A substância 3-O-α-arabinofuranosil-quercetina (avicularina) é um flavonol já relatado em uma grande variedade de espécies vegetais, podendo ser encontrada em diversas frutas e plantas medicinais. Neste trabalho o flavonóide foi isolado da espécie Bidens sulphurea, popularmente conhecida como cosmo-amarelo, picãogrande e áster-do-méxico, com pureza de 93,27%. O flavonóide avicularina apresenta diversas propriedades biológicas descritas na literatura, e estudos científicos que comprovam a eficácia deste composto. No entanto não há estudos que avaliem os mecanismos que envolvem a farmacocinética (ADME) deste flavonóide, bem como sua biodisponibilidade. Sendo assim este trabalho teve como objetivo a determinação dos perfis farmacocinéticos de absorção da avicularina em ratos na presença e ausência de sais biliares e inibidor da glicoproteína-P, pelo ensaio de perfusão intestinal in situ. Neste trabalho também foi realizado a avaliação do perfil farmacocinético de distribuição e eliminação através de administração intravascular do flavonóide avicularina na dose de 1mg/kg em ratos. Para ambos os ensaios um método analítico sensível por CLUE-DAD-EM/EM foi desenvolvido e validado obedecendo às diretrizes do guia para validação de métodos bioanalíticos da ANVISA. Os ensaios de absorção com este flavonóide revelaram que sua taxa de absorção intestinal é baixa, em torno de 30% para as duas doses testadas (1 e 5 mg/kg), sugerindo uma baixa biodisponibilidade para este flavonóide. No entanto na presença do inibidor de glicoproteína-P, verapamil, o percentual absorvido final de avicularina foi de aproximadamente 80%, o que sugere o envolvimento de proteínas de efluxo em sua absorção. Através do estudo de farmacocinética com administração intravascular de avicularina pudemos concluir que o perfil farmacocinético do flavonóide em questão é bicompartimental, e possui rápida distribuição e eliminação do organismo, sendo o t ½α de 8 minutos e t ½β de 45 minutos, e, portanto baixa afinidade por tecidos, sendo baixa ou numa sua acumulação tecidual. / The compound 3-O-α-arabinofuranosyl-quercetin (avicularin) is a flavonol already reported in a wide variety of plant species and can be found in many fruits and medicinal plants. In this work the flavonoid was isolated from the species Bidens sulphurea, popularly known as yellow cosmos and aster of mexico, with 93.27% of purity. The flavonoid avicularin has several biological properties described in the literature, and several scientific studies that prove the efficacy of this compound. However there are no studies that evaluate the mechanisms involving the pharmacokinetics (ADME) of this flavonoid as well as its bioavailability. Thus, this study aimed to determine the pharmacokinetic profiles of avicularin absorption in rats in the presence and absence of bile salts and inhibitor of P-glycoprotein by in situ intestinal perfusion technique. This work was also performed to evaluate the pharmacokinetic profile of distribution and elimination through intravascular administration of the flavonoid avicularina at the dose of 1mg/kg in rats. For both studies a sensitive analytical UPLC-DAD/MS/MS method was developed and validated following the guidelines of the Guide for the validation of bioanalytical methods of ANVISA. The absorption assays have shown that with this flavonoid its intestinal absorption rate is low, around 30% for both tested doses (1 and 5 mg / kg), suggesting a low bioavailability of this flavonoid. However in the presence of Pglycoprotein inhibitors, verapamil, the percentage of absorbed avicularina was approximately 80%, suggesting the involvement of protein efflux in the absorption. Through pharmacokinetic study with intravascular administration of avicularin we could concluded that the pharmacokinetic profile of the flavonoid in question is twocompartmental model, and has quickly distribution and elimination of the organism, being the t ½α of 8 minutes, and t ½β of 45 minutes, thus this compound has low affinity for tissues, with low or none tissue accumulation.

A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma expansão clonal da célula tronco hematopoética, traduzindo-se por hiperplasia mieloide, leucocitose, neutrofilia, basofilia e esplenomegalia. O cromossomo Filadélfia é característico da doença, sendo produto da translocação t(9:22)(q34;q11), resultando na fusão dos genes ABL e BCR. Esta fusão gera um gene híbrido que codifica uma proteína com elevada atividade tirosinoquinase e tem um papel central na patogenia da LMC. O mesilato de imatinibe (MI) é um derivado da fenilaminopirimidina que inibe a proteína tirosinoquinase BCR-ABL1 in vitro e in vivo. O MI interage com transportadores de membrana de influxo, como o organic carion solute carrier 22 ,member 1 (SLC22A1,hOCT1); e de efluxo, como ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1, P-gp). Os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, C.3435C>T e c.2677G>T/A têm sido associados com a alteração da função da P-gp. Este estudo teve por objetivo investigar a relação da expressão do RNAm de ABCB1 e SLC22A1 com marcadores de resposta ao tratamento com MI e avaliar a atividade funcional da P-gp em células mononucleares de pacientes com diferentes haplótipos para os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Foram incluídos 118 pacientes com LMC para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 e para o estudo da atividade da P-gp foram selecionados 28 pacientes de acordo com os haplótipos dos polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 foram constituídos dois grupos: Grupo 1 com 70 pacientes com resposta citogenética completa com a dose padrão de MI (400 mg/dia de MI) em até 18 meses e, Grupo 2 com 48 pacientes sem resposta citogenética completa com a dose inicial de 400 mg/dia de MI ou que perderam esta resposta ao longo do tratamento. Para o estudo da atividade funcional da P-gp, dos 118 pacientes incluídos, foram selecionados 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG, 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CT/3435CT/2677GT e 8 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236TT/3435TT/2677TT. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European LeukemiaNet. Amostras de sangue foram obtidas para: quantificação de BCR-ABL1, extração do RNAm total, análise citogenética de banda G, dosagem da concentração plasmática de MI e análise da atividade e expressão da P-gp. A análise da expressão dos genes ABCB1 e SLC22A1 foi feita por PCR em tempo real, a análise da atividade e expressão da P-gp foram feitas por citometria de fluxo e a dosagem da concentração plasmática de MI foi realizada por eletroforese capilar. Resultados: A expressão de ABCB1 e SLC22A1 foi analisada nos 118 pacientes incluídos e foi similar entre os grupos de resposta. A elevada expressão do gene SLC22A1 foi associada àqueles pacientes que alcançaram a resposta molecular maior (RMM) no grupo respondedor (P=0,009). Não houve associação entre a expressão de ABCB1 e a resposta ao MI. Nenhum dos genes foi associado à resposta molecular completa (RMC). No estudo da atividade da P-gp foi observada uma maior atividade nos pacientes que apresentavam o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG quando comparado àqueles que possuíam o haplótipo com alelo mutado. Não houve diferença na expressão do RNAm dos genes SLC22A1 e ABCB1, expressão da P-gp e concentração plasmástica de MI entre os grupos de haplótipos. Os pacientes que não alcançaram a RMM apresentaram uma maior taxa de efluxo mediado pela P-gp quando comparado aos indivíduos que alcançaram esta resposta (64,7% vs. 45,7%; P=0,001). Os indivíduos que alcançaram a RMM e RMC apresentaram maior mediana de expressão do gene SLC22A1. Os pacientes sem RMM apresentaram menor concentração plasmática de MI quando comparados aos que alcançaram esta resposta (0,51 µg/mL vs. 1,42 µg/mL; P=0,001). Não foi observada associação entre a concentração plasmática de MI e a RMC. Em conclusão os pacientes respondedores a dose padrão de 400mg/dia de MI e que alcançaram a RMM apresentam maior expressão de RNAm de SLC22A1 e os portadores dos haplótipos 1236CT/3435CT/2677GT e 1236TT/3435TT/2677TT exibem menor efluxo mediado pela P-gp apresentando maior frequência de RMM. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal expansion of hematopoietic stem cell, translating into myeloid hyperplasia, leukocytosis, neutrophilia, basophilia and splenomegaly. The Philadelphia chromosome is characteristic of the disease, being the product of the translocation t(9:22)( q34,q11), resulting in the fusion of the BCR and ABL genes. This fusion generates a hybrid gene that encodes a protein with elevated tyrosine kinase activity and plays a central role in the pathogenesis of CML. Imatinib mesylate (IM) is a derivative of fenilaminopirimidine that inhibits BCR-ABL1 fusion protein tyrosine kinase in vitro and in vivo. IM interacts with uptake membrane transporters, such as cation organic solute carrier 22, member 1 (SLC22A1, hOCT1) and efflux as ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1,P-gp). ABCB1 polymorphisms c.1236C>T,c.3435C>T and c.2677G>T/A have been associated with altered function of P-gp. This study aimed to investigate the relationship between mRNA expression of ABCB1 and SLC22A1 with markers of response to treatment with IM and evaluate the functional activity of P-gp in mononuclear cells of patients with different haplotypes for ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. This study included 118 patients with CML to study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 and to study the P-gp activity, 28 patients were selected according to the haplotypes of ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. To study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1, two groups were constituted: Group 1 with 70 patients with a complete cytogenetic response with standard-dose IM (400 mg/day) in 18 months, and group 2 with 48 patients without complete cytogenetic response with the initial dose of IM (400 mg/day) or have lost this response during treatment. To study the P-gp functional activity, 10 patients with haplotype 1236CC/3435CC/2677GG, 10 patients with haplotype 1236CT/3435CT/2677GT and 8 patients with haplotype 1236TT/3435TT/2677TT were enrolled. Treatment response was assessed according to European LeukemiaNet criteria. Blood samples were obtained for: quantification of BCR-ABL1, mRNA extraction, G band cytogenetic analysis, measurement of IM plasma levels and P-gp activity and expression. The ABCB1 and SLC22A1 gene expression analysis was made by real-time PCR, analysis of P-gp activity and protein expression were performed by flow cytometry and determination of plasma Levels of IM was performed by capillary electrophoresis. Results: Expression of ABCB1 and SLC22A1 were analyzed in 118 patients included and was similar between the response groups. Higher expression of the SLC22A1 gene was associated with those patients who achieved a major molecular response (MMR) in the responder group (P=0.009). There was no association between ABCB1 expression and IM response. None of the studied genes was associated with complete molecular response (CMR). In the study of P-gp activity we observed greater activity mediated by P-gp in patients with 1236CC/3435CC/2677GG haplotype when compared to those with the mutated allele. There was no difference in mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 genes, P-gp expression and IM plasma levels between haplotypes groups. Patients who did not achieve MMR showed a higher rate of efflux mediated by P-gp compared to individuals who did achieve this response (64.7% vs. 45.7%, P=0.001). Individuals who achieved MMR and CMR had higher median of SLC22A1 expression. Patients without MMR had lower IM plasma levels compared with those who achieved this response (0.51 µg/mL vs. 1.42 µg/mL, P=0.001). No association was observed between IM plasma levels and CMR. In conclusion patients responders to standard dose of IM (400 mg/day) and who achieved MMR have higher SLC22A1 mRNA expression and the carriers of 1236CT/3435CT/2677GT 1236TT/3435TT/2677TT haplotypes exhibit lower efflux mediated by P-gp with higher frequency of MMR.

A substância 3-O-α-arabinofuranosil-quercetina (avicularina) é um flavonol já relatado em uma grande variedade de espécies vegetais, podendo ser encontrada em diversas frutas e plantas medicinais. Neste trabalho o flavonóide foi isolado da espécie Bidens sulphurea, popularmente conhecida como cosmo-amarelo, picãogrande e áster-do-méxico, com pureza de 93,27%. O flavonóide avicularina apresenta diversas propriedades biológicas descritas na literatura, e estudos científicos que comprovam a eficácia deste composto. No entanto não há estudos que avaliem os mecanismos que envolvem a farmacocinética (ADME) deste flavonóide, bem como sua biodisponibilidade. Sendo assim este trabalho teve como objetivo a determinação dos perfis farmacocinéticos de absorção da avicularina em ratos na presença e ausência de sais biliares e inibidor da glicoproteína-P, pelo ensaio de perfusão intestinal in situ. Neste trabalho também foi realizado a avaliação do perfil farmacocinético de distribuição e eliminação através de administração intravascular do flavonóide avicularina na dose de 1mg/kg em ratos. Para ambos os ensaios um método analítico sensível por CLUE-DAD-EM/EM foi desenvolvido e validado obedecendo às diretrizes do guia para validação de métodos bioanalíticos da ANVISA. Os ensaios de absorção com este flavonóide revelaram que sua taxa de absorção intestinal é baixa, em torno de 30% para as duas doses testadas (1 e 5 mg/kg), sugerindo uma baixa biodisponibilidade para este flavonóide. No entanto na presença do inibidor de glicoproteína-P, verapamil, o percentual absorvido final de avicularina foi de aproximadamente 80%, o que sugere o envolvimento de proteínas de efluxo em sua absorção. Através do estudo de farmacocinética com administração intravascular de avicularina pudemos concluir que o perfil farmacocinético do flavonóide em questão é bicompartimental, e possui rápida distribuição e eliminação do organismo, sendo o t ½α de 8 minutos e t ½β de 45 minutos, e, portanto baixa afinidade por tecidos, sendo baixa ou numa sua acumulação tecidual. / The compound 3-O-α-arabinofuranosyl-quercetin (avicularin) is a flavonol already reported in a wide variety of plant species and can be found in many fruits and medicinal plants. In this work the flavonoid was isolated from the species Bidens sulphurea, popularly known as yellow cosmos and aster of mexico, with 93.27% of purity. The flavonoid avicularin has several biological properties described in the literature, and several scientific studies that prove the efficacy of this compound. However there are no studies that evaluate the mechanisms involving the pharmacokinetics (ADME) of this flavonoid as well as its bioavailability. Thus, this study aimed to determine the pharmacokinetic profiles of avicularin absorption in rats in the presence and absence of bile salts and inhibitor of P-glycoprotein by in situ intestinal perfusion technique. This work was also performed to evaluate the pharmacokinetic profile of distribution and elimination through intravascular administration of the flavonoid avicularina at the dose of 1mg/kg in rats. For both studies a sensitive analytical UPLC-DAD/MS/MS method was developed and validated following the guidelines of the Guide for the validation of bioanalytical methods of ANVISA. The absorption assays have shown that with this flavonoid its intestinal absorption rate is low, around 30% for both tested doses (1 and 5 mg / kg), suggesting a low bioavailability of this flavonoid. However in the presence of Pglycoprotein inhibitors, verapamil, the percentage of absorbed avicularina was approximately 80%, suggesting the involvement of protein efflux in the absorption. Through pharmacokinetic study with intravascular administration of avicularin we could concluded that the pharmacokinetic profile of the flavonoid in question is twocompartmental model, and has quickly distribution and elimination of the organism, being the t ½α of 8 minutes, and t ½β of 45 minutes, thus this compound has low affinity for tissues, with low or none tissue accumulation.

A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma expansão clonal da célula tronco hematopoética, traduzindo-se por hiperplasia mieloide, leucocitose, neutrofilia, basofilia e esplenomegalia. O cromossomo Filadélfia é característico da doença, sendo produto da translocação t(9:22)(q34;q11), resultando na fusão dos genes ABL e BCR. Esta fusão gera um gene híbrido que codifica uma proteína com elevada atividade tirosinoquinase e tem um papel central na patogenia da LMC. O mesilato de imatinibe (MI) é um derivado da fenilaminopirimidina que inibe a proteína tirosinoquinase BCR-ABL1 in vitro e in vivo. O MI interage com transportadores de membrana de influxo, como o organic carion solute carrier 22 ,member 1 (SLC22A1,hOCT1); e de efluxo, como ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1, P-gp). Os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, C.3435C>T e c.2677G>T/A têm sido associados com a alteração da função da P-gp. Este estudo teve por objetivo investigar a relação da expressão do RNAm de ABCB1 e SLC22A1 com marcadores de resposta ao tratamento com MI e avaliar a atividade funcional da P-gp em células mononucleares de pacientes com diferentes haplótipos para os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Foram incluídos 118 pacientes com LMC para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 e para o estudo da atividade da P-gp foram selecionados 28 pacientes de acordo com os haplótipos dos polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 foram constituídos dois grupos: Grupo 1 com 70 pacientes com resposta citogenética completa com a dose padrão de MI (400 mg/dia de MI) em até 18 meses e, Grupo 2 com 48 pacientes sem resposta citogenética completa com a dose inicial de 400 mg/dia de MI ou que perderam esta resposta ao longo do tratamento. Para o estudo da atividade funcional da P-gp, dos 118 pacientes incluídos, foram selecionados 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG, 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CT/3435CT/2677GT e 8 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236TT/3435TT/2677TT. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European LeukemiaNet. Amostras de sangue foram obtidas para: quantificação de BCR-ABL1, extração do RNAm total, análise citogenética de banda G, dosagem da concentração plasmática de MI e análise da atividade e expressão da P-gp. A análise da expressão dos genes ABCB1 e SLC22A1 foi feita por PCR em tempo real, a análise da atividade e expressão da P-gp foram feitas por citometria de fluxo e a dosagem da concentração plasmática de MI foi realizada por eletroforese capilar. Resultados: A expressão de ABCB1 e SLC22A1 foi analisada nos 118 pacientes incluídos e foi similar entre os grupos de resposta. A elevada expressão do gene SLC22A1 foi associada àqueles pacientes que alcançaram a resposta molecular maior (RMM) no grupo respondedor (P=0,009). Não houve associação entre a expressão de ABCB1 e a resposta ao MI. Nenhum dos genes foi associado à resposta molecular completa (RMC). No estudo da atividade da P-gp foi observada uma maior atividade nos pacientes que apresentavam o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG quando comparado àqueles que possuíam o haplótipo com alelo mutado. Não houve diferença na expressão do RNAm dos genes SLC22A1 e ABCB1, expressão da P-gp e concentração plasmástica de MI entre os grupos de haplótipos. Os pacientes que não alcançaram a RMM apresentaram uma maior taxa de efluxo mediado pela P-gp quando comparado aos indivíduos que alcançaram esta resposta (64,7% vs. 45,7%; P=0,001). Os indivíduos que alcançaram a RMM e RMC apresentaram maior mediana de expressão do gene SLC22A1. Os pacientes sem RMM apresentaram menor concentração plasmática de MI quando comparados aos que alcançaram esta resposta (0,51 µg/mL vs. 1,42 µg/mL; P=0,001). Não foi observada associação entre a concentração plasmática de MI e a RMC. Em conclusão os pacientes respondedores a dose padrão de 400mg/dia de MI e que alcançaram a RMM apresentam maior expressão de RNAm de SLC22A1 e os portadores dos haplótipos 1236CT/3435CT/2677GT e 1236TT/3435TT/2677TT exibem menor efluxo mediado pela P-gp apresentando maior frequência de RMM. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal expansion of hematopoietic stem cell, translating into myeloid hyperplasia, leukocytosis, neutrophilia, basophilia and splenomegaly. The Philadelphia chromosome is characteristic of the disease, being the product of the translocation t(9:22)( q34,q11), resulting in the fusion of the BCR and ABL genes. This fusion generates a hybrid gene that encodes a protein with elevated tyrosine kinase activity and plays a central role in the pathogenesis of CML. Imatinib mesylate (IM) is a derivative of fenilaminopirimidine that inhibits BCR-ABL1 fusion protein tyrosine kinase in vitro and in vivo. IM interacts with uptake membrane transporters, such as cation organic solute carrier 22, member 1 (SLC22A1, hOCT1) and efflux as ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1,P-gp). ABCB1 polymorphisms c.1236C>T,c.3435C>T and c.2677G>T/A have been associated with altered function of P-gp. This study aimed to investigate the relationship between mRNA expression of ABCB1 and SLC22A1 with markers of response to treatment with IM and evaluate the functional activity of P-gp in mononuclear cells of patients with different haplotypes for ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. This study included 118 patients with CML to study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 and to study the P-gp activity, 28 patients were selected according to the haplotypes of ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. To study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1, two groups were constituted: Group 1 with 70 patients with a complete cytogenetic response with standard-dose IM (400 mg/day) in 18 months, and group 2 with 48 patients without complete cytogenetic response with the initial dose of IM (400 mg/day) or have lost this response during treatment. To study the P-gp functional activity, 10 patients with haplotype 1236CC/3435CC/2677GG, 10 patients with haplotype 1236CT/3435CT/2677GT and 8 patients with haplotype 1236TT/3435TT/2677TT were enrolled. Treatment response was assessed according to European LeukemiaNet criteria. Blood samples were obtained for: quantification of BCR-ABL1, mRNA extraction, G band cytogenetic analysis, measurement of IM plasma levels and P-gp activity and expression. The ABCB1 and SLC22A1 gene expression analysis was made by real-time PCR, analysis of P-gp activity and protein expression were performed by flow cytometry and determination of plasma Levels of IM was performed by capillary electrophoresis. Results: Expression of ABCB1 and SLC22A1 were analyzed in 118 patients included and was similar between the response groups. Higher expression of the SLC22A1 gene was associated with those patients who achieved a major molecular response (MMR) in the responder group (P=0.009). There was no association between ABCB1 expression and IM response. None of the studied genes was associated with complete molecular response (CMR). In the study of P-gp activity we observed greater activity mediated by P-gp in patients with 1236CC/3435CC/2677GG haplotype when compared to those with the mutated allele. There was no difference in mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 genes, P-gp expression and IM plasma levels between haplotypes groups. Patients who did not achieve MMR showed a higher rate of efflux mediated by P-gp compared to individuals who did achieve this response (64.7% vs. 45.7%, P=0.001). Individuals who achieved MMR and CMR had higher median of SLC22A1 expression. Patients without MMR had lower IM plasma levels compared with those who achieved this response (0.51 µg/mL vs. 1.42 µg/mL, P=0.001). No association was observed between IM plasma levels and CMR. In conclusion patients responders to standard dose of IM (400 mg/day) and who achieved MMR have higher SLC22A1 mRNA expression and the carriers of 1236CT/3435CT/2677GT 1236TT/3435TT/2677TT haplotypes exhibit lower efflux mediated by P-gp with higher frequency of MMR.

P-glycoprotein (P-gp or ABCB1) is a membrane-bound active transporter belonging to the ABC protein superfamily. It is responsible for xenobioIc efflux and also contributes to multidrug resistance in diverse diseases including cancer and epilepsy. P-gp has been increasingly recognised as a potential target for future therapeutics. Although the protein has been studied for decades, understanding of the P-gp transport mechanism is still incomplete. Two P-gp orthologues, mouse (m) and human (h), were therefore expressed in yeasts and purified in the presence of the detergent, n-Dodecyl-β-D- Maltoside (DDM). Purified proteins were examined for aggregation and monodispersity via dynamic light scattering (DLS) and their thermal stability was determined by an assay using a thiol-specific dye (CPM). ATPase activity, measured in a detergent environment, showed that the proteins were active with a basal activity of 60 ± 4 and 35 ± 3 nmol/min/mg for mP-gp and hP-gp, respectively. Crystallisation trials were conducted in the presence of nucleotide. In meso crystallisation using commercial monoolein pre- dispensed plates yielded hexagonal crystal-like objects however they failed to diffract X- rays. P-gp samples were also subjected to cryo-EM where mP-gp in the post-hydrolytic (ADP-bound, vanadate-trapped) state provided the highest resolution dataset that led to a reconstruction of 3D density map at the resolution of 7.9 Å which showed an inward- facing conformation. Rigid-body model fitting unveiled densities that were not accounted for by the fitted model illustrating new features such as bound ADP, extended NBD1- TMD2 linker and alternative allocrite-binding sites. Ultimately, the knowledge of P-gp conformation alteration was enhanced and a refined alternating access mechanism of P- gp was proposed based upon information derived from this study.

<p>Flödescytometrisk cellsortering möjliggör att ur ett större cellmaterial separera en subpopulation celler för vidare analyser. Uppkomst av cytostatikaresistens beror på olika faktorer men där överuttryck av P-gp spelar stor roll. P-gp transporterar aktivt ut cytostatika ur cellen. I studier på AML-celler har man flödescytometriskt påvisat att JC-1 ackumulering speglar P-gp aktivitet. Därmed kan cytostatikaresistenta celler identifieras och sorteras.</p><p>Bröstcancer är den svenska kvinnans vanligaste cancerform där cytostatika ofta ingår i den postoperativa behandlingen. Trots att många patienter svarar på första behandlingen drabbas många ändå av återfall. Problematik med cytostatikaresistens är då vanligt förekommande.</p><p>Syftet med denna studie var att sätta upp en metod för att flödescytometrisk cellsortera avseende olika JC-1 ackumulering och därmed olika cytostatikakänslighet.</p><p>I studien användes färskt brösttumörmaterial och två subcellinjer av leukemicellinjen HL-60. HL-60 S som är känslig för cytostatika och HL-60 R5 som är resistent vid odling med 5 µM doxorubicin.</p><p>Resultaten visade att starkare fluorescensintensitet erhölls vid inkubation och förvaring i JC-1 jämfört med att efter JC-1 inkubation förvara cellerna i D-PBS. Det var möjligt att inkubera ett större antal celler med JC-1 i cellodlingsflaska. Resultaten visar dock att flödescytometrisk sortering kraftigt påverkade viabiliteten hos HL-60 S + R5 där endast två tredjedelar av cellerna var viabla efter sorteringen. Preparering av brösttumörmaterial med Medicon medförde att en betydande andel celler dog och materialet i studien var inte tillräckligt för cellsortering. Att cellsortera kräver kunskap och erfarenhet och det är av vikt att prepareringsmetoden och sorteringsinställningarna optimeras på det material som ska användas i studien.</p>

Interações medicamentosas envolvendo a glicoproteína-P (P-gp) intestinal e placentária são determinantes na disposição cinética e transferência placentária de medicamentos durante a gestação. A fexofenadina, fármaco anti-histamínico, está disponível na clínica como racemato com indicação de uso durante a gravidez para o tratamento da rinite alérgica sazonal e urticária crônica. Considerando a fexofenadina como um substrato da P-gp e a fluoxetina, fármaco antidepressivo indicado durante a gravidez, um inibidor da P-gp, o presente estudo investiga a influência da fluoxetina na disposição cinética enantiosseletiva da fexofenadina em parturientes e suas relações com a transferência placentária in vivo e ex vivo. No estudo in vivo foram investigadas 16 parturientes, sendo 8 incluídas no grupo Controle e 8 incluídas no grupo Interação. Todas as parturientes investigadas receberam dose única oral de 60mg de fexofenadina racêmica, enquanto as parturientes do grupo Interação receberam também dose única oral de 40mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina. As amostras seriadas de sangue e urina foram colhidas até 48 h após a administração da fexofenadina. Na resolução do parto (2-3 h após a administração da fexofenadina) foram coletadas simultaneamente amostras de sangue materno, venoso e arterial do cordão umbilical e do espaço interviloso placentário. No modelo ex vivo, a farmacocinética transplacentária dos enantiômeros da fexofenadina foi avaliada em 4 lóbulos de placenta humana. Os enantiômeros da fexofenadina foram determinados nas amostras de plasma, urina e solução de perfusão placentária por LC-MS/MS acoplado a coluna de fase estacionária quiral Chirobiotic® V. A análise farmacocinética foi realizada empregando o programa WinNonlin e os testes estatísticos foram realizados com o auxílio do programa R. A disposição cinética da fexofenadina é enantiosseletiva no plasma materno com maiores valores de AUC0-? (423,20 vs 267,67 ng×h/mL) e menores valores de volume de distribuição aparente (621,37 vs 889,83 L), clearance total aparente (66,20 vs 105,05 L/h) e clearance renal aparente (5,25 vs 8,78 L/h) para o distômero (R)-(+)-fexofenadina. A transferência placentária da fexofenadina é limitada com razões de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna de aproximadamente 0,16 para ambos os enantiômeros. As razões enantioméricas R-(+)/S-(-) de aproximadamente 1,7 nos compartimentos materno e fetal sugerem que a P-gp placentária não discrimina entre os enantiômeros da fexofenadina. A administração de dose única oral de 40 mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina aumentou os valores de AUC0-? (376,09 vs 267,67 ng×h/mL) e reduziu os valores de clearance total aparente (74,37 vs 105,05 L/h) e clearance renal aparente (3,50 vs 8,78 L/h) somente para o eutômero (S)-(-)-fexofenadina, inferindo inibição enantiosseletiva da P-gp intestinal. A administração de dose única oral de 40 mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina [concentrações plasmáticas materna no momento da extração fetal de 11, 9, 7 e 3 ng/mL, respectivamente para os enantiômeros (S)-(+)-fluoxetina, (R)-(-)-fluoxetina, (S)-(+)-norfluoxetina e (R)-(-)-norfluoxetina] não altera as razões de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna e as razões enantioméricas R-(+)/S-(-) nos compartimentos materno e fetal. No modelo ex vivo, a transferência placentária da fexofenadina é lenta e limitada com razões de concentrações reservatório ii fetal/reservatório materno de aproximadamente 0,18 para ambos os enantiômeros. As razões enantioméricas R-(+)/S-(-) de aproximadamente 1,0 nos compartimentos materno e fetal confirmam que a P-gp placentária não discrimina entre os enantiômeros da fexofenadina. As concentrações clinicamente relevantes de 50 ng de cada enantiômero da fluoxetina/mL não alteram as razões de concentrações reservatório fetal/reservatório materno, a velocidade de transferência placentária e as razões enantioméricas R-(+)/S-(-) nos compartimentos materno e fetal. As razões de concentrações dos enantiômeros da fexofenadina reservatório fetal/reservatório materno obtidas no modelo ex vivo são similares às razões obtidas no estudo clínico de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna, inferindo a validade do modelo ex vivo de predição da transferência placentária in vivo dos enantiômeros da fexofenadina. Concluindo, os estudos in vivo e ex vivo permitem inferir que a fluoxetina inibe de maneira enantiosseletiva a P-gp intestinal e não inibe a P-gp placentária em concentrações clinicamente relevantes / Drug-drug interaction on the intestinal and placental P-glycoprotein (P-gp) plays an important role in the kinetics disposition and placental transfer of drugs during pregnancy. Fexofenadine is an antihistamine drug for seasonal allergic rhinitis and chronic urticaria treatment during pregnancy and it is available as a racemic mixture. Taken together fexofenadine as a P-gp substrate and fluoxetine, antidepressant drug used in pregnancy, as a P-gp inhibitor, this study asses the effect of fluoxetine on the enantioselective kinetic disposition of fexofenadine in pregnant women at term and their relationships with in vivo and ex vivo transplacental transfer. The in vivo study investigated 16 parturients, 8 included in Control group and 8 included in Interaction group. All of parturients received 60 mg of racemic fexofenadine in a single oral dose, while Interaction group subjects were also given 40 mg of racemic fluoxetine in a single oral dose 3 h before fexofenadine administration. Serial blood and urine samples were collected for 48 h after fexofenadine administration. Maternal blood, venous and arterial umbilical cord blood, as well as placental intervillous space blood samples were simultaneously collected at delivery (2-3 h after fexofenadine administration). The transplacental pharmacokinetics of fexofenadine enantiomers was assayed in 4 placental lobule using ex vivo placental perfusion model. Fexofenadine enantiomers were determined in plasma, urine and placental perfusate samples by LC-MS/MS equipped with the chiral column Chirobiotic® V. Pharmacokinetic parameters were determined using WinNonlin and statistical analyses were performed using R statistical software. Fexofenadine kinetics disposition is enantioselective in maternal plasma with higher AUC0-? values (423.20 vs. 267.67 ng×h/mL) and lower apparent volume of distribution values (621.37 vs. 889.83 L), apparent total clearance (66.20 vs. 105.05 L/h) and apparent renal clearance (5.25 vs. 8.78 L/h) for (R)-(+)-fexofenadine distomer. Fexofenadine placental transfer is limited, with umbilical vein/maternal vein plasma concentration ratios of approximately 0.16 for both enantiomers. R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios of approximately 1.7 in both maternal and fetal compartments indicate that placental P-gp might not have ability of fexofenadine\'s chiral discrimination. Single oral dose administration of 40 mg of racemic fluoxetine 3 h before fexofenadine administration increased AUC0-? values (376.09 vs. 267.67 ng×h/mL) and lowered both apparent total clearance values (74.37 vs. 105.05 L/h) and apparent renal clearance (3.50 vs. 8.78 L/h) only for (S)-(-)-fexofenadine eutomer, inferring intestinal P-gp enantioselective inhibition. Single oral dose administration of 40 mg of racemic fluoxetine 3 h before fexofenadine administration [maternal plasma concentrations at delivery of 11, 9, 7 and 3 ng/mL for (S)-(+)-fluoxetine, (R)-(-)-fluoxetine, (S)-(+)-norfluoxetine and (R)-(-)-norfluoxetine enantiomers, respectively] does not change either umbilical vein/maternal vein plasma concentration ratios or R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios in maternal and fetal compartments. In the ex vivo model, placental transfer of fexofenadine is slow and limited, presenting fetal/maternal reservoirs concentration ratios of approximately 0.18 for both enantiomers. R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios of approximately 1.0 on maternal and fetal compartments confirm placental P-gp does not have ability of fexofenadine\'s chiral discrimination. Clinically relevant concentrations of 50 ng of each fluoxetine enantiomer/mL neither alter fetal/maternal reservoirs concentration ratios, placental transfer rate nor R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios in maternal and fetal iv compartments. Fetal/maternal reservoirs concentration ratios of fexofenadine enantiomers obtained in the ex vivo model are similar to those obtained in the clinical study of umbilical vein/maternal vein plasma concentrations, implying the validity of ex vivo model to predict placental transfer of fexofenadine enantiomers in vivo. In conclusion, both in vivo and ex vivo studies allow us to infer that fluoxetine enantioselectively inhibits intestinal P-gp and yet does not inhibit placental P-gp at clinically relevant concentrations.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Interações medicamentosas envolvendo a glicoproteína-P (P-gp) intestinal e placentária são determinantes na disposição cinética e transferência placentária de medicamentos durante a gestação. A fexofenadina, fármaco anti-histamínico, está disponível na clínica como racemato com indicação de uso durante a gravidez para o tratamento da rinite alérgica sazonal e urticária crônica. Considerando a fexofenadina como um substrato da P-gp e a fluoxetina, fármaco antidepressivo indicado durante a gravidez, um inibidor da P-gp, o presente estudo investiga a influência da fluoxetina na disposição cinética enantiosseletiva da fexofenadina em parturientes e suas relações com a transferência placentária in vivo e ex vivo. No estudo in vivo foram investigadas 16 parturientes, sendo 8 incluídas no grupo Controle e 8 incluídas no grupo Interação. Todas as parturientes investigadas receberam dose única oral de 60mg de fexofenadina racêmica, enquanto as parturientes do grupo Interação receberam também dose única oral de 40mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina. As amostras seriadas de sangue e urina foram colhidas até 48 h após a administração da fexofenadina. Na resolução do parto (2-3 h após a administração da fexofenadina) foram coletadas simultaneamente amostras de sangue materno, venoso e arterial do cordão umbilical e do espaço interviloso placentário. No modelo ex vivo, a farmacocinética transplacentária dos enantiômeros da fexofenadina foi avaliada em 4 lóbulos de placenta humana. Os enantiômeros da fexofenadina foram determinados nas amostras de plasma, urina e solução de perfusão placentária por LC-MS/MS acoplado a coluna de fase estacionária quiral Chirobiotic® V. A análise farmacocinética foi realizada empregando o programa WinNonlin e os testes estatísticos foram realizados com o auxílio do programa R. A disposição cinética da fexofenadina é enantiosseletiva no plasma materno com maiores valores de AUC0-? (423,20 vs 267,67 ng×h/mL) e menores valores de volume de distribuição aparente (621,37 vs 889,83 L), clearance total aparente (66,20 vs 105,05 L/h) e clearance renal aparente (5,25 vs 8,78 L/h) para o distômero (R)-(+)-fexofenadina. A transferência placentária da fexofenadina é limitada com razões de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna de aproximadamente 0,16 para ambos os enantiômeros. As razões enantioméricas R-(+)/S-(-) de aproximadamente 1,7 nos compartimentos materno e fetal sugerem que a P-gp placentária não discrimina entre os enantiômeros da fexofenadina. A administração de dose única oral de 40 mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina aumentou os valores de AUC0-? (376,09 vs 267,67 ng×h/mL) e reduziu os valores de clearance total aparente (74,37 vs 105,05 L/h) e clearance renal aparente (3,50 vs 8,78 L/h) somente para o eutômero (S)-(-)-fexofenadina, inferindo inibição enantiosseletiva da P-gp intestinal. A administração de dose única oral de 40 mg de fluoxetina racêmica 3 h antes da administração da fexofenadina [concentrações plasmáticas materna no momento da extração fetal de 11, 9, 7 e 3 ng/mL, respectivamente para os enantiômeros (S)-(+)-fluoxetina, (R)-(-)-fluoxetina, (S)-(+)-norfluoxetina e (R)-(-)-norfluoxetina] não altera as razões de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna e as razões enantioméricas R-(+)/S-(-) nos compartimentos materno e fetal. No modelo ex vivo, a transferência placentária da fexofenadina é lenta e limitada com razões de concentrações reservatório ii fetal/reservatório materno de aproximadamente 0,18 para ambos os enantiômeros. As razões enantioméricas R-(+)/S-(-) de aproximadamente 1,0 nos compartimentos materno e fetal confirmam que a P-gp placentária não discrimina entre os enantiômeros da fexofenadina. As concentrações clinicamente relevantes de 50 ng de cada enantiômero da fluoxetina/mL não alteram as razões de concentrações reservatório fetal/reservatório materno, a velocidade de transferência placentária e as razões enantioméricas R-(+)/S-(-) nos compartimentos materno e fetal. As razões de concentrações dos enantiômeros da fexofenadina reservatório fetal/reservatório materno obtidas no modelo ex vivo são similares às razões obtidas no estudo clínico de concentrações plasmáticas veia umbilical/veia materna, inferindo a validade do modelo ex vivo de predição da transferência placentária in vivo dos enantiômeros da fexofenadina. Concluindo, os estudos in vivo e ex vivo permitem inferir que a fluoxetina inibe de maneira enantiosseletiva a P-gp intestinal e não inibe a P-gp placentária em concentrações clinicamente relevantes / Drug-drug interaction on the intestinal and placental P-glycoprotein (P-gp) plays an important role in the kinetics disposition and placental transfer of drugs during pregnancy. Fexofenadine is an antihistamine drug for seasonal allergic rhinitis and chronic urticaria treatment during pregnancy and it is available as a racemic mixture. Taken together fexofenadine as a P-gp substrate and fluoxetine, antidepressant drug used in pregnancy, as a P-gp inhibitor, this study asses the effect of fluoxetine on the enantioselective kinetic disposition of fexofenadine in pregnant women at term and their relationships with in vivo and ex vivo transplacental transfer. The in vivo study investigated 16 parturients, 8 included in Control group and 8 included in Interaction group. All of parturients received 60 mg of racemic fexofenadine in a single oral dose, while Interaction group subjects were also given 40 mg of racemic fluoxetine in a single oral dose 3 h before fexofenadine administration. Serial blood and urine samples were collected for 48 h after fexofenadine administration. Maternal blood, venous and arterial umbilical cord blood, as well as placental intervillous space blood samples were simultaneously collected at delivery (2-3 h after fexofenadine administration). The transplacental pharmacokinetics of fexofenadine enantiomers was assayed in 4 placental lobule using ex vivo placental perfusion model. Fexofenadine enantiomers were determined in plasma, urine and placental perfusate samples by LC-MS/MS equipped with the chiral column Chirobiotic® V. Pharmacokinetic parameters were determined using WinNonlin and statistical analyses were performed using R statistical software. Fexofenadine kinetics disposition is enantioselective in maternal plasma with higher AUC0-? values (423.20 vs. 267.67 ng×h/mL) and lower apparent volume of distribution values (621.37 vs. 889.83 L), apparent total clearance (66.20 vs. 105.05 L/h) and apparent renal clearance (5.25 vs. 8.78 L/h) for (R)-(+)-fexofenadine distomer. Fexofenadine placental transfer is limited, with umbilical vein/maternal vein plasma concentration ratios of approximately 0.16 for both enantiomers. R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios of approximately 1.7 in both maternal and fetal compartments indicate that placental P-gp might not have ability of fexofenadine\'s chiral discrimination. Single oral dose administration of 40 mg of racemic fluoxetine 3 h before fexofenadine administration increased AUC0-? values (376.09 vs. 267.67 ng×h/mL) and lowered both apparent total clearance values (74.37 vs. 105.05 L/h) and apparent renal clearance (3.50 vs. 8.78 L/h) only for (S)-(-)-fexofenadine eutomer, inferring intestinal P-gp enantioselective inhibition. Single oral dose administration of 40 mg of racemic fluoxetine 3 h before fexofenadine administration [maternal plasma concentrations at delivery of 11, 9, 7 and 3 ng/mL for (S)-(+)-fluoxetine, (R)-(-)-fluoxetine, (S)-(+)-norfluoxetine and (R)-(-)-norfluoxetine enantiomers, respectively] does not change either umbilical vein/maternal vein plasma concentration ratios or R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios in maternal and fetal compartments. In the ex vivo model, placental transfer of fexofenadine is slow and limited, presenting fetal/maternal reservoirs concentration ratios of approximately 0.18 for both enantiomers. R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios of approximately 1.0 on maternal and fetal compartments confirm placental P-gp does not have ability of fexofenadine\'s chiral discrimination. Clinically relevant concentrations of 50 ng of each fluoxetine enantiomer/mL neither alter fetal/maternal reservoirs concentration ratios, placental transfer rate nor R-(+)/S-(-) enantiomeric ratios in maternal and fetal iv compartments. Fetal/maternal reservoirs concentration ratios of fexofenadine enantiomers obtained in the ex vivo model are similar to those obtained in the clinical study of umbilical vein/maternal vein plasma concentrations, implying the validity of ex vivo model to predict placental transfer of fexofenadine enantiomers in vivo. In conclusion, both in vivo and ex vivo studies allow us to infer that fluoxetine enantioselectively inhibits intestinal P-gp and yet does not inhibit placental P-gp at clinically relevant concentrations.