Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'importance de l'os sous-chondral dans la pathogenèse et la prise en charge de l'arthrose intéresse les cliniciens et la communauté scientifique. En effet, il existe des liens forts entre l'os sous-chondral et le cartilage, maintenant l'intégrité de ce dernier reposant sur l'os sous-chondral pour fournir un support mécanique et un soutien nutritionnel. Ici, nous avons étudié la relation entre les structures osseuses et cartilagineuses et l'approvisionnement vasculaire dans l'arthrose de la humaine.Nous avons recueilli 37 plateaux tibiaux arthrosiques prélevés après arthroplastie totale du genou. Dans ces mêmes plateaux, plusieurs carottes ont été prélevées et scannés par microtomographie. Les projections résultantes ont été reconstruites, puis segmentées manuellement pour séparer l'os sous-chondral de l'os trabéculaire et une analyse microarchitecturale a été développée sous les deux structures osseuses. Les échantillons ont été décalcifiés, coupés en sections de 16 heures, colorés dans de l'HES et classés en 6 groupes selon l'échelle OARSI. La surface de l'os sous-chondral et l'épaisseur et la surface du cartilage articulaire ont été cultivées. Le nombre de vaisseaux dans le sous-chondral a été compté par deux opérateurs différents et une coloration immunofluorescente avec du VEGF a été effectuée. Enfin, le cartilage, l'os sous-chondral et trabéculaire ont été utilisés pour mesurer les marqueurs ribonucléiques et protéiques liés à la vascularisation, l'innervation et l'inflammation.La microstructure de l'os a évolué au fur et à mesure que l'arthrose s'aggrave. L'os sous-chondral s'est épaissi et est devenu plus poreux. La fraction volumique osseuse, l'épaisseur trabéculaire, l'espacement et le nombre de trabécules ont été corrélés positivement avec le score OARSI. Une diminution significative du nombre de vaisseaux sanguins a été observée au dernier stade de l'arthrose. Enfin, les marqueurs ribonucléiques et protéiques liés à la vascularisation, à l'innervation et à l'inflammation ont été modulés au cours du développement de la pathologie. Pris ensemble, nos données montrent une interaction et des structures de soutien dynamiques entre l'os sous-chondral et le cartilage. La compréhension des voies de signalisation, l'unité biochimique du cartilage dans les articulations et la communication intercellulaire entre le cartilage et l'os sous-chondral peuvent mener à l'élaboration de stratégies plus efficaces pour traiter les patients souffrant d'arthrose. / The importance of subchondral bone in the pathogenesis and management of osteoarthritis retain the interest of clinicians and the scientific community. Indeed, there are strong links between the subchondral bone and the cartilage, maintaining the integrity of the latter resting on the subchondral bone to provide mechanical and nutritional support. Here, we investigated the relationship between bone and cartilage structures and vascular supply in human osteoarthritis.We collected 37 osteoarthritic tibial plates taken after total knee arthroplasty. In these same plates, several carrots were removed and scanned by microtomography. The resulting projections were reconstructed, then manually segmented to separate the subchondral bone from the trabecular bone and a microarchitectural analysis was done on both bone structures. The samples were decalcified, cut into 4 μm sections, stained in HES and classified into 6 groups according to the OARSI scale. The surface of the subchondral bone and the thickness and surface of the articular cartilage were measured. The number of vessels in the subchondral region was counted by two different operators and a VEGF immunofluorescent staining was performed. Finally, cartilage, subchondral and trabecular bone were used to measure ribonucleic and protein markers related to vascularization, innervation and inflammation.The microconstructure of the bone has evolved as osteoarthritis worsens. The subchondral bone has thickened and become more porous. Bone volume fraction, trabecular thickness, spacing and number of trabeculae were positively correlated with the OARSI score. A significant decrease in the number of blood vessels was observed in the last stage of osteoarthritis. Finally, ribonucleic and protein markers related to vascularization, innervation and inflammation were modulated during the development of the pathology. Taken together, our data show dynamic interaction and support structures between subchondral bone and cartilage. Understanding of signaling pathways, the biochemical unity of cartilage in the joints and intercellular communication between cartilage and subchondral bone can lead to the development of more effective strategies for treating patients with osteoarthritis.

L’arthrose, maladie articulaire la plus fréquente, se décline en plusieurs phénotypes selon les facteurs de risque : vieillissement, traumatisme et obésité. Dans l’arthrose liée à l’obésité il existe une origine mécanique mais aussi systémique faisant intervenir les adipokines. De plus, chez les sujets obèses, la présence d’un syndrome métabolique, et singulièrement un diabète de type 2 augmente fortement le risque d’arthrose. L’objectif de ce travail a été d’étudier les rôles d’une adipokine, la visfatine/Nampt (nicotinamide phosphoribosyltransférase), et de l’hyperglucidie dans l’arthrose. Ainsi, la visfatine est produite et libérée sous forme dimérique par l’ensemble des tissus articulaires, et son activité enzymatique Nampt est présente dans le tissu synovial. Elle induit un profil pro-inflammatoire des chondrocytes et des ostéoblastes murins caractérisé par la production de cytokines (IL-6, IL -8, MCP-1) qui implique en partie l’activité Nampt, démontré par utilisation de l’inhibiteur pharmacologique APO866. Sur chondrocytes murins, l’hyperglucidie potentialise l’effet de l’IL-1β sur l’activation pro-inflammatoire (IL-6, PGE2), sans stress osmotique. Cette potentialisation pro-inflammatoire passe par l’activation de la voie alternative des polyols, ainsi que par un stress oxydant, démontré par utilisation de l’inhibiteur de l’aldose réductase (epalrestat) et de deux antioxydants (Mitotempo et L-NAME). Chez l’Homme, le cartilage issu de patients arthrosiques diabétiques est plus sensible à l’IL-1β (libération d’IL-6 et de PGE2) et exprime plus l’AGE carboxyméthyllysine, que celui issu de patients non diabétiques de même âge et poids. / Osteoarthritis,the most frequent joint disease, can be declined in different phenotypes, depending on its risk factors: aging, trauma and obesity. In obesity-linked osteoarthritis, there is a mechanical stress but also a systemic stress involving adipokines. Moreover, in obese patients, a metabolic syndrome, and particularly a type 2 diabetes, increases the risk of developing osteoarthritis. The aims of the thesis were to study the roles of the adipokine visfatin/Nampt (nicotinamide phosphoribosyltransferase) et high glucose in osteoarthritis. Then, we demonstrate that visfatin is produced and released in an enzymatic dimeric form by all the articular tissues and that its enzymatic activity Nampt is present in synovium. Visfatin/Nampt induces a pro-inflammatory phenotype of murine chondrocytes and osteoblasts characterized by the production of cytokines (IL-6, IL-8, MCP-1), involving in part the enzymatic activity Nampt, demonstrated by using the pharmacological inhibitor APO866. On murine chondrocytes, high glucose potentiates the effect of IL-1β on pro-inflammatory activation (IL-6, PGE2), without inducing an osmotic stress. This potentiation involves the alternative polyol pathway and oxidative stress, demonstrated by using an inhibitor of aldose reductase (epalrestat) and two antioxidants (Mitotempo and L-NAME). In human, the cartilage from osteoarthritic diabetic patients is more sensitive to IL-1β (release of IL-6 and PGE2) and expresses more the AGE carboxymethyllysine than the one from non diabetic patients, of same age and weight.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’arthrose est la pathologie articulaire la plus fréquente, caractérisée par une destruction progressive du cartilage articulaire et impliquant une communication anormale entre l'os sous-chondral et le cartilage. Notre équipe a identifié la protéine 14-3-3ε comme un médiateur soluble secrété par l’os et capable d’altérer l'homéostasie du cartilage en stimulant l’expression de MMP-3 et MMP-13, deux métalloprotéases impliquées dans la dégradation du cartilage au cours de l’arthrose. CD13/APN, récepteur potentiel pour cette protéine, a été mis en évidence à la surface des chondrocytes murins et humains. Le but de cette étude était d’étudier son implication dans la réponse des chondrocytes à 14-3-3ε. L’invalidation de CD13/APN par des siRNA ou des anticorps bloquants, réduit significativement l’effet catabolique chondrocytaire induit par 14-3-3ε. Les chondrocytes articulaires possèdent une activité APN mais elle n’est pas modifiée en présence de 14-3-3ε. Nous avons mis en évidence la présence d’une interaction directe entre 14-3-3ε et CD13/APN grâce à la technologie SPR (Surface Plasmon Resonance) et le système Biacore. En utilisant 14-3-3ε marquée à la biotine, nous avons montré que 14-3-3ε est capable de se lier à la surface des chondrocytes via CD13/APN. Nous avons donc eu recours ensuite aux études de modélisation in silico qui ont permis d’identifier le résidu Y582 phosphorylé appartenant à la séquence E579FNYVW584 de CD13/APN, comme résidu indispensable pour sa liaison à 14-3-3ε. Ce travail de thèse permet de mieux comprendre le mécanisme d’action de 14-3-3ε et propose l’interaction entre 14-3-3ε et CD13 comme une nouvelle cible thérapeutique dans l’arthrose. / Osteoarthritis (OA) is a whole-joint disease characterized by progressive destruction of articular cartilage involving abnormal communication between subchondral bone and cartilage. Our team identified 14-3-3ε protein as a subchondral bone soluble mediator altering cartilage homeostasis. This protein acts as a potent stimulatory factor of MMP-3 and MMP-13 involved in the degradation of cartilage matrix in OA. CD13/APN, potential receptor of this protein, was identified on the surface of chondrocytes. The aim of this study was to investigate its involvement in chondrocytes response to 14-3-3ε. CD13/APN invalidation, using the siRNA strategy and blocking antibodies, reduces significantly the catabolic effect induced by 14-3-3ε in chondrocytes. APN activity was identified in chondrocytes but found unchanged following stimulation with 14-3-3ε. Then, we have revealed the presence of a direct interaction between 14-3-3ε and CD13/APN through the SPR (Surface Plasmon Resonance) and the Biacore system. Using biotin-labeled 14-3-3ε, we have shown that 14-3-3ε is able to bind to the surface of chondrocytes in a manner that is dependent on CD13/APN. It was then necessary to identify the putative motifs involved in this interaction. We therefore used in silico modelling studies which have identified the phosphorylated residue Y582, belonging to the E579FNYVW584 sequence of CD13/APN, as a critical residue for its binding to 14-3-3ε. This thesis work suggest that CD13 plays its receptor role to bind 14-3-3ε and transmit its signal in chondrocytes to induce a catabolic phenotype similar to that observed in OA. Thus, 14-3-3ε-CD13 interaction could be a novel therapeutic target in OA.

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation / Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation

L’ostéoarthrose (OA) se caractérise par une perte du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, et une inflammation de la membrane synoviale. Des études in vivo et in vitro indiquent que les modifications du tissu osseux sont responsables de la perte du cartilage articulaire. Les ostéoblastes (Ob) OA présentent une réduction de la réponse à l’hormone parathyroïdienne (PTH), un signal anabolique important pour le tissu osseux, versus les Ob normaux. Le récepteur à la PTH (PTH-R) interagit avec le LRP6, le récepteur des ligands Wnts, et les antagonistes Dickkopf (DKK) bloquent cette interaction. Puisque le niveau de DKK2 est élevé en réponse au TGF-β1 dans les OA Ob, nous proposons que DKK2 altère l’interaction LRP6/PTH-R, le recyclage de PTH-R, et inhibe la réponse à la PTH. Nous avons utilisé des Ob OA et normaux humains en culture primaire. L’expression de PTH-R, LPR6 et DKK2 est mesurée par RT-PCR. Les niveaux protéiques de LRP6, PTH-R et DKK2 ont été déterminés par immunobuvardage. L’inhibition de DKK2 s’est effectuée par siRNA et l’AMP cyclique (AMPc) a été mesurée par ELISA. L’effet de TGF-β1 sur l’expression de DKK2 et PTH-R a été testé sur des cellules d’ostéosarcome SaOS-2. L’expression de PTH-R et LRP6 est similaire entre Ob normaux et OA, mais le niveau protéique de PTH-R est réduit dans les Ob OA. Par contre, l’expression et la production de DKK2 sont plus élevées dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 ne modifia pas l’expression de LRP6 et PTH-R dans les Ob OA mais a augmenté le niveau protéique de PTH-R détecté par immunobuvardage alors que celui de LRP-6 demeura inchangé. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA entraîna une augmentation de PTH-R dans la fraction membranaire et une diminution de la fraction intracellulaire. Les résultats de l'inhibition de la voie de clathrine par le triflupromazine ont montré une expression accrue du récepteur PTH dans la fraction membranaire qui peut être due à l'inhibition de sa dégradation par la voie de clathrine. L’induction de DKK2 dans les cellules SaOS-2 par TGF-β1 entraîna l’inhibition de PTH-R mais non celle de LRP6. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA a stimulé la production d’AMPc en réponse à la PTH par les Ob OA. En outre, le traitement de TGF-β1 dans les cellules SaOS-2 réduit la production d'AMPc en réponse à la PTH.Ces résultats démontrent que les niveaux élevés de DKK2, via l’inhibition de la signalisation Wnt/bcaténine, sont aussi responsables de l’altération de la réponse à la PTH observée dans les Ob OA. Le niveau élevé de DKK2 diminue spécifiquement l’affichage membranaire de PTH-R dans ces cellules et non son expression. Ces résultats suggèrent donc une altération du cross-talk entre LRP6 et PTH-R dans les Ob OA en lien avec leur niveau de DKK2. / Osteoarthritis (OA) is characterized by loss of articular cartilage, bone sclerosis and synovial membrane inflammation. In vivo and in vitro studies indicate that the changes in bone tissue are responsible for the loss of articular cartilage. OA Osteoblasts (Ob) show a reduced response to parathyroid hormone (PTH), an important anabolic signal for bone tissue, versus normal Ob. The PTH receptor (PTH-R) interacts with LRP6, a receptor of Wnt ligands, and DKK antagonists block this interaction. Since DKK2 production is high in OA Ob whereas DKK2 is increased in normal Ob in response to TGF-β1, we propose that DKK2 alters the LRP6/PTH-R interaction, PTH-R recycling and inhibits the response to PTH. We used human OA and normal osteoblasts in primary culture. PTH-R, DKK2 and LRP6 expression were measured by RT-PCR. LRP6, PTH-R and DKK2 protein levels were determined by immunoblotting. Inhibition of DKK2 levels in OA Ob was performed by DKK2-siRNA, and cAMP production was measured by ELISA. The effect of TGF-β1 on DKK2, PTH-R and cAMP production was tested in osteosarcoma cells SaOS-2. In OA Ob, PTH-R and LRP6 mRNA levels were not changed following DKK2 siRNA treatment. However, PTH-R protein expression increased while that for LRP-6 remained unchanged after treatment with DKK2-siRNA. Compared to control, the distribution of PTH-R was higher in the membrane fraction and lower in the intracellular fraction in OA Ob following DKK2 inhibition. In contrast, LRP6 levels remained almost unchanged following these treatments. The results of the inhibition of the clathrin pathway by triflupromazin showed an increased expression of the PTH receptor in the membrane fraction that may be due to inhibition of their degradation by clathrin pathway. In OA Ob, DKK2 inhibition stimulated cAMP production in response to PTH. DKK2 induction by TGF-β1 in SaOS-2 cells, as assessed by qRT-PCR, caused the inhibition of PTH-R protein expression but not of LRP6. In addition, TGF-β1 treatment in SaOS-2 cells reduced cAMP production in response to PTH. These results demonstrate that high levels of DKK2 in OA Ob are responsible for the altered response to PTH. DKK2 antagonists decrease specifically PTH-R membrane display while they do not affect LRP6 recycling. These results suggest an altered cross-talk between LRP6 and PTH-R in OA Ob due to high levels of DKK2 in these cells.

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation / Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Caractérisée surtout par une dégradation du cartilage, l'arthrose est une maladie articulaire qui montre également une sclérose de l'os sous-chondral et une formation d'ostéophytes. Au stade clinique, cette pathologie progressive atteint environ 60% des personnes âgées de 65 ans et plus. La dégradation du cartilage qui accompagne cette maladie est la manifestation clinique la plus importante et la plus étudiée au niveau moléculaire. Par contre, la sclérose de l'os sous-chondral était toujours considérée comme secondaire ou comme un phénomène de compensation suite à l'érosion du cartilage. Cependant, la recherche fondamentale intensive sur le cartilage n'a toujours pas réussi à identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de la dégradation du cartilage. Ainsi, le traitement qui existe présentement se limite à calmer la douleur des patients. Par ailleurs, les études visant à comprendre le rôle de l'os sous-chondral, qui fait partie des tissus touchés par cette maladie, ont été toujours marginales. Notre hypothèse générale est qu'un défaut dans le métabolisme de l'os sous-chondral pourrait contribuer au déclenchement et/ou à la progression de l'arthrose. Ce défaut expliquerait la sclérose osseuse de l'os sous-chondral observée chez ces patients, situation qui serait alors responsable de la détérioration du cartilage via soit; i) un (des) messager(s) chimique(s), ii) l'imposition d'une contrainte mécanique sur le cartilage, ou iii) les deux précédents. De manière à démontrer notre hypothèse générale, nous avons utilisé des extraits d'expiants ex vivo et nous avons mis au point une technique pour cultiver les ostéoblastes provenant du plateau tibial medial de patients arthrosiques ou d'individus normaux. Au tout début de nos travaux nous avons démontré que, grâce à la mesure de marqueurs spécifiques, les ostéoblastes provenants de patients arthrosiques auraient un phénotype altéré lorsque comparé aux normaux. Ainsi, au niveau des expiants d'os sous-chondral, nos données montrent que l'activité de la phosphatase alcaline était augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques avant et après une stimulation avec la 1,25 (OH)2 D3 (métabolite actif de la vitamine Ds). La même observation a été notée pour l'ostéocalcine suite à une stimulation à la 1,25 (OH)2 D3 chez les ostéoblastes arthrosiques. Par ailleurs, les ostéoblastes arthrosiques ont montré une résistance à la stimulation par la PTH et la prostaglandine E2 (PGE2), leur taux de synthèse de l'AMPc (Adénosine 3', 5' monophosphate cyclique) étant 50% et 100% inhibé versus les ostéoblastes normaux. Une altération dans la voie de signalisation de la PTH pourrait être la cause de cette inhibition de synthèse d'AMPc chez les ostéoblastes arthrosiques. Toutefois, une stimulation directe de l'adénylate cyclase avec de la foskoline, produit qui court-circuite le récepteur à la PTH et la protéine Gs, a ramené le niveau de l'AMPc à la normale, démontrant que l'activité de l'adénylate cyclase est intacte dans les ostéoblastes arthrosiques. Un traitement à la toxine de choléra qui ribosyle la protéine Gs n'a toutefois pas réussi à augmenter le niveau de l'AMPc après stimulation avec la PTH, ce qui signifie que l'activité de la protéine Gs est partiellement et/ou totalement inhibée. Au contraire, la stimulation de la protéine Gi (la protéine G inhibitrice) par la toxine de Pertussis a complètement inhibé la formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH indiquant que la protéine Gi est intacte. Par la suite, la protéine Gs fût l'objet d'une quantification par western blot qui n'a révélé aucun changement au niveau de la quantité de cette protéine versus les ostéoblastes normaux. La quantification du récepteur de la PTH à l'aide d'une étude de liaison avec du I-PTH a montré une diminution de 50% du niveau de récepteurs à la PTH. Cette diminution pourrait être causée par une désensibilisation hétérologue par la PGE2. En effet, les ostéoblastes arthrosiques synthétisent plus de PGE2 que les ostéoblastes normaux et l'inhibition de la synthèse de la prostaglandine par le Naproxen a ramené à la normale le niveau de formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH. Par ailleurs, le niveau d'ARNm du récepteur à la PTH évalué par RT-PCR semi-quantitatif était diminué. Le ratio avec le glycéraldehyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) dans les ostéoblastes arthrosiques était de 25 à 65 % plus faible que pour les ostéoblastes normaux, le niveau d'inhibition variant en parallèle avec la sévérité de la maladie. Ceci indique que l'expression du récepteur à la PTH était diminuée dans les cellules arthrosiques. Nos résultats ont également montré que l'activité du système PA/Plasmine, le premier système à initier la résorption osseuse, est inhibé dans l'os sous-chondral arthrosique ce qui pourrait entraîner une diminution de la résorption osseuse. Le niveau protéique et l'activité de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) et du facteur de croissance de type insulinique-1 (IGF-1) sont tous les deux augmentés dans les expiants arthrosiques comparativement aux expiants normaux, tandis que le niveau de la protéine inhibitrice du plasminogène (PAI-1) pour sa part était inchangée. Afin de vérifier si les modifications observées avec les expiants arthrosiques étaient vraiment dues à un défaut dans les ostéoblastes arthrosiques eux-mêmes, nous avons repris ces expériences avec ces cellules. Les niveaux d'uPA (activité et protéine) et d'IGF-1, dans les surnageants des ostéoblastes arthrosiques ont montré une augmentation significative comparativement aux ostéoblastes normaux. Par contre, le niveau de l'inhibiteur du PA (PAI-1) était similaire entre arthrose et normal. Puisque les systèmes d'uPA/plasmine et d'IGF1/IGFBP sont tous deux impliqués dans la résorption et/ou la formation osseuse, et que des travaux récents démontraient une interrelation possible de ces deux systèmes, nous avons étudié cette question chez les ostéoblastes arthrosiques. L'ajout d'IGF-1 diminua significativement P<0.05) le niveau d'uPA seulement dans les ostéoblastes arthrosiques. Au contraire, l'uPA n'a pas modifié le niveau de l'IGF-1 dans les ostéoblastes normaux ni dans les ostéoblastes arthrosiques. Suite à une stimulation avec l'IGF-1, l'activité basale de l'uPA fut augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques, tandis qu'aucun changement n'était observé dans les ostéoblastes normaux. L'ajout de plasminogène a fortement augmenté l'activité de l'uPA via un phénomène de rétro-action positive causée par la génération de la plasmine qui peut à son tour activer l'uPA latent en uPA actif. Le mécanisme de rétroaction positive fut inhibé par le PAI-1 et l'a2-antiplasmine. Le traitement des ostéoblastes arthrosiques avec l'IGF-1 a inhibé le phénomène de rétroaction positive et ceci d'une façon dose-dépendante, ce facteur de croissance n'ayant aucun effet chez les ostéoblastes normaux. Cette inhibition ne peut être due à une modification du niveau de PAI-1 parce que le niveau de cette protéine n'a révélé aucun changement après le traitement avec l'IGF-1. L'ajout d'IGF-1 a aussi diminué l'activité de la plasmine, dosée par l'hydrolyse d'un substrat spécifique, dans les ostéoblastes arthrosiques mais pas dans les ostéoblastes normaux. En résumé nos travaux ont montré que les ostéoblastes arthrosiques avaient un métabolisme altéré. En plus de montrer des changements à la réponse de marqueurs spécifiques, ces cellules pathologiques présentaient une diminution au niveau des récepteurs à la PTH et une réponse anormale au système uPA/plasmine à leur traitement avec l'IGF-1. Cette observation est appuyée par la diminution du nombre de récepteurs à la PTH dans les ostéoblastes, une situation qui est aussi en accord avec une diminution possible de la résorption osseuse. Si ces observations in vitro se transposent in vivo, ceci signifie que la sclérose de l'os sous-chondral pourrait être due en partie à la diminution de la résorption osseuse. Par ailleurs, l'augmentation du niveau d'IGF-1 et son rôle dans le contrôle négatif de la rétroaction positive du système uPA/Plasmine pourrait aussi contribuer à augmenter la formation osseuse et réduire la résorption osseuse respectivement. La sclérose de l'os sous-chondral pourrait alors jouer un rôle clef dans le déclenchement et la progression de l'arthrose.