NG2 is a transmembrane glycoprotein mainly expressed in developing tissue, and often re-expressed in tumor cells. NG2 glycoprotein is an important regulator of cell migration and adhesion. Increased expression of NG2 enhances the metastatic potential of cancer cells. However, the molecular mechanisms of these processes are still not fully understood. An increasing number of evidences, in recent years, have shown that NG2 can be responsible for Rho/ROCK activation, which is essential for effective amoeboid invasiveness. In this thesis, we analysed the role of NG2 glycoprotein, especially the role of its PDZ- binding motif on amoeboid phenotype induction, and activation of Rho/ROCK signaling. Our results demonstrate the importance of the NG2 PDZ-binding motif on mesenchymal- amoeboid transition of cells in a 3D environment. Surprisingly, they show that the expression of both the NG2 cytoplasmatic domain and the truncated version, lacking the PDZ-binding motif, do not change the amount of Rho-GTP or the activation of the Rho/ROCK signaling pathway in 2D.

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire. / There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS / The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

Le « Computational protein design » ou CPD est la recherche des séquences d’acides aminés compatibles avec une structure protéique ciblée. L’objectif est de concevoir une fonction nouvelle et/ou d’ajouter un nouveau comportement. Le CPD est en développement dans de notre laboratoire depuis plusieurs années, avec le logiciel Proteus qui a plusieurs succès à son actif.Notre approche utilise un modèle énergétique basé sur la physique et s’appuie sur la différence d’énergie entre l’état plié et l’état déplié de la protéine. Au cours de cette thèse, nous avons enrichi Proteus sur plusieurs points, avec notamment l’ajout d’une méthode d’exploration Monte Carlo avec échange de répliques ou REMC. Nous avons comparé trois méthodes stochastiques pour l’exploration de l’espace de la séquence : le REMC, le Monte Carlo simple et une heuristique conçue pour le CPD, le «Multistart Steepest Descent » ou MSD. Ces comparaisons portent sur neuf protéines de trois familles de structures : SH2, SH3 et PDZ. En utilisant les techniques d’exploration ci-dessus, nous avons été en mesure d’identifier la conformation du minimum global d’énergie ou GMEC pour presque tous les tests dans lesquels jusqu’à 10 positions de la chaîne polypeptidique étaient libres de muter (les autres conservant leurs types natifs). Pour les tests avec 20 positions libres de muter, le GMEC a été identifié dans 2/3 des cas. Globalement, le REMC et le MSD donnent de très bonnes séquences en termes d’énergie, souvent identiques ou très proches du GMEC. Le MSD a obtenu les meilleurs résultats sur les tests à 30 positions mutables. Le REMC avec huit répliques et des paramètres optimisés a donné le plus souvent le meilleur résultat lorsque toutes les positions peuvent muter. De plus, comparé à une énumération exacte des séquences de faible énergie, le REMC fournit un échantillon de séquences de grande diversité.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons testé notre modèle pour la conception de domaines PDZ. Pour l’état plié,nous avons utilisé deux variantes d’un modèle de solvant GB. La première utilise une frontière diélectrique protéine/solvant effective moyenne ; la seconde, plus rigoureuse, utilise une frontière exacte qui fluctue le long de la trajectoire MC. Pour caractériser l’état déplié, nous utilisons un ensemble de potentiels chimiques d’acide aminé ou énergies de références. Ces énergies de références sont déterminées par maximisation d’une fonction de vraisemblance afin de reproduire les fréquences d’acides aminés des domaines PDZ naturels. Les séquences conçues par Proteus ont été comparées aux séquences naturelles. Nos séquences sont globalement similaires aux séquences Pfam, au sens des scoresBLOSUM40, avec des scores particulièrement élevés pour les résidus au cœur de la protéine. La variante de GB la plus rigoureuse donne toujours des séquences similaires à des homologues naturels modérément éloignés et l’outil de reconnaissance de plis Super family appliqué à ces séquences donne une reconnaissance parfaite. Nos séquences ont également été comparées à celles du logiciel Rosetta. La qualité, selon les mêmes critères que précédemment, est très comparable, mais les séquences Rosetta présentent moins de mutations que les séquences Proteus. / Computational Protein Design, or CPD is the search for the amino acid sequences compatible with a targeted protein structure. The goal is to design a new function and/or add a new behavior. CPD has been developed in our laboratory for several years, with the software Proteus which has several successes to its credit. Our approach uses a physics-based energy model, and relies on the energy difference between the folded and unfolded states of the protein. During this thesis, we enriched Proteus on several points, including the addition of a Monte Carlo exploration method with Replica Exchange or REMC. We compared extensively three stochastic methods for the exploration of sequence space: REMC, plain Monte Carlo and a heuristic designed for CPD: Multistart Steepest Descent or MSD.These comparisons concerned nine proteins from three structural families: SH2, SH3 and PDZ. Using the exploration techniques above, we were able to identify the Global Minimum EnergyConformation, or GMEC for nearly all the test cases where up to10 positions of the polypeptide chain were free to mutate (the others retaining their native types). For the tests where 20positions were free to mutate, the GMEC was identified in 2/3 of the cases. Overall, REMC and MSD give very good sequences in terms of energy, often identical or very close to the GMEC. MSDperformed best in the tests with 30 mutating positions. REMCwith eight replicas and optimized parameters often gave the best result when all positions could mutate. Moreover, compared to an exact enumeration of the low energy sequences, REMC provided a sample of sequences with a high sequence diversity.In the second part of this work, we tested our CPD model forPDZ domain design. For the folded state, we used two variants ofa GB solvent model. The first used a mean, effective protein/solvent dielectric boundary; the second one, more rigorous, used an exact boundary that flucutated over the MCtrajectory. To characterize the unfolded state, we used a set of amino acid chemical potentials or reference energies. These reference energies were determined by maximizing a likelihoodfunction so as to reproduce the amino acid frequencies in naturalPDZ domains. The sequences designed by Proteus were compared to the natural sequences. Our sequences are globally similar to the Pfam sequences, in the sense of the BLOSUM40scores, with especially high scores for the residues in the core ofthe protein. The more rigorous GB variant always gives sequences similar to moderately distant natural homologues and perfect recognition by the the Super family fold recognition tool.Our sequences were also compared to those produced by the Rosetta software. The quality, according to the same criteria as before, was very similar, but the Rosetta sequences exhibit fewer mutations than the Proteus sequences.

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