Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences

Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Delta-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) is an essential metalloprotein found in several biological processes, since it is able to catalyze the formation of porphobilinogen (PBG), a precursor monopyrol of tetrapyrroles (heme and chlorophyll). This enzyme is sensible to heavy metals and other pro-oxidant agents and, consequently, it has been classically used as a protein marker for lead intoxication. Both in vitro and in vivo studies has shown that the organochalcogen diphenyl diselenide [(PhSe)2] could be a promising drug due to present antioxidant, neuroprotective, anti-inflammatory, anti-atherosclerotic and other activities. Contrariwise, (PhSe)2 could also be toxic because it can inhibit the activity of important sulfhydryl enzymes, including δ-ALA-D. Regarding some experimental data, it has been speculated that mammalian δ-ALA-D inhibition can occur via the oxidation of two vicinal thiols located in it active center site. However, no molecular model had been proposed in order to explain this interaction with details. Thus, we aimed to get a further understanding about the interaction involving δ-ALA-D and diselenides using in silico molecular modeling methods, which are consisted in theoretical methods applied in to represent or mimic the behavior and interaction of ligands and enzymes from their structural and thermodynamic information. Docking simulations indicated an important role for π-π interactions involving Phe208 and cation-π interactions involving Lys199 and Arg209 residues with the aromatic ring of (PhSe)2 and analogs bis 4-(clorophenyl) diselenide, bis 4-(methoxyphenyl)diselenide and bis 3-(trifluorometil(phenyl)diselenide. These interactions allowed an approximation between Se atoms and SH of Cys124 (3.3 3.5 Å). The analogs interacted similarly with the active site of δ-ALAD. According to the quantum method MFCC (Molecular Fractionation with Conjugated Caps), interactions involving (PhSe)2 could occur up to 8.5 Å distance from the centroid of active site. Phe208, Phe79, Cys122, Cys124, Pro125, Asp120, Lys199, Lys252 and Cys132 displayed strong attraction energy to (PhSe)2. The representative molecular model is in accordance with in vitro assays and gives mechanistic support to previous speculative mechanism of inhibition. Phenyl moieties in (PhSe)2 can be strongly attracted by aromatic and positive charged residues from δ-ALA-D active site. This allows the approximation of the reactive electrophile moiety Se-Se to the nucleophile S- groups from Cys122, Cys124 and Cys132, facilitating the release of coordinated Zn(II), thiol oxidation and formation of 2 molecules of phenylselenol (PhSeH). In conclusion, the presence of aromatic moieties in (PhSe)2 and its reactive electrophile moiety Se-Se are crucial to δ-ALA-D inhibition, which leads to thiol oxidation and consequent impairment of its activity. / A enzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) é uma metaloproteína essencial em vários processos biológicos, uma vez que é responsável por catalisar a formação de porfobilinogênio (PBG), um precursor dos tetrapirrólicos (heme, clorofila). Esta enzima é sensível a metais pesados e outros pró-oxidantes e, dessa forma, tem sido classicamente usada como um marcador na intoxicação por chumbo. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que o organocalcogênio disseleneto de difenila [(PhSe)2] pode ser um fármaco promissor por demonstrar várias atividades biológicas, incluindo antioxidante, neuroprotetora, anti-inflamatória, anti-aterosclerótica e outras. Por outro lado, o (PhSe)2 e análogos também são tóxicos por inibir a atividade de enzimas sulfidrílicas, incluindo a δ-ALA-D. Baseados em dados experimentais, tem-se especulado que a inibição da δ-ALA-D de mamíferos pode ocorrer via oxidação de dois tióis vizinhos localizados no centro ativo da enzima. No entanto, não se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em modelagem molecular com o intuito de explicar esta interação de forma mais detalhada. Diante disso, objetivamos compreender essas interações a partir da modelagem molecular in silico, que consiste em métodos teóricos aplicados para representar ou mimetizar o comportamento e interação de ligantes e enzimas a partir de informações sobre os requisitos estruturais e termodinâmicos essenciais. Os estudos de docking molecular indicaram um papel importante das interações π-π envolvendo Phe208 e cátion-π envolvendo Lys199 e Arg209 e anéis aromáticos do (PhSe)2 e análogos bis 4-(clorofenil) disseleneto, bis 4-(metoxifenil) disseleneto e bis 3-[trifluorometil(fenil)] disseleneto. Estas interações permitem uma aproximação entre átomos de Se do composto e SH da Cys124 (3.3 3.5 Å). Os análogos também interagem de forma semelhante com o sítio ativo da δ-ALA-D. De acordo com o método MFCC (Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas), foi possível observar interações envolvendo o (PhSe)2 e resíduos posicionados até uma distância de 8,5 Å do centroide do ligante. Phe79, Cys122, Cys124, Pro125, Asp120, Lys199, Lys252 e Cys132 demonstraram as maiores energia de interação (atrativa) com o (PhSe)2. O modelo molecular representado está em conformidade com ensaios in vitro e fornece informações importantes que reforçam o mecanismo de inibição especulado. Os grupos fenil do (PhSe)2 são fortemente atraídos por resíduos aromáticos e carregados positivamente presentes no sítio ativo da δ-ALA-D. Dessa forma, permite-se a aproximação da porção eletrófila Se Se ao grupos nucleófilos S dos resíduos Cys122, Cys124 e Cys132, facilitando a liberação de Zn(II), a oxidação dos tiolatos e a formação de duas moléculas de fenilselenol (PhSeH), levando a consequente inibição da atividade da enzima.