Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:12:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / A estratégia de humanização de anticorpos tem sido eficiente para melhorar o uso clínico desses biofármacos. Porém, a manipulação da cadeia polipeptídica, eventualmente, leva a uma perda de afinidade, reduzindo sua eficácia. Este estudo é uma continuação dos testes necessários para a melhoria da afinidade de ligação, de um anticorpo humanizado pelo Grupo de Imunologia Molecular da UnB. Em trabalhos anteriores descritos pelo grupo, um anticorpo anti-CD3 humanizado para fins clínicos, foi comparado com o anticorpo original murino quanto a sua capacidade de ligação ao antígeno humano CD3. Os resultados sugeriram que parte da afinidade foi perdida durante o processo de humanização. Então, este estudo visa compreender a interação química e estrutural entre o anti-CD3 humanizado e seu antígeno. Para isto, foram realizadas mutagêneses sítio-dirigidas por PCR overlap, no anticorpo humanizado, com base na estrutura cristalina do complexo OKT3-CD3, que identificou a participação de ligação dos resíduos de aminoácidos chave envolvidos na ligação. Os anti-CD3 com as mutações de interesse foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) na forma de fragmento de anticorpo FvFc (scFv ligado diretamente aos domínios CH2-CH3 de IgG 1 humana). Purificamos estas proteínas e, em paralelo, produzimos um CD3 de cadeia única recombinante usando um sistema de expressão de antigenos solúveis em bactéria. Os anticorpos mutados e o antígeno, serão usados em testes de afinidade, competição, bloqueio e proliferação usando as técnicas de ELISA e FACS. O mapeamento detalhado dos resíduos chave envolvidos intimamente com a ligação ao antígeno, permitirá o desenvolvimento mais eficaz de anticorpos anti-CD3 para uso clínico no futuro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The strategy of antibody humanization has been effective in improving the clinical use of biopharmaceuticals. Thus, the manipulation of the polypeptide chain, eventually leads to an affinity loss, reducing its effectiveness. This study is a continuation of the tests needed to improve the binding affinity of an antibody humanized by the Group of Molecular Immunology, UnB. In previous work described by the group, a humanized anti-CD3 antibody for clinical purposes, was compared with the original murine antibody and its ability to bind to the human CD3 antigen. The results suggested that part of the affinity was lost during the process of humanization. So, this study aims to understand the chemical and structural interaction between the anti-CD3 humanized antibody and its antigen. With this pourpose, we performed site-directed mutagenesis in the humanized antibody, based on the crystal structure of the complex CD3-OKT3 (a murine monoclonal antibody), which identified the participation of key binding residues involved in binding. Some amino acids residues of the humanized anti-CD3, were selected and modified by PCR overlap. Mutants were produced Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in the form of antibody fragment FvFc (a scFv linked to human IgG1 CH2-CH3 domains). We purified this protein and in parallel, produced a scFv CD3  recombinant expression system that permits the purification of soluble bacterial antigens. The recombinant molecules will be used in assays for affinity, competition, blocking and proliferation using the ELISA and FACS. The detailed mapping of key residues intimately involved with binding to the antigen, will allow the development of more effective anti-CD3 antibody for clinical use in the future.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2018-05-21T15:25:31Z No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2018-05-23T16:59:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-23T16:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Acute lymphocytic leukemia (ALL) is a type of cancer that compromises the maturation of blood cells of the lymphoblastic lineage, being prevalent in children, but with a good chance of cure due to chemotherapy. The biopharmaceutical L-asparaginase (L- ASNase) is one of the main drugs used in the treatment of this neoplasm, but the immunogenicity derived from the bacterial origin of the enzyme currently produced and the consequent short half-life are challenges to be overcome by the pharmaceutical industry. In this sense, nanobiotechnology is a broad platform for the development of drug delivery aimed at the transport of therapeutic enzymes, besides being able to overcome these problems, it still allows better protein stability with regard to aggregation and denaturation that result in a decrease in enzymatic activity and consequently the pharmacological action. Thus, the objective of this work was to obtain and characterize poly (lactic acid-co-glycolic acid) nanoparticles (PLGA) for L-ASNase encapsulation. The double emulsification method by homturrizing with ultraturrax or cavitation with ultrasound probe was used to obtain the systems, using different times (30 or 60 s) and from two types of PLGA 50:50 with different molecular weights (30-60 KDa e 24-38 KDa) and polyvinyl alcohol (PVA) at concentrations of 0.5, 1, 1.5 and 2%. The size and polydispersity of the nanoparticles were evaluated by dynamic light scattering (DLS). The evaluation of the ASNase encapsulation was performed by quantification of total proteins by the indirect (in the supernatant) and direct method (in the ruptured nanoparticle system). By the nessler method, it was possible to observe that the encapsulated enzyme presented greater activity than the free enzyme. The enzyme release study was performed by dialysis, where < 60% of protein was released in 48 hours. The L-ASNase encapsulation monitoring was performed using native gel electrophoresis and zymogram. Circular dichroism was also used to evaluate the conformational changes of the encapsulated enzyme. From PLGA 30-60 KDa systems were obtained with sizes predominantly between 400 and up to more than 1 μm, with large variation in sizes between them, and for PLGA 24-38 KDa the size range is from 380 nm to 670 nm. Cavitation and higher concentration of PVA resulted in the formation of systems without coalescence. The system made with PLGA 24-38 KDa obtained by cavitation with 1% PVA with homogenization time of 60 s was chosen for ASNase encapsulation and presented encapsulation efficiency by the direct method of 86.67% (± 1.84) and by the method of 95.35% (± 0.06). According to the hemolysis essay, the systems with and without the enzyme were nonhemolytic. / A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é um tipo de câncer que compromete a maturação das células sanguíneas da linhagem linfoblástica, sendo prevalente em crianças, mas com boas chances de cura advinda da quimioterapia. O biofármaco L-asparaginase (L- ASNase) é um dos principais fármacos usados no tratamento desta neoplasia, porém a imunogenicidade advinda da origem bacteriana da enzima atualmente produzida e o consequente tempo de meia-vida curto são desafios a serem vencidos pela indústria farmacêutica. Neste sentido, a nanobiotecnologia é uma ampla plataforma para o desenvolvimento de drug delivery visando o carreamento de enzimas terapêuticas, podendo além de contornar estes problemas, ainda permitir melhor estabilidade das proteínas no que diz respeito à agregação e desnaturação que resultam em diminuição da atividade enzimática e consequentemente da ação farmacológica. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização de nanoparticulas do tipo nanoesferas de poli (ácido lático- co- glicólico) (PLGA) para encapsulação da L-ASNase. O método de dupla emulsificação por homogeinização com ultraturrax ou cavitação com sonda de ultrassom foi usado para obtenção dos sistemas, empregando diferentes tempos (30 ou 60 s) e a partir de dois tipos de PLGA 50:50 com diferentes pesos moleculares (30-60 KDa e 24-38 KDa) e álcool polivinílico (PVA) nas concentrações de 0,5;1;1,5 e 2%. O tamanho e polidispersão das nanopartículas foram avaliados por espalhamento de luz dinâmico (DLS). A avaliação da encapsulação da L-ASNase foi realizada por meio da quantificação de proteínas totais através do método indireto (no sobrenadante) e direto (no sistema de nanapartículas rompido). Através da nesslerização foi possível observar que a enzima encapsulada apresentou maior atividade que a enzima livre. O estudo de liberação da enzima foi realizado por meio de diálise, onde foi liberada < 60% de proteína em 48 horas. O monitoramento da encapasulação da L-ASNase foi feito por meio de eletroforese com gel nativo e zimograma. Também foi empregado dicroísmo circular para avaliação das alterações conformacionais da enzima encapsulada. A partir do PLGA 30-60 KDa foram obtidos sistemas com tamanhos predominantemente entre 400 nm e até mais de 1 µm, com grande variação de tamanhos entre eles, já para PLGA 24-38 KDa a faixa de tamanho é de 380 nm a 670 nm. A cavitação e maior concentração de PVA resultou na formação de sistemas sem coalescência. O sistema feito com PLGA 24-38 KDa obtido por cavitação com PVA 1% com tempo de homogeneização de 60 s foi escolhido para encapsulação da ASNase e apresentou eficiência de encapsulação pelo método direto de 86,67 % (± 1,84) e pelo método indireto de 95,35%(± 0,06). De acordo com o ensaio de hemólise, os sistemas com e sem a enzima se mostraram não hemolíticos.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-06-14T10:48:13Z No. of bitstreams: 1 marinnagomes.pdf: 1050831 bytes, checksum: 19f0caa7f0448c9ddc9f79c839e5aa28 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-06-14T11:32:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marinnagomes.pdf: 1050831 bytes, checksum: 19f0caa7f0448c9ddc9f79c839e5aa28 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-14T11:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marinnagomes.pdf: 1050831 bytes, checksum: 19f0caa7f0448c9ddc9f79c839e5aa28 (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 / Acidentes ofídicos representam um grave problema de saúde pública devido a sua alta incidência e a gravidade dos seus efeitos. No Brasil, o gênero Bothrops é responsável por 85% dos casos de acidentes. A principal forma de tratamento para tais acidentes é feita através da soroterapia, utilizando-se anticorpos eqüinos, porém os mesmos não são capazes de neutralizar os efeitos sistêmicos do envenenamento e podem causar reações adversas. Uma nova perspectiva para o tratamento de acidentes ofídicos é a utilização de anticorpos recombinantes, mais precisamente a porção scFv. O fragmento scFvBap1 é oriundo de um anticorpo monoclonal, produzido em Escherichia coli foi capaz de neutralizar os efeitos hemorrágicos do envenenamento. Atualmente as plantas vêm sendo amplamente utilizadas na produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico. Neste estudo, objetivou-se a expressão do fragmento scFv em Nicotiana benthamiana, a fim de avaliar seu potencial para ser utilizado como soro antiofídico. Foram avaliadas a expressão transiente do fragmento scFvBap1 em folhas de N. benthamiana, bem como a expressão estável na mesma planta. Os fragmentos produzidos foram capazes de reconhecer e neutralizar as toxinas BaP1 de B. asper, BnP1 de B. newidae e ATX de B. atrox, demonstrando seu potencial para ser utilizado na terapia contra envenenamentos ofídicos. O sistema de produção estável apresentou-se maior rendimento de proteínas (270 μg/g) quando comparado ao sistema de produção transiente (43 μg/g). Por fim, o sistema mostrou-se uma ótima alternativa para produção do fragmento de anticorpo quando comparado ao sistema bacteriano. / Ophidian accidents are a global health problem due to its high incidence and gravity of its effects. In Brazil, the genus Bothrops is responsible for 85% of the cases of accidents. The main form of treatment for snake envenoming is serum therapy using equine antibodies, however, they are not able to neutralize the local effects of the toxin and may also cause adverse reactions. A new perspective for the treatment of snakebite envenoming has emerged with the use of recombinant antibodies, particularly the Fv fragment (scFv). The scFvBap1, is an efficient antibody capable of neutralizing the hemorrhagic effects and proteolytic activity caused by metalloproteinases. Currently the plants have been widely used in the production of recombinant proteins of pharmaceutical interest. In this study, we aimed the expression of the scFv fragment in Nicotiana benthamiana, in order to evaluate its potential as an antiophiidic serum. The transient expression of the scFvBap1 fragment in leaves of N. benthamiana, as well as the stable expression in the same plant, were evaluated.The fragments produced were able to recognize and neutralize the toxins BaP1 from B. asper, BnP1 from B. newidae and ATX from B. atrox, demonstrating their potential to be used in therapy against ophidian poisoning. The stable production system presented higher protein yield (270 μg / g) when compared to the transient production system (43 μg / g). Finally, the system proved to be a good alternative for producing the antibody fragment when compared to the bacterial system.

Anticorpos são moléculas de grande interesse científico e farmacêutico, principalmente, devido a sua alta especificidade contra antígenos determinados. Atualmente, anticorpos monoclonais estão entre os medicamentos (biofármacos) mais vendidos do mundo. São utilizados para o tratamento das mais diversas doenças, como câncer, retinopatias, doenças inflamatórias e do sistema imune, entre outras. Nos últimos 30 anos, as tecnologias para a obtenção de anticorpos monoclonais evoluíram muito, desde a tecnologia do hibridoma, até os processos de humanização de anticorpos murinos. Entre os métodos mais utilizados para a produção de anticorpos humanos, destaca-se a tecnologia do Phage Display. Nesta técnica, os genes que codificam as regiões variáveis de imunoglobulinas são inseridos no genoma de um bacteriófago, resultando na produção de partículas virais híbridas que contém fragmentos de anticorpos em fusão com uma das proteínas do capsídeo viral. Neste trabalho, desenvolvemos novos vetores para a apresentação de fragmentos ScFv em fusão com duas proteínas das proteínas do capsídeo viral, a pIII e pVIII. Os oligonucleotídeos utilizados para amplificar os genes de imunoglobulinas foram redesenhados e para minimizar a perda do repertório durante a produção da biblioteca, avaliamos em bancos de dados enzimas de restrição que não apresentam sítios de restrição nas sequencias gênicas. Esses sítios de restrição foram utilizados para construir as regiões de clonagem do vetor Phagemid. Outra etapa crítica na produção de bibliotecas de anticorpos é a reação do PCR de overlap, que pode restringir a diversidade de anticorpos e resultar na produção de amplicons codificando anticorpos truncados. Por isso, nossos vetores foram desenhados para permitir a clonagem direta das regiões variáveis das imunoglobulinas humanas ou murinas, sem a necessidade do PCR de overlap. Nossa expectativa, é que estes novos reagentes serão mais efetivos para a produção de novas bibliotecas de anticorpos pelo sistema do Phage Display. / Antibodies are molecules of great scientific and pharmaceutical interest, mainly because of their high specificity against certain antigens. Currently, monoclonal antibodies are among the best selling drugs (biopharmaceuticals) in the world. They are used for the treatment of the most diverse disorders, such as cancer, retinopathies, inflammatory and immune system diseases, among others. In the past 30 years, technologies for obtaining monoclonal antibodies has greatly evolved from hybridoma technology to the humanization processes of murine antibodies. Among the methods used for the production of human antibodies, the technology of Phage Display stands out. In this technique, the genes encoding the immunoglobulin variable regions are inserted into the genome of a bacteriophage, resulting in the production of hybrid virus particles which contain fragments of antibodies in fusion with one of the viral capsid proteins. In this work, we developed new vectors for the presentation of ScFv fragments in fusion with two proteins of viral capsid proteins, pIII and pVIII. The oligonucleotides used to amplify the immunoglobulin genes were redesigned and to minimize repertory loss during library production, we evaluated restriction enzymes in databases that lack restriction sites in the gene sequences. These restriction sites were used to construct the cloning regions of the Phagemid vector. Another critical step in the production of antibody libraries is the overlap PCR reaction, which may restrict the diversity of antibodies and result in the production of amplicons encoding truncated antibodies. Therefore, our vectors were designed to allow the direct cloning of human or murine Immunoglobulins variable regions without the need for overlap PCR. Our expectation is that these new reagents will be more effective for the production of new antibody libraries by the Phage Display system.

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins. / A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T17:12:41Z No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T17:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Nesta avaliação, realizaram-se ensaios cromatográficos de purificação de eritropoetina humana recombinante, a partir do sobrenadante de cultura de células de mamíferos da linhagem CHO (células de ovário de hamster chinês), produtoras deste biofármaco. Compararam-se as membranas comerciais de troca iônica Sartobind (MA) Q e D, com o objetivo de avaliar a sua aplicabilidade a processos de purificação de EPO. Ambas as membranas apresentaram-se capazes de adsorver EPO nas condições avaliadas. EPO foi detectada nas amostrasde eluído de ambas as membranas, tendo-se verificado que o imunoensaio dotipo dot-blotfoi aquele que forneceu as informações mais conclusivas. Já nas análises de eletroforese, verificou-se um perfil difuso das bandas do eluído das membranas, o que foi creditado à heterogeneidade glicídica da EPO, como anteriormente demonstrado na literatura. / In the present work, the purification of recombinant human erythropoietin (rhEPO) from CHO (Chinese hamster ovary) cell culture supernatant was investigated using anion-exchange chromatography. Commercial membrane adsorbers (Sartobind D and Q) were compared, with the aim of evaluating their aplicability to EPO purification processes. Both membranes were able to adsorb EPO under the conditions evaluated in this work. EPO was detected in the eluate of both membranes. The immunoassay dot-blot was the most interesting analytical tool, giving the most conclusive results. Electrophoretic analyses showeda diffuse band, probably due to glycan heterogeneity in the EPO molecules, as previously reported in the literature.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-18T14:39:20Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TeseParcial(Cap.I)-RaimundoJunior-PPGQ.pdf: 1178770 bytes, checksum: 74333ca704cd865ec51c2e655679a37f (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-18T14:39:33Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TeseParcial(Cap.I)-RaimundoJunior-PPGQ.pdf: 1178770 bytes, checksum: 74333ca704cd865ec51c2e655679a37f (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-18T14:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TeseParcial(Cap.I)-RaimundoJunior-PPGQ.pdf: 1178770 bytes, checksum: 74333ca704cd865ec51c2e655679a37f (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / The Myrtaceae family has 132 genera distributed in 5,760 species present in Australia, Southeast Asia, tropical and temperate America. In Brazil, it presents 1,018 species in 23 genera. Myrcia D.C is one of the largest genera with 282 species present in almost all territory, of which 220 are endemics. Its species are used in Brazilian popular medicine, with emphasis on Myrcia spp., which are used by the traditional population of the Amazon as astringents, diuretics, hypoglycemics, antihemorrhagics, antioxidants and in the treatment of hypertension and ulcers. The present study has evaluated the chemical composition of the essential oils of 13 species of Myrtaceae (Myrcia spp., Marlierea sp. and Calyptranthes sp.) from the Terra Firme ecosystem (Amazon). In addition, the cytotoxic, antibacterial, bacteriostatic, antifungal and larvicidal potentials of these oils have been described. Twenty-seven samples belonging to these thirteen species (18 individuals of 11 species of Myrcia, one of Marlierea caudata and one of Calyptranthes spruceana) were collected from the Adolpho Ducke Forest Reserve, EMBRAPA (Manaus) and the PANC site (Manaus). Its essential oils were obtained by hydrodistillation, dried and stored under refrigeration. The chemical characterization was carried out by means of CG-DIC and CG-EM analysis. The Arithmetic Indexes and the Spectral Similarity Indexes were obtained, whose results were compared with those described in the main databases. The mean chemical characterization of these oils was 95%, totaling 336 compounds identified, of which 34 have been abundant (50.7 to 96.17%). The most frequent and, in some cases, the most frequent components are: (E)-caryophyllene, δ-cadinene, Espatulenol, α-Copaene, β-elemene, α-humulene, Caryophyllene oxide, β-selinene, α-muurolene and α–cadinol (42.73% of nonoxygenated sesquiterpenes and 36.98% of oxygenated sesquiterpenes). This chemical variability is common to Myrcia species of other Brazilian ecosystems/biomes. Of the seven pairs of Myrcia individuals collected in distinct periods (dry and rainy), 242 compounds were identified, of which 125 were common, 41 and 76 of which were unique to the rainy and dry periods, respectively. Essential oils of the dry period have exhibit greater chemical variability. In addition, the chemical variability of the essential oils of Myrcia spp. of this ecosystem has been described by 51 cyclization pathways. Of these routes, thirteen have a high frequency (above 50%), four of which are the most prominent ones (Cariofilan, Cadinano, Aromadendrano and Eudesmano). The chemical results of this study have revealed a clear agreement of the chemical composition of Marlierea caudata with the chemistry composition of Myrcia spp.. On the other hand, this observation is not clearly evident for C. spruceana. Moreover, It should be noted that the chemical composition of the essential oils of M. magnoliifolia, M. minutiflora, M. fenestrata, M. amapensis and Marlierea caudata have been described for the first time. As for toxicity to cancer cells (Skmel 3 and ACPO2) and normal cells (MRC5), M. minutiflora presents moderate activity for human melanoma (Skmel 3) and gastric adenocarcinoma (ACPO2) as well as cytotoxic to non-neoplastic fibroblasts (MRC5). M. citrifolia, M. minutiflora, M. paivae and M. magnoliifolia present moderate to high activity against Staphylococcus aureus. M. fallax, M. sylvatica, M. paivae and C. spruceana present moderate activity against Staphylococcus aureus. As for the bacteriostatic action, all species tested have shown moderate to high activity against Pseudomonas aeroginosas. In relation to the insecticidal activity, M. citrifolia, M. bracteata, M. fenestrata, M. amazonica, M. paivae and C. spruceana are active, since after 24 h the mortality percentage of Aedes aegypti larvae was 100% in 25 mg.L- 1 of essential oil. Furthermore, the use of chemometric tools in this study has shown it possible to observe the segregation of samples by major terpene groups and their most influential cyclic pathways, whose substances of major relevance in this model have been (E)-Caryophyllene, δ-Cadinene, and Espatulenol. Its pharmacological activities described in the literature should suggest that they are responsible for the biological results observed in this work. However, novel biological assays with such isolated constituents must be necessary. Therefore, with respect to the chemistry of Myrcia volatile constituents occurring in Terra Firme (Amazonia), the present study has been evidenced very characteristic Amazonian chemotypes and without similarity with other species collected outside the region, which leads us to conclude how much to must be studied from the precious Amazonian biodiversity. / A família Myrtaceae apresenta 132 gêneros distribuídas em 5.760 espécies presentes na Austrália, sudeste da Ásia, América tropical e temperada. No Brasil, apresenta-se com 1018 espécies em 23 gêneros. Myrcia D.C é um dos maiores gêneros com 282 espécies presentes em quase todo território, sendo 220 endêmicas. Suas espécies são empregada na medicina popular brasileira, com destaque para Myrcia spp., as quais são usadas pela população tradicional da Amazônia como adstringentes, diuréticos, hipoglicemicas, anti-hemorrágicas, antioxidantes e no tratamento de hipertensão e úlceras. O presente estudo avalia a composição química dos óleos essenciais de 13 espécies de Myrtaceae (Myrcia spp., Marlierea sp. e Myrciaria sp.) de ecossistema de Terra Firme (Amazônia). Além disso são descritos os potenciais citotóxico, antibacteriano, bacteriostático, antifúngico e larvicida desses óleos. Vinte sete amostras pertencentes a essas treze espécies (18 indivíduos de 11 espécies de Mycia, um indivíduo de Marlierea caudata e outro de Calyptranthes spruceana) foram coletados na Reserva Florestal Adolpho Ducke, na EMBRAPA (Manaus) e no sítio PANC (Manaus). Seus óleos essências foram obtidos por hidrodestilação, secos e armazenado sob refrigeração. A caracterização química ocorreu por meio de análises por CG-DIC e CG-EM, cujos Índices Aritiméticos calculados e de Similaridade Espectral foram comparados com os descritos nas principais bases de dados. A média de caracterização química desses óleos foi de 95%, totalizando 336 substâncias identificadas, das quais 34 são abundantes (50,7 a 96,17%). Os componentes mais frequentes, e em alguns casos majoritários, são: (E)–cariofileno, δ–cadineno, Espatulenol, α–copaeno, β–elemeno, α–humuleno, Óxido de cariofileno, β–selineno, α–muuroleno e α–cadinol, prevalecendo estruturas sesquiterpênicas (42,73% de sesquiterpenos não-oxigenados e 36,98% de sesquiterpenos oxigenados). Essa variabilidade química é comum a espécies de Myrcia de outros ecossistemas/biomas brasileiros. Dos sete pares de indivíduos de Myrcia coletados em períodos distintos (seco e chuvoso), identificou-se 242 substâncias, sendo 125 comuns, com 41 exclusivas do período chuvoso e 76 são exclusivos do períoso seco. Os óleos essenciais do período seco apresentaram uma maior variabilidade química. Além disso, a variabilidade química dos óleos essenciais de Myrcia spp. desse ecossistema pôde ser descrita por 51 vias de ciclização. Dessas vias, treze apresentam elevada frequência (superior a 50%), sendo quatro vias de destaque pela maior ocorrência (Cariofilano, Cadinano, Aromadendrano e Eudesmano). Os resultados químicos desse estudo revelam uma clara concordância de Marlierea caudata com a química de Myrcia spp., porém o mesmo não se evidencia claramente para C. spruceana. Ressalta-se que a composição química dos óleos essenias de M. magnoliifolia, M. minutiflora, M. fenestrata, M. amapensis e Marlierea caudata são descritos pela primeira vez. Quanto à toxicidade frente a células cancerígenas (Skmel 3 e ACPO2) e normais (MRC5), M. minutiflora apresenta atividade moderada para melanoma humano (Skmel 3) e adenocarcinoma gástrico (ACPO2), bem como citotóxica para fibroblastos nãoneoplásicos (MRC5). M. amazonica e M. fenestrata também apresentam atividade moderada para Skmel 3. Quanto ao potencial antimicrobiano e bacteriostático, M. citrifolia, M. minutiflora, M. paivae e M. magnoliifolia apresentam atividade moderada a elevada frente a Staphylococcus aureus. M. fallax, M. sylvatica, M. paivae e C. spruceana apresentam atividade moderada frente a Staphylococcus aureus. Quanto a ação bacteriostática, todas as espécies ensaiadas apresentam atividade moderada a elevada frente a Pseudomonas aeroginosas. Em relação a atividade inseticida, M. citrifolia, M. bracteata, M. fenestrata, M. amazonica, M. paivae e C. spruceana são ativas, pois após 24 h o percentual de mortalidade das larvas de Aedes aegypti é de 100% em 25 mg.L-1 de óleo essencial. A aplicação de ferramentas quimiométricas nesse estudo possibilitou observar a segregação das amostras por grupos terpênicos majoritários e suas vias de ciclização mais influentes, cujas substâncias de maior relevância nesse modelo são: (E)-cariofileno, δ–cadineno e Espatulenol. Suas atividades farmacológicas descritas na literatura sugerem serem os responsáveis pelos resultados biológicos observados nesse trabalho. Contudo, novos ensaios biológicos com tais constituintes isolados talvez sejam necessários. Portanto, a respeito da química dos constituintes voláteis de Myrcia ocorrentes em Terra Firme (Amazônia), o presente estudo evidência quimiotipos amazônicos bem característicos e sem similaridade com outras espécies coletadas fora da região, o que nos leva a concluir o quanto ainda há a ser estudado a partir da preciosa biodiversidade amazônica.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-09T16:36:26Z No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-09T16:36:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) Previous issue date: 2005-05 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os anticorpos monoclonais possuem diversasaplicações em transplantes, na composição de conjuntosde reativos para diagnóstico, grande variedade de doenças auto-imunes e, principalmente, na terapia do câncer. A tecnologia de produção de anticorpos monoclonais recombinantes revolucionou a geração de imunoglobulinas, possibilitando a obtenção de anticorpos humanizados dirigidos a uma grande variedade de antígenos específicos. A baixa seletividade das metodologias atuais para diagnóstico e terapia de neoplasiasconstitui um dos principais empecilhospara a prática oncológica. Nesse particular, a utilização de imunoglobulinas submetidas à engenharia genética já é uma realidade e significa um avanço estratégico, abrangendo cerca de 25% do mercado biofarmacêutico global de proteínas terapêuticas. Este trabalho aponta os aspectos fundamentais à concretização da metodologia de humanização de anticorpos por transplante das regiões determinantes de complementaridade – CDR, com ênfase em uma proposta de produção do anticorpo anti – CD20 contrao Linfoma Não-Hodgkin. A introdução do Instituto de Tecnologia emImunobiológicos - Bio-Manguinhos nesse promissor e importante mercado de biofármacos através da implantação da metodologia de humanização do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 é objeto desta dissertação. Viabilizar sua produção torna-se extremamente importante, tanto para a identificação precisa e precoce da enfermidade, quanto para atender um segmento do mercado brasileiro ainda desprovido de tratamento abrangente e eficaz. A apresentação do estudo dos anticorpos, sua estrutura e características, o estudo dosdiferentes sistemas de expressão, cultivo, purificação,bem como a proposta de reestruturação e redimensionamento do Laboratório de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais, parcerias, colaborações, recursos humanos necessários e aspectos de mercado, são aqui considerados. / Monoclonal antibodies (Mabs) have several applications in transplants, reagents for diagnosis, a great variety ofauto-immune diseases and mainly, in cancer therapy. Mabs production employing recombinant echnologymade a revolution in immunoglobulinsgeneration, enabling the production of humanized antibodiesthat recognize specific antigens. The low selectivity of the current techniquesfor neoplasm diagnosis and therapy is one of the major impediments for oncology practice. In this regard, the use of eneticallyengineered immunoglobulins has become a reality and meansa strategic development comprising around 25% of the global biopharmaceutical market. This work shows the most important aspects in Mabs humanization through complementary determining regions (CDR) graft methodology, emphasizing a proposal ofanti-CD20 Mab production against non-Hodgkin lymphoma. Introducing the Instituto de Tecnologia emImunobiológicos – Bio-Manguinhos in this important and promising biopharmaceutical market through the establishment of humanization methodology is the main object of this dissertation. Making humanized Mabs production feasible is veryimportant not only for the earlyand precise identification of illnesses, but also to meet a demand of the Brazilian market that still lacks comprehensive and efficient treatment. The study of Mabs, their structureand properties, expression systems, cultivation, purification, new dimensions and structure of the laboratory, partnerships, cooperation,human resources and market analysis are considered herein.