Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:12:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / A estratégia de humanização de anticorpos tem sido eficiente para melhorar o uso clínico desses biofármacos. Porém, a manipulação da cadeia polipeptídica, eventualmente, leva a uma perda de afinidade, reduzindo sua eficácia. Este estudo é uma continuação dos testes necessários para a melhoria da afinidade de ligação, de um anticorpo humanizado pelo Grupo de Imunologia Molecular da UnB. Em trabalhos anteriores descritos pelo grupo, um anticorpo anti-CD3 humanizado para fins clínicos, foi comparado com o anticorpo original murino quanto a sua capacidade de ligação ao antígeno humano CD3. Os resultados sugeriram que parte da afinidade foi perdida durante o processo de humanização. Então, este estudo visa compreender a interação química e estrutural entre o anti-CD3 humanizado e seu antígeno. Para isto, foram realizadas mutagêneses sítio-dirigidas por PCR overlap, no anticorpo humanizado, com base na estrutura cristalina do complexo OKT3-CD3, que identificou a participação de ligação dos resíduos de aminoácidos chave envolvidos na ligação. Os anti-CD3 com as mutações de interesse foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) na forma de fragmento de anticorpo FvFc (scFv ligado diretamente aos domínios CH2-CH3 de IgG 1 humana). Purificamos estas proteínas e, em paralelo, produzimos um CD3 de cadeia única recombinante usando um sistema de expressão de antigenos solúveis em bactéria. Os anticorpos mutados e o antígeno, serão usados em testes de afinidade, competição, bloqueio e proliferação usando as técnicas de ELISA e FACS. O mapeamento detalhado dos resíduos chave envolvidos intimamente com a ligação ao antígeno, permitirá o desenvolvimento mais eficaz de anticorpos anti-CD3 para uso clínico no futuro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The strategy of antibody humanization has been effective in improving the clinical use of biopharmaceuticals. Thus, the manipulation of the polypeptide chain, eventually leads to an affinity loss, reducing its effectiveness. This study is a continuation of the tests needed to improve the binding affinity of an antibody humanized by the Group of Molecular Immunology, UnB. In previous work described by the group, a humanized anti-CD3 antibody for clinical purposes, was compared with the original murine antibody and its ability to bind to the human CD3 antigen. The results suggested that part of the affinity was lost during the process of humanization. So, this study aims to understand the chemical and structural interaction between the anti-CD3 humanized antibody and its antigen. With this pourpose, we performed site-directed mutagenesis in the humanized antibody, based on the crystal structure of the complex CD3-OKT3 (a murine monoclonal antibody), which identified the participation of key binding residues involved in binding. Some amino acids residues of the humanized anti-CD3, were selected and modified by PCR overlap. Mutants were produced Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in the form of antibody fragment FvFc (a scFv linked to human IgG1 CH2-CH3 domains). We purified this protein and in parallel, produced a scFv CD3  recombinant expression system that permits the purification of soluble bacterial antigens. The recombinant molecules will be used in assays for affinity, competition, blocking and proliferation using the ELISA and FACS. The detailed mapping of key residues intimately involved with binding to the antigen, will allow the development of more effective anti-CD3 antibody for clinical use in the future.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-09T16:36:26Z No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-09T16:36:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) Previous issue date: 2005-05 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os anticorpos monoclonais possuem diversasaplicações em transplantes, na composição de conjuntosde reativos para diagnóstico, grande variedade de doenças auto-imunes e, principalmente, na terapia do câncer. A tecnologia de produção de anticorpos monoclonais recombinantes revolucionou a geração de imunoglobulinas, possibilitando a obtenção de anticorpos humanizados dirigidos a uma grande variedade de antígenos específicos. A baixa seletividade das metodologias atuais para diagnóstico e terapia de neoplasiasconstitui um dos principais empecilhospara a prática oncológica. Nesse particular, a utilização de imunoglobulinas submetidas à engenharia genética já é uma realidade e significa um avanço estratégico, abrangendo cerca de 25% do mercado biofarmacêutico global de proteínas terapêuticas. Este trabalho aponta os aspectos fundamentais à concretização da metodologia de humanização de anticorpos por transplante das regiões determinantes de complementaridade – CDR, com ênfase em uma proposta de produção do anticorpo anti – CD20 contrao Linfoma Não-Hodgkin. A introdução do Instituto de Tecnologia emImunobiológicos - Bio-Manguinhos nesse promissor e importante mercado de biofármacos através da implantação da metodologia de humanização do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 é objeto desta dissertação. Viabilizar sua produção torna-se extremamente importante, tanto para a identificação precisa e precoce da enfermidade, quanto para atender um segmento do mercado brasileiro ainda desprovido de tratamento abrangente e eficaz. A apresentação do estudo dos anticorpos, sua estrutura e características, o estudo dosdiferentes sistemas de expressão, cultivo, purificação,bem como a proposta de reestruturação e redimensionamento do Laboratório de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais, parcerias, colaborações, recursos humanos necessários e aspectos de mercado, são aqui considerados. / Monoclonal antibodies (Mabs) have several applications in transplants, reagents for diagnosis, a great variety ofauto-immune diseases and mainly, in cancer therapy. Mabs production employing recombinant echnologymade a revolution in immunoglobulinsgeneration, enabling the production of humanized antibodiesthat recognize specific antigens. The low selectivity of the current techniquesfor neoplasm diagnosis and therapy is one of the major impediments for oncology practice. In this regard, the use of eneticallyengineered immunoglobulins has become a reality and meansa strategic development comprising around 25% of the global biopharmaceutical market. This work shows the most important aspects in Mabs humanization through complementary determining regions (CDR) graft methodology, emphasizing a proposal ofanti-CD20 Mab production against non-Hodgkin lymphoma. Introducing the Instituto de Tecnologia emImunobiológicos – Bio-Manguinhos in this important and promising biopharmaceutical market through the establishment of humanization methodology is the main object of this dissertation. Making humanized Mabs production feasible is veryimportant not only for the earlyand precise identification of illnesses, but also to meet a demand of the Brazilian market that still lacks comprehensive and efficient treatment. The study of Mabs, their structureand properties, expression systems, cultivation, purification, new dimensions and structure of the laboratory, partnerships, cooperation,human resources and market analysis are considered herein.