In my thesis I concentrated on an analysis of biological samples of 60 dogs, which manifested epilepsy. The aim was to find out the relation between genotype of the selected locus and the occurrence of epilepsy. Based on the results of the analysis, I assessed, whether there is a demonstrable relation between the occurrence of epilepsy and genotype in a particular locus. According to the results, no influence of genotype on the age of first epileptic seizure was proved.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-30T20:39:16Z No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / FAPESB / O diagnóstico dos coccídeos Cryptosporidium e Isospora belli é realizado principalmente pela pesquisa de oocistos em esfregaços fecais corados. Entretanto, não existe uma padronização na rotina laboratorial para a identificação microscópica desses coccídeos. O diagnóstico da Cryptosporidium pode também ser realizado pela detecção de coproantígenos por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou pela amplificação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR), dispensando a identificação morfológica dos oocistos. Além disso, a análise do polimorfismo genético de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) pode ser utilizada na caracterização das espécies de Cryptosporidium, permitindo um melhor entendimento da dinâmica da transmissão deste parasito. Os objetivos deste trabalho foram: (1) comparar as técnicas de concentração de formol-acetato de etila (FE) e sedimentação por centrifugação (SC), bem como as técnicas de coloração de Ziehl-Neelsen modificado (ZN), auramina (AR) e safranina (SF) na detecção de oocistos de Cryptosporidium e Isospora belli em amostras fecais; (2) comparar a microscopia com a pesquisa de coproantígeno para o diagnóstico de Cryptosporidium e avaliar os resultados discordantes utilizando a PCR e (3) caracterizar as espécies de Cryptosporidium de amostras fecais humanas, através da PCR-RFLP. Para comparação entre os métodos de concentração de oocistos, FE e SC, e as técnicas de coloração, ZN, AR e SF, foram utilizadas amostras fecais positivas para Cryptosporidium (n=27) e I. belli (n=15), conservadas em formalina a 10%. Os métodos foram avaliados quanto ao número de oocistos detectados e a qualidade microscópica dos esfregaços. Para comparação entre o método de ZN e ELISA para o diagnóstico de Cryptosporidium foram examinadas amostras fecais de 626 crianças de diferentes grupos. Posteriormente, todas as amostras positivas para Cryptosporidium obtidas no estudo, juntamente com outros isolados disponíveis no laboratório, foram submetidos à extração de DNA e análise por Nested-PCR/RFLP dos genes COWP e 18S rRNA, para determinação das espécies de Crptosporidium. Os métodos SC e ZN identificaram mais oocistos de ambos parasitos do que os demais métodos avaliados (p<0,05). Houve perda de oocistos no anel de detritos gordurosos no FE em praticamente todas as amostras de Cryptosporidium e I. belli. Por outro lado, os métodos FE e AR apresentaram menos artefatos nos esfregaços comparados aos demais, sendo classificados com qualidade microscópica superior. A frequência de Cryptosporidium nas crianças foi de 2,6% (16/626), sendo maior no grupo com doença diarreica, enfatizando a importância deste coccídeo como agente etiológico da diarreia infantil. A sensibilidade e especificidade do ELISA foram de 85,7% e 99,7%, respectivamente. A eficiência da amplificação do DNA de Cryptosporidium foi de 92% (23/25), considerando os resultados dos dois genes analisados. As espécies do parasito identificadas foram C. hominis (78,3%), C. felis (8,7%), C. parvum (4,3%) e mistura C. felis + C. hominis (8,7%). Esses dados são os primeiros de genotipagem de Cryptosporidium de indivíduos de Salvador, demonstrando a predominância de C. hominis nas infecções, e a elevada frequência de C. felis, sugerindo um provável papel de gatos na transmissão do parasito aos humanos em nosso meio. / The diagnosis of coccidia Isospora belli and Cryptosporidium is usually accomplished by identification of oocysts in stained fecal smears. However, there is a lack of standardization in the routine laboratory for microscopic identification of these coccidia. The diagnosis of Cryptosporidium can also be done by detecting coproantigens using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or by parasite DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR), eliminating the need of morphological identification of oocysts. Furthermore, the analysis of restriction fragment length polymorphism of amplified DNA (RFLP-PCR) can be used to characterize the species of Cryptosporidium, allowing a better understanding of the transmission dynamics of the parasite. The objectives of this study were: (1) to compare the techniques of concentration of formalin-ethyl acetate (FE) and sedimentation by centrifugation (SC), as well as the techniques of modified Ziehl-Neelsen (ZN), auramin (AR) and safranin (SF) in the detection of Cryptosporidium and Isospora belli in stool samples, (2) to compare the microscopy with coproantigen detection for the diagnosis of Cryptosporidium and evaluate discordant results using PCR and (3) to characterize the species Cryptosporidium in human fecal samples by PCR-RFLP. To compare the methods for concentration, FE and SC, and staining of oocysts, ZN, AR and SF, there were used positive fecal samples for Cryptosporidium (n = 27) and I. belli (n = 15), preserved in 10% formalin. The methods were evaluated according the numbers of oocysts detected and the microscopic quality of smears. For comparison between ELISA and ZN for the diagnosis of Cryptosporidium in faecal samples, there were examined 626 stool samples from children of different groups. Subsequently, all positive samples for Cryptosporidium obtained in the study, along with other isolates available in the laboratory, were subjected to DNA extraction and analysis by Nested-PCR/RFLP of the COWP and 18S rRNA genes to determine the species of Crptosporidium. The SC and ZN methods identified more oocysts of both parasites than other methods tested (p <0.05). The loss of oocysts in the fatty debris layer of FE method was observed in all Cryptosporidium and I. belli samples. Moreover, the methods of FE and AR had fewer artifacts in smears compared to the others, being ranked with higher microscopic quality. The frequency of Cryptosporidium in children was 2.6% (16/626), being higher in patients with diarrheic disease, emphasizing the importance of this protozoan as etiologic agent of childhood diarrhea. The sensitivity and specificity of ELISA were 85.7% and 99.7%, respectively. The efficiency of amplification of Cryptosporidium DNA was 92% (23/25), considering the results of the two genes. The species of the parasite identified were C. hominis (78.3%), C. felis (8.7%), C. parvum (4.3%) and a mixture of C. felis + C. hominis (8.7%). To our knowledgment, these data represent the first genotyping study of Cryptosporidium from individuals of Salvador, demonstrating the dominance of C. hominis infection and the high frequency of C. felis, suggesting a potential role of cats in the transmission of the parasite to humans in our area.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T13:25:42Z No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T13:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. / Leishmaniasis is zoonosis caused by parasite protozoa belonging to the genus Leishmania, which comprises about 30 species, and of these about 20 are responsible for causing human diseases. Leishmaniasis is characterized by considerable clinical pleomorphism and epidemiological variability. Diagnosis of Leishmania infection associated with the identification of the causative species is important for prognosis, definition of appropriate treatment schemes and epidemiological surveillance of the disease. In this context, PCR-based methods have been the most investigated and therefore many methods have been described, although there are still limitations in terms of validation and ability to discriminate between different Leishmania species. In Brazil there are at least seven species associated with human cutaneous Leishmaniasis (CL) and one species associated with visceral Leishmaniasis. The main goal of this study was to establish a methodology presenting both good sensitivity and capacity to identify the causative etiologic agent of the infection at species level. To this end, this study employed different methodologies based on PCR already used in several studies focusing on the molecular diagnosis of Leishmaniasis: kDNA PCR, ITS1 PCR and g6p PCR. The limit of detection, sensitivity in the face of clinical samples obtained from patients diagnosed with CL and the ability of these methodologies to discriminate between species related to human CL in Brazil were evaluated. Furthermore, considering previous results from our group showing that regions of the hsp70 gene could be used to achieve this goal, we developed PCR-based methodologies targeting fragments that correspond to different hsp70 gene regions, with sizes ranging from the 230pb to 390pb. Considering the four regions that were analyzed, we chose one (here named as hsp70C PCR) for having presenting the best detection limit of Leishmania DNA and the capacity of discriminating human pathogens Leishmania species that circulate in Brazil, when reference strains were analyzed by PCR RFLP hsp70C. The sensitivity of hsp70C PCR using DNA extracted from tissue collected from patients diagnosed with CL compared with the other methods mentioned above. In addition, the ability of hsp70C PCR-RFLP to identify Leishmania species has been validated using a panel of 70 Leishmania strains, representing different species and geographic regions aditionaly clinical material was also analyzed. The results suggest that kDNA PCR is a very sensitive method and therefore suitable for the molecular diagnosis of Leishmaniasis, but does not allow the identification of the species envolved in the infection. The ITS1 PCR is quite sensitive for the diagnosis of Leishmaniasis, but the non ability to identify the sympatric species like L.guyanensis and L.braziliensis, by PCR-RFLP limits its use in some in the South America. Finally, PCR-RFLP hsp70C, combines good sensitivity to detect Leishmania DNA extracted from clinical material and the ability to identify all Leishmania species that circulate in Brazil, being particularly useful in areas where Leishmania species are simpatric.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-07-07T20:06:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ João Antônio Miranda Souza.pdf: 2240651 bytes, checksum: 74599c9ddde7f9d862894d9a27be25e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-07T20:06:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ João Antônio Miranda Souza.pdf: 2240651 bytes, checksum: 74599c9ddde7f9d862894d9a27be25e0 (MD5) / CAPES / Cryptococcus é uma levedura zoonótica, frequentemente associada a excretas de pombos e seu isolamento já é relatado em todo o mundo. Trata-se de uma levedura encapsulada, de forma globosa ou ovalada, que apresenta acentuado tropismo pelo sistema nervoso central. O principal problema é que o fungo permanece viável em excretas secas dessas aves por um longo período, tornando-se um reservatório de partículas infectantes passíveis de serem inaladas. O trabalho teve como objetivo caracterizar a variedade fenotípica e genética de Cryptococcus spp. ambientais da cidade de Salvador, Bahia. Para a execução desse estudo, 200 amostras de excre-mentos secos de pombos foram coletadas no solo entre novembro 2011 e fevereiro de 2012, em praças públicas, centro de distribuição de alimentos e no Porto da cida-de Salvador, Bahia. Foram adicionados 4mL de solução salina esterilizada, acresci-da de cloranfenicol, para cada 1g de excreta. A mistura foi submetida à agitação em vortex por 3 minutos, e mantida em repouso por 60 minutos e, em seguida, diluições foram feitas. Foram aspirados 0,1 mL do sobrenadante e semeados com alça de Drigalski, de cada diluição, em placas de ASD contendo cloranfenicol. As placas fo-ram incubadas em estufa de demanda de oxigênio a 28oC por até 21 dias. Colônias sugestivas foram repicadas em caldo uréia e analisadas com tinta da China para pesquisa de cápsula e micromorfológica com coloração de Gram. Após a identifica-ção do gênero, as leveduras foram identificadas bioquimicamente por auxanograma, zimograma, crescimento a 37ºC e repicadas em ágar Níger (Guizotia abyssinica), e CGB. Foram isoladas 37 leveduras, das quais 22 são da espécie C. neoformans, 4 de C. gattii, 5 de C. albidus, 3 de C. uniguttulatus e 3 da espécie C. laurentii. A de-terminação dos genótipos foi realizada utilizando a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 e foram verificados os perfis moleculares VNI (53,8%), VNIII (11,5%), VNIV (19,2%), VGII (7,7%), VGIII (3,8%) e VGIV (3,8%). A positividade para Cryptococcus nas amostras encontradas nos locais de estudo, associado ao grande número de pombos, apontam para a existência de riscos ambiental que devem servir de alerta aos órgãos de vigilância sanitária em Salvador. A identificação de espécies como C. gattii, C. albidus, C. uniguttulatus e C. laurentii em excretas de pombos evidencia a importância de novos estudos epidemiológicos para traçar os perfis de espécies de Cryptococcus que podem ser detectados de fontes ambientais em nossa cidade.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-28Bitstream added on 2014-06-13T18:43:16Z : No. of bitstreams: 1 marchesin_src_dr_sjrp.pdf: 719824 bytes, checksum: 27f6c7b9b1235bdfcec78f2741f543a0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A proposta do presente trabalho foi analisar as relações de proximidade genética e evolutiva entre espécies de Chiroptera, a partir da utilização da técnica PCR-RFLP para a obtenção de dados moleculares para os genes mitocondrial 12/16S e nuclear RAG2. A variabilidade detectada no presente estudo para as diferentes espécies é extremamente importante e poderá orientar ou subsidiar estudos com diferentes finalidades. A complexidade dos táxons de Chiroptera observada em outras análises, como citogenética e morfológica também foi revelada pela análise de RFLP, reforçando a importância dessa metodologia nos estudos evolutivos do grupo. / The aim of this study was to assess the relationships of genetic and evolutive proximity among Chiroptera species, through the obtention of molecular data through mitochondrial (12/16S) and nuclear (RAG2) genes by PCR-RFLP technique. The variability detected by this study to the different species is extremely important and can direct or subsidize studies with different purposes. The complexity of Chiroptera taxa observed in cytogenetic and morphologic analyses was also revealed by the RFLP technique, reinforcing the importance of this methodology in evolutive studies of the group.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-01T17:47:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanderlei Alves Cardoso - 2016.pdf: 2005513 bytes, checksum: f02b1c68047a6e30b76b4cd7e996de8d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-05T13:05:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanderlei Alves Cardoso - 2016.pdf: 2005513 bytes, checksum: f02b1c68047a6e30b76b4cd7e996de8d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T13:05:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanderlei Alves Cardoso - 2016.pdf: 2005513 bytes, checksum: f02b1c68047a6e30b76b4cd7e996de8d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / There are several factors that may affect the milk yield in cattle, among which the environmental characteristics and the genetic profile are the most important. The use of tools for genetic evaluation of animals, in particular the identification of SNPs, which are able to interfere with the production capacity, is being widely studied and used in animal production. In this sense, the objective of this study was to investigate the distribution of polymorphic variants of the promoter region and éxon8 in gene of growth hormone receptor (GHR) in Holstein cows in milk. They used data from lactations and milk composition in the first and second lactation of 106 cows in the municipality of Cristalina, Goiás. The blood samples were collected and the genomic material was purified (DNA). The genotypes were analyzed by PCR-FRLP technique using the AluI enzyme in the promoter region and Sspl to the exon8 of the GHR gene, respectively. For the data analysis of lactation and milk composition was performed analyses of varyance and Tukey test. Allelic frequencies of 47.64% were observed for AluI (-) and 52.36% for AluI (+) for the polymorphism of the promoter region, 49.53% for Ssp (-) and 50.47% for Ssp (+ ) for the polymorphism of exon8 of the gene. As to the genotypic frequencies, the promoter region had 12.26%, 70.76% and 16.98% for AluI genotypes (- / -), AluI (+/-) and AluI (+ / +) respectively. While the region of exon8 presented frequencies of 7.55%, 83.96% and 8.49% for genotypes Ssp (- / -), SspI (+/-), and SspI (+ / +) respectively. No statistically significant differences were found (P> 0.05) for the production and composition of milk on the effects of polymorphisms of the promoter region (AluI) and exon 8 (SspI) of the GHR gene. The composition EST and ESD were higher for SspI genotypes (- / -), but with significance level P = 0.06 and P = 0.05 respectively for EST and ESD. The interaction between the two polymorphisms and their effects on milk production and composition, no statistically significant differences were observed (P> 0.05). / Existem vários fatores que podem interferir na produção de leite em bovinos, entre os quais, as características ambientais e o perfil genético são os mais importantes. O uso de ferramentas para avaliação genética dos animais em especial a identificação de SNPs, os quais são capazes de interferir na capacidade produtiva, está sendo amplamente estudado e utilizado na produção animal. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi verificar a distribuição das variantes polimórficas da região promotora e do éxon 8 no gene do Receptor do Hormônio do Crescimento (GHR) em vacas da raça Holandesa em lactação. Foram utilizados dados das lactações e composição do leite na primeira e segunda lactação de 106 vacas do município de Cristalina, Goiás. As amostras de sangue periférico foram coletadas e o material genômico foi purificado (DNA). Os genótipos foram analisados pela técnica de PCR-FRLP com o uso da enzima AluI na região promotora e SspI para o éxon 8 do gene do GHR, respectivamente. Para a análise dos dados das lactações e composição do leite foi realizada análise de variância e teste de tukey. Foram observadas frequências alélicas de 47,64% para AluI(-) e 52,36% para AluI(+), para o polimorfismo da região promotora, 49,53% para SspI(-) e 50,47% para SspI(+) para o polimorfismo do éxon 8 do gene. Quanto as frequências genotípicas, a região promotora apresentou 12,26%, 70,76% e 16,98% para os genótipos AluI(-/-), AluI(+/-) e AluI(+/+) respectivamente. Enquanto a região do éxon 8 apresentou frequências de 7,55%, 83,96% e 8,49% para os genótipos SspI(-/-),SspI(+/-) e SspI(+/+) respectivamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (P>0,05) para produção e composição do leite sobre o efeitos dos polimorfismos da região promotora (AluI) e éxon 8 (SspI) do gene do GHR. A composição em EST e ESD se mostraram maiores para os genótipos SspI(-/-) porem com níveis de significância P=0,06 e P=0,05 respectivamente para EST e ESD. Quanto a interação entre os dois polimorfismos e seus efeitos sobre a produção e composição do leite, não foram observadas diferenças estatisticamente significativa (P>0,05).

Estudou-se Microsporum gypseum de diferentes fontes regiões geográficas do Brasil.Os fungos foram isolados do solo, de animais e obtidos em coleções de cultura. Em 692 amostras de solo e a taxa de recuperação foi de 19,2%. A atividade queratinolítica e elastinolítica foi avaliada quantitativamente em 138 amostras de M. gypseum. A biotipagem molecular foi realizado através da técnica de PCR-RFLP com a enzima MvaI. O seqüenciamento da região ITS1 do rDNA foi realizado em amostras representativas. M. gypseum de amostras clínicas e do solo mostraram diferenças quantitativas significantes na expressão das enzimas. A PCR-RFLP para a região ITS1 não mostrou diferença. Pelo seqüenciamento foram obtidas duas espécies sexuadas (A. gypseum e A. incurvatum). As atividades enzimáticas sugerem um importante papel na patogenicidade e uma provável adaptação desta espécie de fungo ao parasitismo animal. A análise dos resultados pode auxiliar a identificação e o conhecimento de mecanismos de virulência destes fungos. / Microsporum gypseum from different geographical sources and regions of Brazil were studied. The fungi were isolated from the soil, animals and obtained in collections of culture. In 692 samples of soil, the recovery rate was 19.2%. The keratinolytic and elastinolytic activities were quantitatively performed on 138 samples of M. gypseum. The molecular biotyping was carried out by the technique of PCR-RFLP with the enzyme MvaI. The sequencing of the region ITS1 rDNA was carried out on representative samples. Samples of M. gypseum from clinical isolates and from soil showed significant quantitative differences in the expression of enzymes. The PCR-RFLP for the ITS1 region showed no difference. For the sequencing was obtained two sexual species (A. gypseum and A. incurvatum). The enzyme activities suggest an important role in pathogenicity and a likely adjustment of this kind of parasitic fungus to feed. The results may help the identification and knowledge of mechanisms of virulence of these fungi.

[EN] Acetic acid bacteria (AAB) belong to the Acetobacteriaceae family, within the ¿-Proteobacteria class. These Gram-negative elliptical or cylindrical microorganisms occur in isolation, in pairs or in chains. They have polar flagellar or peritrichous motility. They are non-spore forming, cathalase positive and oxidase negative. They have an obligate aerobic metabolism, with oxygen as the terminal electron acceptor. Currently, the Acetobactereaceae family includes 19 genera and 72 species. Sugar and alcohol oxidising ability result in an accumulation of organic acids as final products, which is widely used in the food industry to produce vinegar from wine and fruits. The objective of this thesis was to isolate and identify AAB in blueberry and citrus epiphyt flora from plants grown in the Salto Grande region (Entre Ríos, Argentina) in order to detect the most suitable bacteria for biotechnological processes such as vinegar. 36 AAB were isolated from these fruits using enrichment techniques and plate isolation. Enrichment broths containing ethanol and acetic acid enabled the maximum recovery of AAB due to the fact that these components promote their growth. Fermented juice yielded a larger number of AAB compared to fresh fruit or peel, due to ethanol occurrence as it is an alcohol-resistant microorganisms selecting agent. Biochemical tests allowed bacteria differentiation at genus level. Six were identified: 13 bacteria isolates were identified as Acetobacter, 5 as Gluconobacter, 7 as Asaia, 5 as Acidomonas, 1 as Gluconacetobacter and 5 as Saccharibacter. Subsequently, those bacteria (Acetobacter, Gluconobacter and Gluconacetobacter genera) that could be used for the development of a suitable starter culture for the bio-oxidation of musts alcoholics obtained from these fruits, in order to obtain vinegars, were identified to specie level. Molecular techniques, such as RFLP-PCR of the 16S rDNA and RFLP-PCR of the 16S-23S rDNA intergenic spacer, were utilised. The former enabled the identification of the 16 AAB under study. C7, C8, A80, A160 and A180 isolates were identified as G. frateurii, C1, C2, C3, C4, C5, C6, A70 and A210 isolates as A. pasteurianus, A50 and A140 isolates as A. tropicalis and C9 isolate as A. syzygii. 16S-23S PCR-RFLP technique validated identifications performed using 16S; however, C1 showed a different restriction pattern from the first identification. Genus 16S partial sequencing solved this discrepancy. Growth dynamics and acetic acid production capacity were studied in the isolates in order to determine the most suitable ones to acetify fruits musts. Growth was assessed in different ethanol and acetic acid concentrations as high cell count values (109 cells/mL) are essential for the inoculum to start vinegar production, in order to achieve a short lag phase and therefore reduce process times. Three ethanol concentrations were assayed (4%, 6% and 8%) to study acetic acid production capacity. Results showed that cultures identified as A. pasteurianus (A210 and C1), A. syzygii (C9) and G. frateurii (A80) could be used as inoculum to produce vinegars, due to their high acetic acid production capacity when ethanol concentration values are 4% and 6% v/v. Finally, the most suitable culture preservation method was determined to maintain purity and activity through time. AAB may be lyophilised with 20% w/v mannitol or 10% w/v dried milk since these lyoprotective agents demonstrated they are effective at maintaining cells viability. Nevertheless, these agents did not allow acetic acid production from ethanol. This study has demonstrated that glycerol (20% v/v) and mannitol (20% w/v) can be used as cryoprotective agents during freezing since they not only protect AAB and maintain bacteria viability but also help to preserve the functional properties, such as its ability to grow and produce acetic acid in alcoholic musts. / [ES] Las bacterias del ácido acético (BAA) pertenecen a la familia Acetobacteriaceae; están incluidas en el grupo de las ¿-Proteobacterias. Son microorganismos Gram-negativos, de forma elipsoidal o cilíndrica que pueden encontrarse aislados, en parejas o formando cadenas. Son móviles por flagelación polar o perítrica. Presentan actividad catalasa positiva, oxidasa negativa y no forman endosporas. Poseen metabolismo aeróbico estricto, con el oxígeno como aceptor final de electrones. Actualmente, la familia Acetobactereaceae está compuesta por 19 géneros y 72 especies. Es conocida la habilidad de las BAA para oxidar azúcares y alcoholes, obteniéndose como producto final una acumulación de ácidos orgánicos, capacidad que es aprovechada en la industria de alimentos para la elaboración de vinagres de vinos y de frutas. La presente Tesis Doctoral planteó el aislamiento e identificación de BAA a partir de la flora epifítica de arándanos y frutas cítricas cultivadas en la región de Salto Grande (Entre Ríos, Argentina), con el fin de encontrar las más adecuadas para ser utilizadas en procesos biotecnológicos, tales como el vinagre. Se aislaron 36 BAA a partir de estas frutas mediante técnicas de enriquecimiento y aislamiento en placas. Los caldos de enriquecimiento que contenían etanol y ácido acético permitieron recuperar el mayor número de BAA, ya que dichos componentes favorecen el crecimiento de las mismas. Del jugo fermentado de las frutas cítricas se obtuvo un mayor número de BAA respecto del jugo fresco o la cáscara, debido a la presencia de etanol, el que actuó como agente de selección para estos microorganismos alcohol-resistentes. Las pruebas bioquímicas permitieron diferenciar las bacterias a nivel de género. Se reconocieron 6 géneros: 13 aislados fueron identificados como Acetobacter, 5 como Gluconobacter, 7 como Asaia, 5 como Acidomonas, 1 como Gluconacetobacter y 5 como Saccharibacter. Posteriormente, se identificaron a nivel de especie aquellas bacterias (géneros Acetobacter, Gluconobacter y Gluconacetobacter) que podrían ser utilizadas para el desarrollo de un cultivo iniciador apto para la bioxidación de mostos alcohólicos obtenidos a partir de estos frutos, con el fin de obtener vinagres. Para esto, se emplearon técnicas moleculares, tales como PCR-RFLP del gen 16S y PCR-RFLP del espaciador intergénico 16S-23S. Con la primera, se identificaron las 16 BAA estudiadas. Los aislados C7, C8, A80, A160 y A180 fueron identificados como G. frateurii, los aislados C1, C2, C3, C4, C5, C6, A70 y A210 como A. pasteurianus, los aislados A50 y A140 como A. tropicalis y el aislado C9 como A. syzygii. Se estudió la dinámica de crecimiento y la habilidad de las BAA aisladas para producir ácido acético, con el fin de elegir las más aptas para la acetificación de mostos de frutas. El crecimiento se evaluó con distintas concentraciones de etanol y ácido acético. En cuanto a la habilidad para producir ácido acético, se ensayaron tres concentraciones de etanol, 4%, 6% y 8%, evidenciándose que los cultivos, identificados como A. pasteurianus (A210 y C1) A. syzygii (C9) y G. frateurii (A80) podrían ser utilizados como inóculo para la elaboración de vinagres, por poseer una alta capacidad de producción de ácido acético cuando la concentración de etanol es de 4% y 6% v/v. Las BAA podrían ser liofilizadas con manitol 20% p/v o leche en polvo 10% p/v, ya que estos lioprotectores demostraron ser efectivos para mantener la viabilidad de las células. Sin embargo, éstos no permitieron mantener la producción de ácido acético a partir de etanol. El presente estudio demostró que el glicerol (20% v/v) y el manitol (20% p/v) pueden ser utilizados como crioprotectores en el proceso de congelación, ya que no sólo protegen a las BAA, manteniendo su viabilidad, sino que también ayudan a conservar las propiedades funcionales de las mismas, tales como su capacidad de crecer y producir ácido / [CAT] Els bacteris de l'àcid acètic (BAA) pentanyen a la família Acetobacteriaceae i estan incloses en el grup dels ¿-Proteobacteris. Són microorganismes gram-negatius, de forma elipsoidal p cilíndrica que pot trobar-se aïllada, emparellada o formant cadenes. Són mòbils per flagel¿lació polar o perítrica. Presenten activitat catalasa positiva, oxidasa negativa i no formen endospores. Posseeixen metabolisme aeròbic estricte, amb l'oxigen com aceptor final d'electrons. Actualment, la familia Acetobactereaceae està composta per 19 gèneres i 72 espècies. Es coneguda l'habilitat dels BAA per a oxidar sucres i alcohols, obtenint-se com a producte final una acumulació d'àcids orgànics, capacitat aprofitada en la industria dels aliments per a l'elaboració de vinagres de vins i fruites. La present Tesi Doctoral planteja l'aïllament i identificació dels BAA a partir de la flora epifítica dels nabius i cítrics cultivats en la regió de Salto Grande (Entre Ríos, Argentina), amb la finalitat de trobar les més adequades per ser utilitzades en processos biotecnològics, tals com el vinagre. S'aïllaren 36 BAA a partir d'aquestes frutes mitjançant tècniques d'enriquiment i aïllament en plaques. Els brous d'enriquiment que contenien E i AA permeteren recuperar el major numero de BAA, ja que tals components afavorien el seu creixement. Del suc fermentat dels citrics es va obtenir un major nombre de BAA respecte del suc fresc o la pell, degut a la presència de E, que actuà com agent de selecció per a aquestos microorganismes alcohol-resistents. Es reconegueren 6 gèneres: 13 aïllats foren identificats com Acetobacter, 5 com Gluconobacter, 7 com Asaia, 5 com Acidomonas, 1 com Gluconacetobacter i 5 com Saccharibacter. Posteriorment, s'identificaren a nivell d'espècie aquells bacteris que podríen ser utilitzats per al desenvolupament d'un cultiu indicadorstarter apte per a la biooxidació de mostos alcohòlics obtinguts a partir d'aquestos fruïts, amb la finalitat d'obtenir vinagres de fruites (gèneres Acetobacter, Gluconobacter i Gluconacetobacter). Amb aquesta finalitat, s'utilitzaren tècniques moleculars, com PCR-RFLP del gen 16S i PCR-RFLP de l'espaciador intergènic 16S-23S. Amb la primera, s'identificaren els 16 BAA estudiats. La tècnica PCR-RFLP del 16S-23S va confirmar les identificacions realitzades amb el 16S, tanmateix C1 va mostrar un patró de restricció que no es corresponia amb la primera identificació realitzada. Aquesta discrepància fou resolta per la seqüenciació parcial de gen 16S, que va confirmar el resultats obtinguts per PCR-RFLP. Els aïllats C7, C8, A80, A160 i A180 foren identificats com G. Frateurii, els aïllats C1, C2, C3, C4, C5, C6, A70 i A210 com A. pasteurianus,els aïllats A50 i A140 com A.tropicalis i l'aïllat C9 com A. syzygii. S'estudià la dinàmica de creixement i la habilitat per produirAA dels BAA aïllades, amb la finalitat de triar les més aptes per a l'acetificació de mostos de frutes. El creixement s'evaluà amb diferents concentracions de E i AA. Quan a l'habilitat per a produir AA, s'assajaren tres concentracions d'etanol, 4%, 6% i 8% v/v, evidencianse que els cultius , identificats com A. pasteurianus (A210 i C1) A. syzygii (C9) i G. frateurii (A80) podrien ser utilitzats com inòcul per a l'elaboració de vinagres, per poseïr una alta capacitat de producció de AA quan la concentraició de E és de 4% i 6% v/v. Els BAA podrien ser liofilitzats amb manitol 20% p/v o llet en pols 10% p/v, ja que aquestos lioprotectors demostraren ser efectius per a mantenir la viabilitat de les cèl¿lules. Tanmateix, aquestos no permeteren mantenir la producció de AA a partir de E. El present estudi va demostrar que el glicerol (20% v/v) i el manitol (20% p/v) poden ser utilitzats com crioprotectors en el procés de congelació, ja que no sols protegeixen els BAA, mantenint la seua viabilitat, sinò que també ajuda a conservar les seues propietats funcionals, tals com la se / Gerard, LM. (2015). Caracterización de bacterias del ácido acético destinadas a la producción de vinagres de frutas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/59401 / TESIS

This thesis is concerned with the identification of the yeasts belonging to Saccharomyces species, which is participating in the particular fermentation phases of the white wine. The rapidity that we are able to identify the yeast strains is the significant factor for appreciation the fermantation proces quality as well as final product quality – the quality of wine. The molecular biology method developing is gradually limiting the using of traditional identification methods mainly because of their time intensity. In this thesis was used molecular method PCR-RFLP as an implement to quick and accurate identification of particular strains of yeasts. The specific DNA section was amplified by the help of PCR and consequently amenabled to the restrict analysis. The restrict endonukleas fissiled DNA to fragments specified for the certain strain of yeast. The fragments were detected by horizontal electrophoresis. To compare the fragments with type yeast fragments made us possible to identify the trast strain and its taxonomy classification. The literature search contains the basic information about the yeasts and their using, the information about wine making as well as the PCR-RFLP method principle.

This thesis deals with identification of the wine yeasts by applying the PCR-RFLP method. The identification and characteristic of the yeasts has gone through substantial changes in recent years. There have been introduced new methods of taxonomic classifying based on the molecular methods, which are oriented to easy and fast identification. One of these methods is the PCR-RFLP method. The amplification of the 5•8S-ITS rDNA sequence by the polymerase chain reaction with use of the primers ITS1 and ITS4 leads to the amplification of the specific sequence of DNA. Such multiplied DNA is after repurifying by the ethanol and drying submitted to the restriction analysis. With use of the restriction endonuklases DNA is chopped into the specific segments typical for the particular genus. The chopped fragments can be separated in the electric field in the agarose gel and subsequently evaluated. In this thesis together 63 type yeasts were used. These yeasts were analysed by applying of the seven restriction endonuklases – HaeIII, HhaI, HinfI, HpaII, TaqI, AluI a MseI. The final image of type yeasts splitting was compared to the results of splitting of already identified wine yeasts and these yeasts were subsequently taxonomically classified. Evaluation of genetic similarity was conducted by program BioNumerics and as the results the dendrograms that were created with use of Jaccard‘s coefficients are obtained.