Thèse de doctorat--Sciences naturelles--Faculté des sciences de l'Université de Paris, 1912. N°: 1444. / Notes bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [54]-64. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Molecular Genetics and Cell Biology, August 1999. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.

Tout au long de sa maturation, l'ovocyte entouré de cumulus baigne dans un liquide appelé liqueur folliculaire. Cette substance est composée de sécrétion des cellules folliculaires, de l'ovocyte et de protéines provenant du sérum. Le but de cette étude est d'identifier des protéines contenues dans la liqueur folliculaire qui serviraient de marqueurs de la qualité des ovules bovins. Pour ce faire, nous avons utilisé cinq groupes de follicules bovins et produit des gels de protéines pour voir la composition protéique de leur liqueur folliculaire. En parallèle, nous avons utilisé les cellules de granulosa des mêmes follicules pour examiner l'expression de gènes codant pour des protéines pouvant se retrouver dans la liqueur folliculaire. Des protéines et des gènes qui ayant un potentiel pour être de bons marqueurs de qualité ont été identifié. Ainsi, ces marqueurs pourront servir à l'amélioration de la fécondation in vitro tant au niveau du choix de l'ovule que du milieu de maturation.

L'ovule est la seule cellule capable de remodeler l'information génétique de deux parents en celle d'un nouvel embryon, et ce potentiel s'est hautement conservé au cours de l'évolution. La reprogrammation d'un noyau se produit, pour la majorité des espèces, en absence de transcription. Ainsi. l'ARN et les protéines présentes dans l'ovule au moment de la fécondation constituent tout le matériel nécessaire pour soutenir le développement embryonnaire précoce. Les mécanismes tels que l'arrêt méiotique, la méthylation/déméthylation de l'ADN et les réarrangements épigénétiques sont communs à la majorité des vertébrés. Par contre, certaines différences peuvent être observées dans des processus tels la fécondation et la reconnaissance des gamètes. Ce projet vise à identifier des gènes conservés chez les vertébrés et impliqués dans les mécanismes de reprogrammation, puis d'évaluer l'impact de la surexpression de gènes sélectionnés sur la configuration de la chromatine de cellules humaines. La première étape du projet était d'établir un profil fonctionnel des différences et similitudes observables dans le transcriptome de l'ovule des vertébrés. Pour ce faire, nous avons comparé le transcriptome de l'ovule humain aux transcriptomes spécifiques à l'ovule de souris, de bovin et de xénope via une analyse par biopuce développée au sein de notre laboratoire. Pour la seconde partie de la thèse, nous avons sélectionné des candidats qui ont été surexprimés dans des cellules humaines en culture, et avons évalué leur impact à plusieurs niveaux sur la chromatine. Suite aux résultats obtenus, nous nous sommes concentrés sur l'analyse de gènes pouvant être impliqués dans la déméthylation de l'ADN et avons vérifié si leur coexpression pouvait induire la déméthylation d'ADN dans des fibroblastes humains. Une approche d'immunoprécipitation de chromatine et de séquençage au bisulfite nous a permis d'observer une déméthylation modérée à certains sites spécifiques, confirmant un rôle de ces gènes dans la déméthylation de l'ADN humain. Les travaux présentés dans cette thèse permettent de souligner le potentiel de gènes ovocytaires à reconfigurer la chromatine dans d'autres types cellulaires. Leur caractérisation plus poussée pourrait notamment contribuer à des avancements dans la compréhension et la maîtrise des mécanismes de reprogrammation pour la recherche en reproduction ou en médecine regenerative.

Il est reconnu que le passage de la matrice extracellulaire du cumulus ainsi que de la zone pellucide par le spermatozoïde sont assurés, chez plusieurs espèces de mammifères, par la protéine spermatique PH-20. Cette protéine possède une activité hyaluronidase qui lui permet de cliver les liens d'acide hyaluronique contenus dans le cumulus et est responsable de la liaison du spermatozoïde ayant subi la réaction de l'acrosome à la zone pellucide. Une protéine spermatique bovine de 80 kDa (p80) possédant une homologie aVec PH-20 fut identifiée au sein de notre laboratoire. Puisque PH-20 n'est pas identifiée chez le bovin, les travaux présentés dans cette thèse étaient destinés à déterminer si la protéine p80 est la PH-20 bovine et si elle est impliquée dans l'interaction entre les gamètes au cours de la fécondation. Dans un premier temps, la caractérisation de la protéine fut effectuée à l'aide d'une approche PCR et immunologique. L'homologie entre la protéine spermatique bovine p80 et PH-20 fut établie à l'aide de ces résultats. L'analyse de la séquence déduite en acides aminés de p80 a permis de mettre en lumière la présence de caractéristiques uniques chez la protéine dont l'absence d'une ancre-GPI, la présence d'un domaine transmembranaire, de sites de phosphorylation et de N- et O-glycosylation. Deuxièmement, à l'aide du développement d'un anticorps dirigé contre l'extrémité C-terminale de p80 et d'un anticorps dirigé contre l'extrémité N -terminale, l'orientation de p80 dans les membranes spermatiques fut établie. Les résultats montrent que deux populations de p80 existent chez le spermatozoïde bovin. La première est internalisée dans la région antérieure de la tête des spermatozoïdes alors que la deuxième est localisée dans la région post -acrosomale de la tête et expose son domaine hyaluronidase à l'environnement extracellulaire. De plus, les analyses protéomiques et immunologiques démontrent que la population post-acrosomale est un isofo~e plus court de p80 et est d'origine épididymaire alors que la forme pleine longueur présente dans la région antérieure de la tête du spermatozoïde est d'origine testiculaire. La présence de sites d'O-glycosylation fut aussi confirmée expérimentalement. Afin de déterminer le rôle fonctionnel de p80, l'état de phosphorylation sur les résidus tyrosines de la protéine au cours de la capacitation et de la réaction de l'acrosome fut étudié. De même, l'implication de p80 dans la modulation de la concentration des niveaux de calcium intracellulaire spermatique en présence d'acide hyaluronique ainsi que son implication au cours de l'interaction entre le spermatozoïde et la zone pellucide furent déterminées. Les résultats démontrent que p80 n'est pas phosphorylée sur ses résidus tyrosines au cours de la capacitation et de la réaction acros·omique et n'est pas impliquée dans la modulation des concentrations de calcium intracellulaire. Toutefois, p80 est impliquée, via son extrémité C-terminale, dans la liaison du spermatozoïde à la zone pellucide puisque la présence de la protéine purifiée ainsi que l'anticorps C-terminal de p80 dans le milieu inhibe cette liaison. De plus, la glycosylation de la protéine n'est pas responsable de son interaction avec la zone pellucide puisque la présence de la forme déglycosylée de p80 dans le milieu d'incubation produit le même taux d'inhibition que sa forme native. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent clairement que la protéine p80 est la PH-20 bovine, que deux populations sont présentes sur le spermatozoïde et qu'elle est responsable de l'activité hyaluronidase requise par le spermatozoïde pour franchir le cumulus ainsi que pour l'interaction entre ceux -ci et la zone pellucide entourant l'ovule au cours de la fécondation.

La protéine Spam-1, qui est présente à la surface des spermatozoïdes, faciliterait le passage des gamètes mâles à travers le cumulus, en coupant les liens d’acide hyaluronique présents entre les cellules, et serait impliquée dans le processus de liaison secondaire des spermatozoïdes à la zone pellucide de l’ovule. Le but de cette étude, par la construction de protéines recombinantes fluorescentes contenant la séquence des différents domaines fonctionnels de Spam-1, est de démontrer que la protéine spermatique bovine Spam-1 se lie directement à la zone pellucide de l’ovule et de clairement démontrer que c’est la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée. Les résultats obtenus dans le présent mémoire permettront de déterminer l’importance de Spam-1 dans la liaison du spermatozoïde à l’ovule au moment de la fécondation et ainsi de mieux caractériser les mécanismes d’interaction sperme/ovule. / Spam-1 is a sperm surface protein that would help the spermatozoa going through the cumulus, disrupting the hyaluronan around the egg. It would also have a role to play in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida of the oocyte. The aim of the present study, by the construction of various fluorescent recombinant proteins containing the sequences of the different domains of Spam-1, is to clearly demonstrate that bovine spermatic Spam-1 protein is directly implicated in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida and to show that the C-terminal domain is implicated. The results of this study are going to determine the importance of Spam-1 in the spermatozoa binding to the zona pellucida and in getting a better understanding of the mechanisms surrounding the interactions between spermatozoa and oocyte.

Parthenocarpy, or seedless fruit development, has an agronomic importance in many horticultural crops. In most fruit, fertilization or seed set usually determines whether fruit growth is sustained. Naturally occurring parthenocarpy results from a genetic lesion that permits fruit to develop in the absence of fertilization and seed development. Parthenocarpy can also be induced artificially with cytokinin, gibberellin or auxin plant growth regulators applied to anthesis pistils. This thesis describes genetic research using Arabidopsis as a model plant to identify integral mechanisms that control parthenocarpy and the initiation of fruit development. The growth and structure of the Arabidopsis pistil was determined post-fertilization. Experiments were designed to understand how plant growth regulators induce Arabidopsis silique (fruit) development in emasculated anthesis stage pistils. Exogenous gibberellin (GA3) induced growth and cellular differentiation most comparable to pollinated pistils. Dependencies on gibberellins during silique development were examined in mutants defective for gibberellin biosynthesis (ga1, ga4-1, ga5-1) or perception (spy-4, gai-1). Although exogenous GAs are effective at inducing parthenocarpy, mutant studies concluded that GAs are not the sole cue for fruit development in Arabidopsis. Mutants blocked in GA perception could develop siliques in response to pollination, auxin, cytokinin but not to exogenously applied gibberellins. Silique structure in pollinated gai-1 and ga5-1 provided strong evidence for a model supporting evidence of an auxin-like signal regulating structural development and that GAs limit anticlinal cellular division. A specialized function for GAI and related GRAS family members in controlling cellular division during fruit development was uncovered. A mutant that forms parthenocarpic siliques without fertilization (fwf), was also characterized. The presence of surrounding floral whorls reduced the extent of parthenocarpic silique formation in fwf. Silique growth in the fwf background was examined when hormone perception, ovule and carpel identity functions were removed genetically. This established that FWF functions independent of GAI-mediated GA perception. Carpel identity conferred by FUL was critical for parthenocarpic silique elongation and ovule development beyond integument initiation, nucellar specification and subsequent morphogenesis, was essential for parthenocarpic silique development in fwf. Silique elongation occurs over a four-day period post-pollination or post-anthesis. This coincides with a similar time period in which fwf ovules remained receptive to fertilization. These observations are congruent with the hypothesis that FWF potentially represses a signal transduction process initiated within the ovule that mediates subsequent transition from carpel to silique development. Further analysis revealed that aberrant testa shape (ats) a mutant defective in integument formation enhanced parthenocarpic development in fwf, indicating that an ovule located repressor other than fwf can function to affect silique formation. Other studies have shown that ethylene can modulate auxin-dependent growth in both aerial and root tissues by altering both polar and lateral auxin transport. The contribution of ethylene perception to signal transduction between ovule and carpel was also genetically assessed. Constitutive ethylene responses, conferred by ctr1-1, enhanced cellular expansion in fwf and also the autonomous silique development in fis-2, which develops autonomous endosperm. ats ctr1-1 and ino ctr1-1 double mutants were also found to be parthenocarpic. This indicates that ethylene perception and integumentary structure play an important role in autonomous silique development, conceivably by changing the polar and lateral movement of an auxin-like signal within the integumentary tissues of the ovule. fwf and ats were fine mapped on chromosome 5 of Arabidopsis. Candidate genes were identified corresponding to both mutations but only the identity of FWF was established. Auxin Response Factor 8 (ARF8) was cloned and sequenced from the fwf mutant background. The gene encodes a protein with a amino-terminal DNA binding domain and a carboxy-terminal protein binding domain which homo- and hetero- dimerizes with other ARF or Aux / IAA class proteins. ARF8 sequence from fwf mutants encoded a mutation in the translation start site. Complementation of fwf plants by the transformation of wild type copies of ARF8 into fwf plants was hampered by reduced transformation efficiency. However wild type L.er and No.O plants transformed with mutant copies of ARF8 were obtained in higher frequency, and these formed parthenocarpic siliques when primary transformants were emasculated. This indicated that an interfering protein is produced from the mutated ARF8 gene that has altered regulatory activity. Sequence analysis indicated this and found that interference resulted from functional activity of the Q-rich and carboxy-terminal domains of the ARF8 protein. This inference is consistent with other published molecular data, which has demonstrated that the carboxy-terminal domain, together with the Q-rich region of selected ARF members, can activate auxin-responses. Thus the FWF / ARF8 protein may have a dual role, repressing carpel growth development through the DNA binding domain and then ensuring activation of silique development through the carboxy-terminal domain. The combined molecular and genetic data has been used to construct models concerning the genetic control of silique development. The first model considers the role of plant hormones and how signals from floral whorls surrounding the carpel and from within the ovule control silique growth. A model is also presented for the control of adaxial growth and development of the outer integument by the INNER NO OUTER gene. Finally the role of FWF and SPY in controlling floral tissue identity and boundary tissue specification is considered in a third model. Modification of the FWF / ARF8 gene could be used as a tool to improve fruit set and retention in horticultural crops, in addition to creating seedless parthenocarpic fruit. / Thesis (Ph.D.)--Agriculture and Wine, 2001.

Orientadores: Simone de Pádua Teixeira, Sandra Maria Carmello-Guerreiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:30:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caetano_AnaPauladeSouza_D.pdf: 7171602 bytes, checksum: 846db1ce62126a16e2c2bbde210017b5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Melastomataceae, com cerca de 4.500 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, é a sexta maior família entre as angiospermas no Brasil. O grupo destaca-se pela elevada proporção de espécies apomíticas, claramente concentradas em Miconieae. Apesar do monofiletismo da família, a evolução de caracteres morfológicos, as relações e a própria delimitação das tribos permanecem em debate. Este trabalho teve dois objetivos gerais. O primeiro objetivo foi investigar o tipo de apomixia e verificar a ocorrência de reprodução sexuada em seis espécies de Miconieae: Clidemia hirta, Leandra aurea, L. melastomoides, Miconia leucocarpa, Ossaea amygdaloides e O. confertiflora, por meio de análises anatômicas da esporogênese, gametogênese, embriogênese e mensuração da viabilidade e da germinação dos grãos de pólen. O segundo objetivo foi testar a importância sistemática de dois caracteres embriológicos em Melastomataceae: ocorrência de drusas na parede da antera madura e número de camadas no tegumento externo do óvulo, a partir de 180 e 144 espécies, respectivamente. As amostras foram obtidas de espécimes herborizadas ou preservadas em álcool e analisadas anatomicamente. Os resultados revelam que alterações na meiose e heterocronia no desenvolvimento dos grãos de pólen levam à inviabilidade polínica. Apomixia do tipo gametofítica diplospórica é observada nas seis espécies analisadas, e como consequência, a formação de sacos embrionários reduzidos é comprometida. Adicionalmente, em C. hirta observa-se apomixia gametofítica apospórica e em L. melastomoides, embrionia adventícia. A reprodução sexuada parece ser um evento pouco comum nas espécies investigadas, que podem ser classificadas como apomíticas obrigatórias, ou seja, que se reproduzem apenas por apomixia. Drusas na parede da antera madura são relatadas em 89 dos 180 representantes analisados e pode ser usada para delimitar alguns clados. A ocorrência destes cristais parece distinguir o gênero Blakea (Blakeeae), a tribo Henrietteeae e um subclado dentro de "Conostegia s.l." (Miconieae) de grupos proximamente relacionados. O papel das drusas na parede da antera é incerto. O tegumento externo do óvulo, formado por duas camadas celulares, é o estado de caráter mais comum na família, presente em 11 dos 14 grupos amostrados. Variação é observada em Melastomeae, Merianieae e Miconieae. Em Melastomeae, no clado "Marcetia & allies" a ocorrência de óvulos com tegumento externo formado por três camadas de células é apontada como uma sinapomorfia para o grupo. Em Miconieae, a ocorrência de três camadas no tegumento externo do óvulo é o estado de caráter mais comum, mas a ocorrência de mais de três camadas foi observada em linhagens com sementes grandes. Na tribo, a espessura do tegumento externo pode estar relacionada a presença de frutos endozoóricos. Ainda em Miconieae, o gênero Physeterostemon e um subclado dentro de "Conostegia s.l." foram delimitados pela ocorrência de duas camadas no tegumento externo do óvulo. A comparação dos dados embriológicos obtidos em diferentes linhagens de Melastomataceae evidencia a importância deste tipo de estudo para a sistemática da família e fornece informações para futuras discussões evolutivas / Abstract: Melastomataceae comprise ~4,500 species found in tropical and subtropical regions. This is the sixth largest family of flowering plants in Brazil. The group has been highlighted for its high proportion of apomictic species, clearly concentrated in Miconieae. Despite of the supported monophyly of the family, their intrafamily relationships and morphological evolution are still now poorly understood. The objectives of this study were twofold. The first aim was to investigate the apomixis type and to verify the occurrence of sexual reproduction in six species of Miconieae: Clidemia hirta, Leandra aurea, L. melastomoides, Miconia leucocarpa, Ossaea amygdaloides and O. confertiflora. Sporogenesis, gametogenesis and embryogenesis anatomy, and pollen grain viability and germination measurement were used. The second aim of this study was to test the systematic importance of two embryological characters in Melastomataceae: druses occurrence in the anther wall cells and the thickness of the outer ovule integument from 180 and 144 species, respectively. For this purpose, we used anatomical analyses from herborized and spirit samples. The results show abnormal meiosis and heterochrony as cause of pollen inviability. Diplosporic apomixis was observed in all species and thus, the sexual embryo sac development is affected. Furthermore, aposporic apomixis was observed in C. hirta and adventitious embryony in L. melastomoides. Sexual reproduction appears to be an uncommon event in the investigated species, which can be classified as obligate apomitics. Druses in the anther wall cells were observed in 89 from 180 analysed species. The druses occurrence delimits Blakea (Blakeeae), Henrietteeae and a subclade in "Conostegia s.l." (Miconieae). The role of druses in the anther wall is uncertain. The bi-layered outer ovule integument was the most common character state in the family, observed in 11 from 14 sampled groups. Variations were detected in Melastomeae, Merianieae and Miconieae. The three-layered outer integument is pointed as a synapomorphy for "Marcetia & allies" (Melastomeae) and it is a character state most common in Miconieae, although more than three layers were observed in lineages with large seeds. We propose that the outer ovule integument may be related to the endozoochorous fruits in Miconieae. A bi-layered outer integument delimits Physeterostemon and a subclade in "Conostegia s.l." (Miconieae). The embryological data comparison for different groups of Melastomataceae highlights the importance of this study in the systematic works and provides information for future evolutionary discussions / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal