Made available in DSpace on 2014-06-12T16:27:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1171_1.pdf: 913704 bytes, checksum: 90c280549ba1b31711c87a10d5984238 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A instabilidade relacionada às proteínas, tanto estruturalmente quanto quimicamente, compromete a sua utilização em formulações como um agente terapêutico, isto se deve a um curto tempo de vida quando são submetidas a um estresse químico ou físico. Para melhorar a estabilidade de fármacos de origem protéica foi desenvolvida uma modificação química em aminoácidos e proteínas denominada peguilação. A caracterização termoanalítica de proteínas bioativas e seus produtos peguilados tem aplicação limitada na indústria farmacêutica em comparação com outras técnicas analíticas. O presente trabalho realizou estudos de caracterização térmica da forma natural e modificada por peguilação da albumina humana sérica (HSA). As técnicas térmicas envolvidas foram: Termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e calorimetria exploratória diferencial fotovisual (DSC fotovisual). Os estudos termogravimétricos dinâmicos comprovaram que as formas peguiladas da albumina humana sérica apresentaram uma melhor estabilidade térmica nas razões de aquecimento de 10 oC/min, 20 oC/min, 40 oC/min. As curvas calorimétricas obtidas na razão de aquecimento de 10 oC/min mostraram diferenças entre os produtos peguilados e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e exotérmicos. A preparação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) (82-85% de rendimento) ocorreu através de uma reação de substituição nucleofílica. A reação ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol Propionaldeído (75% rendimento) e o grupo alfa-amino do aminoácido livre da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo. Os intermediários peguilados foram caracterizados através de RMN1H e RMN13C

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

A enzima L-asparaginase (ASNase) de Escherichia coli é amplamente utilizada para tratar a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No entanto, a enzima nativa pode ativar o sistema imune do hospedeiro causando reações alérgicas. A forma peguilada da enzima (PEG-ASNase) não só reduz o efeito imunológico, mas também possui a vantagem de aumentar sua meia-vida plasmática devido à menor degradação por proteases. Não obstante, a conjugação de PEG à ASNase é de forma aleatória e resulta em elevado grau de polidispersão. Nesse trabalho, um protocolo de peguilação N-terminal sítio-específica para a enzima ASNase foi desenvolvido, empregando-se metoxi-polietilenoglicol carboximetil N-hidroxisuccinimidil ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Os parâmetros de reação investigados foram a força iônica do tampão, o pH e o tempo de reação para otimizar o rendimento e minimizar a polidispersão. Os resultados confirmaram a ocorrência da reação de peguilação e baixa polidispersão. A força iônica do tampão favoreceu a conjugação N-terminal em 100 mM de tampão fosfato salino (PBS). Também observamos que o aumento do pH e tempo de reação estão diretamente relacionados com o aumento de formas polipeguiladas. O maior rendimento de monoPEG-ASNase, 42%, correspondeu à condição de reação de pH 7,5, tempo de reação de 30 min e razão PEG:enzima de 25:1. A monoPEG-ASNase foi purificada em coluna aniônica forte com gradiente linear de NaCl até 170 mM e a fração monopeguilada foi eluída em NaCl 78 mM com grau de pureza de 70% (rendimento de 55%). A cromatografia de exclusão por tamanho aumentou a pureza da monoPEG-ASNase para 99% (rendimento final de 45%). A monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa, manteve sua atividade específica por 21 dias à 4ºC, enquanto que a enzima não peguilada (controle), 146 ± 6 kDa, teve uma queda de aproximadamente 52% na atividade específica em 7 dias à 4ºC. Um estudo de cinética enzimática foi realizado e obtivemos valores de kM semelhantes para as formas da enzima nativa e monopeguilada, 20 µM e 35 µM respectivamente. A monoPEG-ASNase apresentou-se mais resistente às proteases plasmáticas asparagina endopeptidase e catepsina B, por 84 h à 37 °C e apresentou ser citotóxica para células leucêmicas (MOLT-4 e Reh). Portanto, a peguilação N-terminal sítio-específica resultou em uma nova variante da ASNase que reteve grande parte de seu poder catalítico e pode ser considerada promissora para o emprego no tratamento da LLA. / The enzyme L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli is widely used to treat acute lymphoblastic leukemia (LLA). However, it can activate the host causing allergic reactions. Hence, the pegylated form of the enzyme (PEG-ASNase) not only reduces the immune effect but also increases plasma half-life. Nonetheless, the available PEG-ASNase is randomly pegylated and, consequently, with high degree of polydispersity. In this work we developed a site-specific N-terminus pegylation protocol for ASNase using methoxy-polyethylene glycol carboxymethyl N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Reaction parameters investigated were ionic strength, pH and reaction time to optimize yield and minimize polydispersity. Results confirmed pegylation and low polydispersity. Buffer ionic strength favored N-terminal conjugation at 100 mM phosphate buffer saline (PBS). Additionally, pH and reaction time were found to increase polyPEGylated species. The highest yield of monoPEG-ASNase, 42%, corresponded to reaction conditions of pH 7.5, reaction time of 30 min and PEG:ASNase ratio of 25:1. The monoPEG-ASNase was purified in a strong anionic column with NaCl linear gradient up to 170 mM and monoPEG-ASNase was eluted with 78 mM NaCl, 70% pure (55% yield). Size exclusion chromatography was further performed and increased monoPEG-ASNase purity to 99% (45% final yield). The monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa was stable for 21 days at 4ºC while nonpegylated ASNase (control), 146 ± 6 kDa, lost 52% of its activity within 7 days at 4ºC. Enzyme kinetics were studied and similar kM values were obtained for both native and monoPEG-ASNase, 20 µM and 35 µM respectively. The monoPEG-ASNase demonstrated to be resistant to the plasma proteases asparaginyl endopeptidase and cathepsin B, 84 h at 37 °C and also was cytotoxic to leukemic cells (MOLT-4 and Reh). Therefore, site-specific N-terminus pegylation of ASNase resulted in a novel enzyme variant with preserved catalytic activity and, therefore, promising for the treatment of LLA.

A enzima L-asparaginase (ASNase) de Escherichia coli é amplamente utilizada para tratar a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No entanto, a enzima nativa pode ativar o sistema imune do hospedeiro causando reações alérgicas. A forma peguilada da enzima (PEG-ASNase) não só reduz o efeito imunológico, mas também possui a vantagem de aumentar sua meia-vida plasmática devido à menor degradação por proteases. Não obstante, a conjugação de PEG à ASNase é de forma aleatória e resulta em elevado grau de polidispersão. Nesse trabalho, um protocolo de peguilação N-terminal sítio-específica para a enzima ASNase foi desenvolvido, empregando-se metoxi-polietilenoglicol carboximetil N-hidroxisuccinimidil ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Os parâmetros de reação investigados foram a força iônica do tampão, o pH e o tempo de reação para otimizar o rendimento e minimizar a polidispersão. Os resultados confirmaram a ocorrência da reação de peguilação e baixa polidispersão. A força iônica do tampão favoreceu a conjugação N-terminal em 100 mM de tampão fosfato salino (PBS). Também observamos que o aumento do pH e tempo de reação estão diretamente relacionados com o aumento de formas polipeguiladas. O maior rendimento de monoPEG-ASNase, 42%, correspondeu à condição de reação de pH 7,5, tempo de reação de 30 min e razão PEG:enzima de 25:1. A monoPEG-ASNase foi purificada em coluna aniônica forte com gradiente linear de NaCl até 170 mM e a fração monopeguilada foi eluída em NaCl 78 mM com grau de pureza de 70% (rendimento de 55%). A cromatografia de exclusão por tamanho aumentou a pureza da monoPEG-ASNase para 99% (rendimento final de 45%). A monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa, manteve sua atividade específica por 21 dias à 4ºC, enquanto que a enzima não peguilada (controle), 146 ± 6 kDa, teve uma queda de aproximadamente 52% na atividade específica em 7 dias à 4ºC. Um estudo de cinética enzimática foi realizado e obtivemos valores de kM semelhantes para as formas da enzima nativa e monopeguilada, 20 µM e 35 µM respectivamente. A monoPEG-ASNase apresentou-se mais resistente às proteases plasmáticas asparagina endopeptidase e catepsina B, por 84 h à 37 °C e apresentou ser citotóxica para células leucêmicas (MOLT-4 e Reh). Portanto, a peguilação N-terminal sítio-específica resultou em uma nova variante da ASNase que reteve grande parte de seu poder catalítico e pode ser considerada promissora para o emprego no tratamento da LLA. / The enzyme L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli is widely used to treat acute lymphoblastic leukemia (LLA). However, it can activate the host causing allergic reactions. Hence, the pegylated form of the enzyme (PEG-ASNase) not only reduces the immune effect but also increases plasma half-life. Nonetheless, the available PEG-ASNase is randomly pegylated and, consequently, with high degree of polydispersity. In this work we developed a site-specific N-terminus pegylation protocol for ASNase using methoxy-polyethylene glycol carboxymethyl N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Reaction parameters investigated were ionic strength, pH and reaction time to optimize yield and minimize polydispersity. Results confirmed pegylation and low polydispersity. Buffer ionic strength favored N-terminal conjugation at 100 mM phosphate buffer saline (PBS). Additionally, pH and reaction time were found to increase polyPEGylated species. The highest yield of monoPEG-ASNase, 42%, corresponded to reaction conditions of pH 7.5, reaction time of 30 min and PEG:ASNase ratio of 25:1. The monoPEG-ASNase was purified in a strong anionic column with NaCl linear gradient up to 170 mM and monoPEG-ASNase was eluted with 78 mM NaCl, 70% pure (55% yield). Size exclusion chromatography was further performed and increased monoPEG-ASNase purity to 99% (45% final yield). The monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa was stable for 21 days at 4ºC while nonpegylated ASNase (control), 146 ± 6 kDa, lost 52% of its activity within 7 days at 4ºC. Enzyme kinetics were studied and similar kM values were obtained for both native and monoPEG-ASNase, 20 µM and 35 µM respectively. The monoPEG-ASNase demonstrated to be resistant to the plasma proteases asparaginyl endopeptidase and cathepsin B, 84 h at 37 °C and also was cytotoxic to leukemic cells (MOLT-4 and Reh). Therefore, site-specific N-terminus pegylation of ASNase resulted in a novel enzyme variant with preserved catalytic activity and, therefore, promising for the treatment of LLA.

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins. / A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas.