O ferro é um micronutiente essencial em plantas, como também para praticamente todos os demais organismos. Porém, as formas livres de ferro intracelular podem ser extremamente danosas. A proteína ferritina tem papel crucial neste contexto, com a função de acumular ferro de uma forma segura e biodisponível. Cada proteína pode acumular aproximadamente 4500 átomos de ferro em sua cavidade interna. Em plantas, existe um número variado de cópias gênicas para ferritina e estas cópias têm expressão modulada por fatores bióticos e abióticos. No genoma do arroz foram caracterizadas duas cópias para o gene da ferritina. Como existem poucos estudos funcionais para ferritina em arroz, este trabalho teve como objetivos: (a) silenciar as duas cópias da ferritina da subespécie japonica variedade Nipponbare; (b) caracterizar, por PCR, mutantes para ferritina por inserção do retroelemento TOS17; (c) caracterizar a expressão da ferritina da subespécie de arroz japonica, variedade Nipponbare, em plantas cultivadas em meio hidropônico sob excesso de ferro. Utilizando o sistema Gateway (Invitrogen) nós desenvolvemos uma construção que expressa um RNA em grampo projetado para silenciar ambas as cópias dos genes da ferritina de arroz. Baseando-se em um protocolo bem estabelecido de regeneração de plantas transgênicas de arroz, nós regeneramos plantas transgênicas silenciadas para os genes da ferritina. Foi obtido 75% de sucesso na geração das plantas silenciadas, o que está de acordo com a literatura. Os transformates primários (T0) não apresentaram anormalidades morfológicas evidentes. É possível que uma rota compensatória para armazenar ferro de forma segura seja ativada quando os níveis de ferritina são diminuídos. Além disso, as plantas produzidas neste trabalho são uma ferramenta potencial para estudar a relação ferro-planta. Baseando-se em análises in silico e por PCR, nós caracterizamos três linhagens mutantes contendo inserção do retroelemento TOS17 no gene OsFer2, entretanto, ainda não identificamos mutantes homozigotos. Em plantas de arroz crescidas em meio hidropônico, o aumento da concentração de ferro resultou em maiores níveis de expressão de ferritina, avaliados por RT-PCR semi-quantitativo, após 6 h e 12 h de exposição aos tratamentos de 50 e 500 ppm de FeSO4 do que na condição controle (5,6 ppm). / Iron is an essential micronutrient for plants, as for virtually all organisms. However, free intracelular iron forms can be extremely dangerous. The ferritin protein has a crucial role in this context, storing iron in a safe and bioavailable form. Each protein molecule can accumulate about 4500 iron atoms in its internal cavity. In plants, there is a variable number of ferritin gene copies and their expression is modulated by biotic and abiotic factors. There are two copies of the ferritin gene in the rice genome. As there are few functional studies for the ferritin genes in rice, this work had the objetives of: (a) to silence both copies of the ferritin genes in the japonica Nipponbare variety; (b) to identify and characterize TOS17 insertional mutants for the ferritin genes using in silico and PCR essays; (c) to characterize the expression of ferritin in the japonica Nipponbare variety under iron stress conditions. Using the Gateway system we generated a construct that expresses a hairpin RNA designed to silence both rice ferritin gene copies. Based on a well-established protocol to regenerate transgenic plants, we developed transgenic ferritin silenced lines. We obtained 75% success in generating rice silenced lines against ferritin. The primary transformants (T0) had no clear morphological abnormalities. It is possible that a compensatory pathway to store iron in a safe form can be induced when levels of ferritin are downregulated. Furthermore, the plants generated in this work are a potential tool to study iron-plant relations. Based on in silico and PCR essays we characterized three TOS17 insertional mutant lines for the OsFer2 gene, but until now we could not identify TOS17 homozygous mutants. In rice plants grown in hydroponic culture, increasing iron concentrations resulted in higher expression levels of ferritin, evaluated by semi-quantitative RT-PCR, after 6h and 12h exposure to 50 and 500 ppm of FeSO4, than in the control treatment (5,6 ppm).

O ferro é um micronutiente essencial em plantas, como também para praticamente todos os demais organismos. Porém, as formas livres de ferro intracelular podem ser extremamente danosas. A proteína ferritina tem papel crucial neste contexto, com a função de acumular ferro de uma forma segura e biodisponível. Cada proteína pode acumular aproximadamente 4500 átomos de ferro em sua cavidade interna. Em plantas, existe um número variado de cópias gênicas para ferritina e estas cópias têm expressão modulada por fatores bióticos e abióticos. No genoma do arroz foram caracterizadas duas cópias para o gene da ferritina. Como existem poucos estudos funcionais para ferritina em arroz, este trabalho teve como objetivos: (a) silenciar as duas cópias da ferritina da subespécie japonica variedade Nipponbare; (b) caracterizar, por PCR, mutantes para ferritina por inserção do retroelemento TOS17; (c) caracterizar a expressão da ferritina da subespécie de arroz japonica, variedade Nipponbare, em plantas cultivadas em meio hidropônico sob excesso de ferro. Utilizando o sistema Gateway (Invitrogen) nós desenvolvemos uma construção que expressa um RNA em grampo projetado para silenciar ambas as cópias dos genes da ferritina de arroz. Baseando-se em um protocolo bem estabelecido de regeneração de plantas transgênicas de arroz, nós regeneramos plantas transgênicas silenciadas para os genes da ferritina. Foi obtido 75% de sucesso na geração das plantas silenciadas, o que está de acordo com a literatura. Os transformates primários (T0) não apresentaram anormalidades morfológicas evidentes. É possível que uma rota compensatória para armazenar ferro de forma segura seja ativada quando os níveis de ferritina são diminuídos. Além disso, as plantas produzidas neste trabalho são uma ferramenta potencial para estudar a relação ferro-planta. Baseando-se em análises in silico e por PCR, nós caracterizamos três linhagens mutantes contendo inserção do retroelemento TOS17 no gene OsFer2, entretanto, ainda não identificamos mutantes homozigotos. Em plantas de arroz crescidas em meio hidropônico, o aumento da concentração de ferro resultou em maiores níveis de expressão de ferritina, avaliados por RT-PCR semi-quantitativo, após 6 h e 12 h de exposição aos tratamentos de 50 e 500 ppm de FeSO4 do que na condição controle (5,6 ppm). / Iron is an essential micronutrient for plants, as for virtually all organisms. However, free intracelular iron forms can be extremely dangerous. The ferritin protein has a crucial role in this context, storing iron in a safe and bioavailable form. Each protein molecule can accumulate about 4500 iron atoms in its internal cavity. In plants, there is a variable number of ferritin gene copies and their expression is modulated by biotic and abiotic factors. There are two copies of the ferritin gene in the rice genome. As there are few functional studies for the ferritin genes in rice, this work had the objetives of: (a) to silence both copies of the ferritin genes in the japonica Nipponbare variety; (b) to identify and characterize TOS17 insertional mutants for the ferritin genes using in silico and PCR essays; (c) to characterize the expression of ferritin in the japonica Nipponbare variety under iron stress conditions. Using the Gateway system we generated a construct that expresses a hairpin RNA designed to silence both rice ferritin gene copies. Based on a well-established protocol to regenerate transgenic plants, we developed transgenic ferritin silenced lines. We obtained 75% success in generating rice silenced lines against ferritin. The primary transformants (T0) had no clear morphological abnormalities. It is possible that a compensatory pathway to store iron in a safe form can be induced when levels of ferritin are downregulated. Furthermore, the plants generated in this work are a potential tool to study iron-plant relations. Based on in silico and PCR essays we characterized three TOS17 insertional mutant lines for the OsFer2 gene, but until now we could not identify TOS17 homozygous mutants. In rice plants grown in hydroponic culture, increasing iron concentrations resulted in higher expression levels of ferritin, evaluated by semi-quantitative RT-PCR, after 6h and 12h exposure to 50 and 500 ppm of FeSO4, than in the control treatment (5,6 ppm).

O ferro é um micronutiente essencial em plantas, como também para praticamente todos os demais organismos. Porém, as formas livres de ferro intracelular podem ser extremamente danosas. A proteína ferritina tem papel crucial neste contexto, com a função de acumular ferro de uma forma segura e biodisponível. Cada proteína pode acumular aproximadamente 4500 átomos de ferro em sua cavidade interna. Em plantas, existe um número variado de cópias gênicas para ferritina e estas cópias têm expressão modulada por fatores bióticos e abióticos. No genoma do arroz foram caracterizadas duas cópias para o gene da ferritina. Como existem poucos estudos funcionais para ferritina em arroz, este trabalho teve como objetivos: (a) silenciar as duas cópias da ferritina da subespécie japonica variedade Nipponbare; (b) caracterizar, por PCR, mutantes para ferritina por inserção do retroelemento TOS17; (c) caracterizar a expressão da ferritina da subespécie de arroz japonica, variedade Nipponbare, em plantas cultivadas em meio hidropônico sob excesso de ferro. Utilizando o sistema Gateway (Invitrogen) nós desenvolvemos uma construção que expressa um RNA em grampo projetado para silenciar ambas as cópias dos genes da ferritina de arroz. Baseando-se em um protocolo bem estabelecido de regeneração de plantas transgênicas de arroz, nós regeneramos plantas transgênicas silenciadas para os genes da ferritina. Foi obtido 75% de sucesso na geração das plantas silenciadas, o que está de acordo com a literatura. Os transformates primários (T0) não apresentaram anormalidades morfológicas evidentes. É possível que uma rota compensatória para armazenar ferro de forma segura seja ativada quando os níveis de ferritina são diminuídos. Além disso, as plantas produzidas neste trabalho são uma ferramenta potencial para estudar a relação ferro-planta. Baseando-se em análises in silico e por PCR, nós caracterizamos três linhagens mutantes contendo inserção do retroelemento TOS17 no gene OsFer2, entretanto, ainda não identificamos mutantes homozigotos. Em plantas de arroz crescidas em meio hidropônico, o aumento da concentração de ferro resultou em maiores níveis de expressão de ferritina, avaliados por RT-PCR semi-quantitativo, após 6 h e 12 h de exposição aos tratamentos de 50 e 500 ppm de FeSO4 do que na condição controle (5,6 ppm). / Iron is an essential micronutrient for plants, as for virtually all organisms. However, free intracelular iron forms can be extremely dangerous. The ferritin protein has a crucial role in this context, storing iron in a safe and bioavailable form. Each protein molecule can accumulate about 4500 iron atoms in its internal cavity. In plants, there is a variable number of ferritin gene copies and their expression is modulated by biotic and abiotic factors. There are two copies of the ferritin gene in the rice genome. As there are few functional studies for the ferritin genes in rice, this work had the objetives of: (a) to silence both copies of the ferritin genes in the japonica Nipponbare variety; (b) to identify and characterize TOS17 insertional mutants for the ferritin genes using in silico and PCR essays; (c) to characterize the expression of ferritin in the japonica Nipponbare variety under iron stress conditions. Using the Gateway system we generated a construct that expresses a hairpin RNA designed to silence both rice ferritin gene copies. Based on a well-established protocol to regenerate transgenic plants, we developed transgenic ferritin silenced lines. We obtained 75% success in generating rice silenced lines against ferritin. The primary transformants (T0) had no clear morphological abnormalities. It is possible that a compensatory pathway to store iron in a safe form can be induced when levels of ferritin are downregulated. Furthermore, the plants generated in this work are a potential tool to study iron-plant relations. Based on in silico and PCR essays we characterized three TOS17 insertional mutant lines for the OsFer2 gene, but until now we could not identify TOS17 homozygous mutants. In rice plants grown in hydroponic culture, increasing iron concentrations resulted in higher expression levels of ferritin, evaluated by semi-quantitative RT-PCR, after 6h and 12h exposure to 50 and 500 ppm of FeSO4, than in the control treatment (5,6 ppm).

O conhecimento da diversidade genética e da estrutura populacional das variedades mantidas em bancos de germoplasma é de fundamental importância para sua efetiva utilização em programas de melhoramento. O mapeamento por associação, também conhecido como mapeamento por desequilíbrio de ligação, é um dos principais métodos para relacionar genes e alelos às características de interesse, através da co-segregação de marcadores genéticos polimórficos com os genes envolvidos na variação das características em estudo. O Banco de Germoplasma de Arroz do Departamento de Genética da ESALQ contém 192 acessos japoneses que foram estudados com o objetivo de entender sua diversidade, estruturação genética e determinar a associação genômica de caracteres agronômicos relacionados a produção de grãos. A caracterização molecular foi conduzida através da tecnologia DArT-seq, que gerou dados de marcadores SNPs (single-nucleotide polymorphism) e silico DArTs. Em seguida, após a filtragem, 5.578 SNPs de alta qualidade foram utilizados para calcular as estimativas de diversidade no pacote hierfstat e a estrutura do painel de acessos através da análise discriminante de componentes principais (DAPC), que consiste em determinar existência de cluster em um grupo de genótipos em que não há informação a priori sobre existência de grupos. A diversidade genética nos acessos foi evidenciada pelo valor de heterozigosidade esperada (HS) (0,0279) e a estruturação foi evidenciada pela formação de três subgrupos. O mapeamento associativo foi realizado com o uso do pacote GAPIT, sendo considerados seis caracteres: número de dias para florescimento (NDF), estatura de planta (EP), comprimento da panícula (CP), peso de parcela (PP), massa de mil grãos (MMG) e CICLO, bem como 24.266 marcadores silico DArTs e 1.965 marcadores SNPs. Foram detectadas um total de 113 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores silico DArTs em todas as seis características analisadas e, um total de 21 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores SNPs para apenas quatro das seis características analisadas: EP, CICLO, MMG e PP. Considerando-se os 113 silico DArTs associados significativamente na análise, 90 foram localizados em regiões intergênicas e 23 foram localizados dentro de genes. Enquanto que, dos 21 SNPs significativos, 11 foram localizados em regiões intergênicas e 10 foram localizados dentro de genes. A informação gerada neste estudo foi útil para testar associações ao longo do genoma do arroz. O modelo linear misto (MLM) empregado no mapeamento associativo acredita-se ter conseguido controlar eficientemente os falsos positivos no mapeamento utilizando os marcadores SNPs. As informações geradas neste estudo servem de base para avaliações mais aprofundadas, utilizando o conjunto de marcadores significativos como ponto de partida para determinação dos genes mais importantes para a produtividade em arroz. / The knowledge of the genetic diversity and population structure of varieties maintained in germplasm banks is crucial for their effective use in breeding programs. Association mapping, also known as linkage disequilibrium mapping, is one of the main methods for relating genes and alleles to the characteristics of interest, through the co-segregation of polymorphic genetic markers with the genes involved in the variation of the characteristics under study. The Rice Germplasm Bank of the Department of Genetics of ESALQ contains 192 Japanese accessions that were studied with the purpose of understanding its diversity, genetic structuring and determining the genomic association of agronomic traits related to grain production. The molecular characterization was conducted by DArTseq technology, which generated data of SNPs (single-nucleotide polymorphism) markers and silico DArTs. Then, after filtering, 5,578 high-quality SNPs were used to calculate the diversity estimates in hierfstat package and the accession panel structure through discriminant analysis of principal components (DAPC), which consists of determining the cluster existence in a group of genotypes where there is no a priori information about the existence of groups. The genetic diversity in the accessions was evidenced by the expected heterozygosity value (HS) (0.0279) and the population structure was evidenced by the formation of three clusters. The association mapping was performed using the GAPIT package, considering six characters: number of days for flowering (NDF), plant height (EP), panicle length (CP), plot weight (PP), mass of thousand grains (MMG) and CYCLE, as well as 24.266 silico DArTs markers and 1.965 SNPs markers. We detected a total of 113 significant associations genotype-phenotype (P <0.001) when used silico DArTs markers in all six analyzed characteristics and a total of 21 significant associations genotype-phenotype (P<0.001) when used SNPs markers for only four of the six analyzed characteristics: EP, CYCLE, MMG and PP. Considering the 113 silico DArTs significantly associated in the analysis, 90 were located in intergenic regions and 23 were localized within genes. While of the 21 significant SNPs, 11 were located in intergenic regions and 10 were located within genes. The information generated in this study was useful for testing associations throughout the rice genome. The mixed linear model (MLM) used in association mapping is believed to have been able to efficiently control false positives in the mapping using the SNPs markers. The information generated in this study serves as a basis for further evaluation using the set of significant markers as a starting point for determining the most important genes for rice yield.

O conhecimento da diversidade genética e da estrutura populacional das variedades mantidas em bancos de germoplasma é de fundamental importância para sua efetiva utilização em programas de melhoramento. O mapeamento por associação, também conhecido como mapeamento por desequilíbrio de ligação, é um dos principais métodos para relacionar genes e alelos às características de interesse, através da co-segregação de marcadores genéticos polimórficos com os genes envolvidos na variação das características em estudo. O Banco de Germoplasma de Arroz do Departamento de Genética da ESALQ contém 192 acessos japoneses que foram estudados com o objetivo de entender sua diversidade, estruturação genética e determinar a associação genômica de caracteres agronômicos relacionados a produção de grãos. A caracterização molecular foi conduzida através da tecnologia DArT-seq, que gerou dados de marcadores SNPs (single-nucleotide polymorphism) e silico DArTs. Em seguida, após a filtragem, 5.578 SNPs de alta qualidade foram utilizados para calcular as estimativas de diversidade no pacote hierfstat e a estrutura do painel de acessos através da análise discriminante de componentes principais (DAPC), que consiste em determinar existência de cluster em um grupo de genótipos em que não há informação a priori sobre existência de grupos. A diversidade genética nos acessos foi evidenciada pelo valor de heterozigosidade esperada (HS) (0,0279) e a estruturação foi evidenciada pela formação de três subgrupos. O mapeamento associativo foi realizado com o uso do pacote GAPIT, sendo considerados seis caracteres: número de dias para florescimento (NDF), estatura de planta (EP), comprimento da panícula (CP), peso de parcela (PP), massa de mil grãos (MMG) e CICLO, bem como 24.266 marcadores silico DArTs e 1.965 marcadores SNPs. Foram detectadas um total de 113 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores silico DArTs em todas as seis características analisadas e, um total de 21 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores SNPs para apenas quatro das seis características analisadas: EP, CICLO, MMG e PP. Considerando-se os 113 silico DArTs associados significativamente na análise, 90 foram localizados em regiões intergênicas e 23 foram localizados dentro de genes. Enquanto que, dos 21 SNPs significativos, 11 foram localizados em regiões intergênicas e 10 foram localizados dentro de genes. A informação gerada neste estudo foi útil para testar associações ao longo do genoma do arroz. O modelo linear misto (MLM) empregado no mapeamento associativo acredita-se ter conseguido controlar eficientemente os falsos positivos no mapeamento utilizando os marcadores SNPs. As informações geradas neste estudo servem de base para avaliações mais aprofundadas, utilizando o conjunto de marcadores significativos como ponto de partida para determinação dos genes mais importantes para a produtividade em arroz. / The knowledge of the genetic diversity and population structure of varieties maintained in germplasm banks is crucial for their effective use in breeding programs. Association mapping, also known as linkage disequilibrium mapping, is one of the main methods for relating genes and alleles to the characteristics of interest, through the co-segregation of polymorphic genetic markers with the genes involved in the variation of the characteristics under study. The Rice Germplasm Bank of the Department of Genetics of ESALQ contains 192 Japanese accessions that were studied with the purpose of understanding its diversity, genetic structuring and determining the genomic association of agronomic traits related to grain production. The molecular characterization was conducted by DArTseq technology, which generated data of SNPs (single-nucleotide polymorphism) markers and silico DArTs. Then, after filtering, 5,578 high-quality SNPs were used to calculate the diversity estimates in hierfstat package and the accession panel structure through discriminant analysis of principal components (DAPC), which consists of determining the cluster existence in a group of genotypes where there is no a priori information about the existence of groups. The genetic diversity in the accessions was evidenced by the expected heterozygosity value (HS) (0.0279) and the population structure was evidenced by the formation of three clusters. The association mapping was performed using the GAPIT package, considering six characters: number of days for flowering (NDF), plant height (EP), panicle length (CP), plot weight (PP), mass of thousand grains (MMG) and CYCLE, as well as 24.266 silico DArTs markers and 1.965 SNPs markers. We detected a total of 113 significant associations genotype-phenotype (P <0.001) when used silico DArTs markers in all six analyzed characteristics and a total of 21 significant associations genotype-phenotype (P<0.001) when used SNPs markers for only four of the six analyzed characteristics: EP, CYCLE, MMG and PP. Considering the 113 silico DArTs significantly associated in the analysis, 90 were located in intergenic regions and 23 were localized within genes. While of the 21 significant SNPs, 11 were located in intergenic regions and 10 were located within genes. The information generated in this study was useful for testing associations throughout the rice genome. The mixed linear model (MLM) used in association mapping is believed to have been able to efficiently control false positives in the mapping using the SNPs markers. The information generated in this study serves as a basis for further evaluation using the set of significant markers as a starting point for determining the most important genes for rice yield.