia coli (p<0,05) em dois períodos avaliados (24 e 72 hpi). Um segundo estudo avaliou a expressão de citocinas em resposta à inoculação do iPPVO. Para isso, amostras de baço e soro foram coletados de camundongos tratados com iPPVO em diferentes intervalos após a inoculação e submetidas a quantificação de RNA mensageiro (RNAm) por PCR em tempo real (qRT-PCR) e detecção/quantificação de citocinas no soro por ELISA. A quantificação de RNAm permitiu detectar um aumento significativo e transitório da expressão de várias citocinas, com magnitude e cinética variáveis. A expressão de RNAm das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α e IL-8) atingiu o pico às 24 hpi (aumento de 5,4 vezes), 48 hpi (3 e 10 vezes, respectivamente). Um aumento de 15 vezes na expressão gênica do INF-γ, e de 6 vezes para a IL-12 foi observado às 48 e 24 hpi, respectivamente. Um incremento na expressão das citocinas auto-regulatórias (Th2), principalmente IL-10 e IL-4, foi detectado em períodos mais tardios (72 e 96 hpi) com picos de 4,7 e 4,9 vezes, respectivamente. A determinação da concentração das citocinas séricas por ELISA revelou um aumento nos níveis de IL-1β, TNF- α, IL-12, INF-γ e IL-10, com uma cinética similar à observada pela técnica de qPCR, especialmente para IL-1β e INF-γ. Em resumo, esses resultados demonstram que o tratamento com iPPVO estimula de forma significativa e transitória uma série de eventos celulares e humorais ligados à resposta imune inata. Esses efeitos, se considerados em conjunto, provavelmente contribuem para o aumento da magnitude da resposta imunológica a certos patógenos observada em animais tratados com o iPPVO.

Fusionspeptid-, Redox-, Viruscore- und sonstige Proteine. Alle analysierten Single ORF (SO)-VVOV Rekombinanten vermittelten einen signifikanten Schutz vor einer tödlichen Belastung mit Aujeszky-Virus. Zwei der Rekombinanten (SO 93-, SO 94-VVOV) enthalten ORFs, die für ATI/Fusionspeptid-Proteine kodieren. In SO 19- und SO 70-VVOV sind dagegen für Redoxproteine kodierende ORFs integriert. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass SO 94- und SO 19-VVOV in zwei weiteren Modellsystemen immunstimulatorisch aktiv sind. Im Baculo-Virussystem exprimierte Proteine waren nur in Kombination mit Vaccinia Lister-Virus (VV) wirksam. Dabei zeigten jeweils Virus-Protein-Gemische mit dem geringsten Proteinanteil den stärksten immunstimulatorischen Effekt. Proben in denen VV durch bovines Herpes-Virus-1 ersetzt wurde, sind dagegen nicht wirksam. Dies lässt auf eine Beteiligung VV-spezifischer Faktoren schließen. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führte eine Frameshift-Mutation in ORF 94r von SO 94mut-VVOV nur zur Abschwächung und nicht zum vollständigen Verlust der immunstimulatorischen Wirkung. Beide in Schizosaccharomyces pombe exprimierten Proteine, sp-ORF19 und sp-ORF94r, induzierten keinen signifikanten Schutz im Aujeszky Maus Modell. Mit der Identifikation einzelner immunstimulatorisch aktiver PPVO-Komponenten ist es erstmals gelungen, den paramunisierenden Effekt von Parapox-Viren einzelnen viralen Genen zu zuordnen. Insbesondere stellen SO 94- und SO 19-VVOV viel versprechende Kandidaten für die prophylaktische bzw. therapeutische Anwendung in verschiedenen Indikationen als auch für weitere Untersuchungen des Wirkmechanismus dar.

Fusionspeptid-, Redox-, Viruscore- und sonstige Proteine. Alle analysierten Single ORF (SO)-VVOV Rekombinanten vermittelten einen signifikanten Schutz vor einer tödlichen Belastung mit Aujeszky-Virus. Zwei der Rekombinanten (SO 93-, SO 94-VVOV) enthalten ORFs, die für ATI/Fusionspeptid-Proteine kodieren. In SO 19- und SO 70-VVOV sind dagegen für Redoxproteine kodierende ORFs integriert. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass SO 94- und SO 19-VVOV in zwei weiteren Modellsystemen immunstimulatorisch aktiv sind. Im Baculo-Virussystem exprimierte Proteine waren nur in Kombination mit Vaccinia Lister-Virus (VV) wirksam. Dabei zeigten jeweils Virus-Protein-Gemische mit dem geringsten Proteinanteil den stärksten immunstimulatorischen Effekt. Proben in denen VV durch bovines Herpes-Virus-1 ersetzt wurde, sind dagegen nicht wirksam. Dies lässt auf eine Beteiligung VV-spezifischer Faktoren schließen. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führte eine Frameshift-Mutation in ORF 94r von SO 94mut-VVOV nur zur Abschwächung und nicht zum vollständigen Verlust der immunstimulatorischen Wirkung. Beide in Schizosaccharomyces pombe exprimierten Proteine, sp-ORF19 und sp-ORF94r, induzierten keinen signifikanten Schutz im Aujeszky Maus Modell. Mit der Identifikation einzelner immunstimulatorisch aktiver PPVO-Komponenten ist es erstmals gelungen, den paramunisierenden Effekt von Parapox-Viren einzelnen viralen Genen zu zuordnen. Insbesondere stellen SO 94- und SO 19-VVOV viel versprechende Kandidaten für die prophylaktische bzw. therapeutische Anwendung in verschiedenen Indikationen als auch für weitere Untersuchungen des Wirkmechanismus dar.