Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-10-21T18:46:59Z No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) Previous issue date: 2008 / A renina é uma aspartil protease sintetizada in vivo pela remoção proteolítica do prósegmento amino-terminal de seu precursor, a pró-renina. A catepsina B, uma tiol protease, tem sido sugerida como candidata à enzima conversora de pró-renina devido à sua colocalização com a renina nos grânulos secretórios e também pela sua capacidade de processar a pró-renina em renina in vitro e em cultura de células. Vetores de expressão de pró-renina selvagem (WT) e mutantes foram co-transfectados com catepsina B em células hipofisárias de ratos GH4C1, que naturalmente não converte pró-renina em renina. Mutações pontuais foram utilizadas para identificar quais aminoácidos presentes no sítio de clivagem da pró-renina são reconhecidos pela catepsina B. Experimentos de pulse-chase foram realizados para rastrear se a pró-renina radiomarcada é capaz de seguir para os grânulos secretórios das células GH4C1. Para investigar se a pró-renina humana poderia ativar o promotor do Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) em cardiomiócitos de ratos neonatos, essas células foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter BNP-luciferase com (ou sem) angiotensinogênio humano. Os cardiomiócitos foram co-incubados com as células não-aderentes U937 transfectadas com pró-renina humana WT ou mutantes (-1-2 ou +5). Os cardiomiócitos foram lisados 96 horas após a eletroporação para a análise de geração de luciferase. Células não-transfectadas U937 foram usadas como grupo controle. Captopril e Losartan (10-7 M) foram usados para testar a participação da enzima conversora de angiotensina (ECA) e dos receptores AT1. Os resultados demonstraram que mutações pontuais na metionina -3(M/A), lisina -2(K/A) e leucina +2(L/A) reduzem o processamento da pró-renina pela catepsina B. Além disso, a remoção da cadeia glicosídica na asparagina +5 aumenta a conversão de pró-renina, sugerindo que a glicosilação poderia impedir o processamento enzimático da pró-renina. Nos experimentos de pulse-chase, a pró-renina não foi direcionada aos grânulos secretórios e a presença de catepsina B não alterou esse resultado, indicando que o processamento de pró-renina provavelmente ocorre fora dessas organelas. A pró-renina WT secretada pelas células U937 é capaz de ativar o promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos transfectados com angiotensinogênio humano. O par de aminoácidos básicos arginina-lisina e a cadeia glicosídica +5 parecem ser tão importantes quanto a atividade enzimática da ECA e os receptores AT1 para a ativação do promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos neonatos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Renin is an aspartyl protease synthesized in vivo by proteolytic removal of amino-terminal prosegment of its precursor, prorenin. Cathepsin B, a thiol protease, has been proposed to be a good candidate for prorenin processing enzyme because of its co-localization with renin in secretory granules and also by its ability to activate prorenin in vitro and in cell culture. It was co-transfected vectors expressing wild type and mutant prorenins with cathepsin B in rat pituitary GH4C1 cells, which normally do not activate prorenin into renin unless cotransfected with a prorenin processing enzyme. Scanning mutagenesis was used to identify which amino acids at prorenin cleavage site are specifically recognized by cathepsin B. Pulsechase experiments were performed to follow whether radiolabeled prorenin is sorted to secretory granules. To investigate whether human prorenin could activate the Brain Natriuretic Peptide promoter (BNP) in neonatal rat cardiomyocytes, these cells were cotransfected with a reporter gene BNP-luciferase associated or not with a human angiotensinogen. The cardiomyocytes were co-incubated with no adherent U937 cells transfected with human prorenin wild type (WT) or mutants (-1-2 or +5). Cardiomyocytes were lysated 96 hours after electroporation for luciferase generation analysis. No transfected U937 cells were used as a control group. Captopril and Losartan at 10-7 M were used to test angiotensin converting enzyme (ACE) and AT1 receptors participation in this process. The results demonstrated that single mutations at - 3 methionine (M/A), -2 lysine (K/A) and +3 leucine (L/A) reduced prorenin processing by cathepsin B. Moreover, removal of N-linked oligosaccharides at +5 asparagine enhanced prorenin conversion by cathepsin B, showing that glycosylation seems impair enzymatic prorenin processing. In pulse-chase experiments, prorenin was not targeted to secretory granules and cathepsin B co-transfection did not changed this sorting, indicating that prorenin processing probably occurs outside these organelles. These findings suggest that cathepsin B removes prorenin prosegment at correct cleavage site and this proteolysis occurs outside the dense core granules. Prorenin WT secreted by U937 cells could activate the BNP promoter in rat cardiomyocytes transfected with human angiotensinogen. Dibasic arginine-lisine prorenin amino acids and N-linked glycosilation seems to be important as well as ACE enzymatic activity and AT1 receptors for BNP promoter activation.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Introdução: A identificação precoce da leucoplasia de prega vocal com risco de evoluir para malignidade é um assunto controverso e de difícil diagnóstico. Com a descoberta de marcadores biológicos capazes de identificar precocemente estas lesões, ter-se-iam melhores condições de realizar um tratamento mais efetivo precocemente. Objetivo: Analisar a imunoexpressão das proteínas Catepsina-B e Ecaderina nas leucoplasias de prega vocal e correlacioná-las com os dados clínicos, epidemiológicos e prognóstico da doença. Método: Foram avaliados, retrospectivamente, 32 pacientes portadores de leucoplasia de pregas vocais, tratados por cirurgia no período de 2000 a 2004. Os pacientes foram distribuídos de acordo com os resultados histológicos em dois grupos: Grupo A - Baixo Grau, n=16 e Grupo B - Alto Grau, n=16. As expressões quantitativas dos marcadores foram avaliadas, segundo a intensidade da sua coloração e distribuição tecidual, pelo programa de processamento de imagens-ImageLab®. O índice de expressão (IE) de cada marcador foi correlacionado com os hábitos de vida dos pacientes - uso de tabaco e bebida alcoólica -, sinais da síndrome faringolaríngea do refluxo e recidiva local da lesão. Resultados:Na análise estatística comparando o IE dos marcadores entre os grupos (A e B) separadamente, os pacientes com recidiva local do Grupo B - apresentaram maior IE para Catepsina-B. Na análise do IE dos marcadores entre todos os pacientes (A + B), o IE da Catepsina-B foi maior entre os fumantes e os que não apresentavam sinais sugestivos de refluxo,e o IE da E-caderina foi maior nos pacientes com recidiva local. Conclusão: Os pacientes com displasia moderada, severa e carcinoma in situ, com elevado IE de Catepsina-B e que tenham o hábito do tabagismo estão mais propensos à recidiva local, e aqueles com sinais sugestivos da síndrome faringolaríngea do refluxo apresentam índices de expressão mais baixo de Catepsina-B, independente da lesão histológica. O aumento no índice da expressão para Catepsina-B no grupo com lesões de alto grau aponta esta proteína como potencial marcador de recidiva para as lesões leucoplásicas da prega vocal. O índice de expressão da E-caderina encontra-se aumentado entre os pacientes com Leucoplasia de prega vocal que recidivaram após tratamento inicial. / Introduction: Early identification of vocal fold leukoplakia with risk for malignancy is a controversial subject and difficult in terms of diagnosis. Histological changes that may predispose to this irreversible malignant transformation remain as undefined lesions in the larynx. With the analysis of immunohistochemical parameters and the discovery of a biological marker able to identify these early lesions, a more effective early treatment can be provided, which can result in the preservation of phonatory organ. Objective: To analyze the immunohistochemical protein expression of cathepsin B-and ECadherin in leukoplakia of the vocal fold and correlate them with clinical data, epidemiology and prognosis of the disease. Method: We retrospectively evaluated 32 patients with leukoplakia of the vocal folds in the Institute of Larynx- city of Sao Paulo- diagnosed through laryngoscopy and treated with surgery during 2000 to 2004. Patients were divided into two groups according to histological results, Group A (Low Grade, n = 16) and Group B (High Grade, n = 16). Slides added by anti-cathepsin-B and anti-E-cadherin were obtained from paraffin blocks for subsequent reading of markers through Imagna- ImageLab processing. The quantitative expression of cathepsin B-and Ecadherin was evaluated according to the coloration intensity and tissue distribution. The expression index (EI) of each marker was correlated to patient´s lifestyle (use of tobacco and alcohol), signs of gastroesophageal reflux disease and local recurrence of the lesion in two separate groups and among all patients. Results: In the descriptive analysis, the vocal fold leukoplakia showed more intensity in men who had frequent habit of smoking and alcohol consumption. These patients had high levels suggestive of signs of gastroesophageal reflux disease and local recurrence of the lesion after initial treatment. Statistical analysis comparing the levels of expression (IE) of the markers between the groups (A and B), patients with local recurrence in Group B (High Grade) had higher IE for cathepsin-B. In the statistical analysis of IE markers among all patients without histological differentiation, the IE of cathepsin-B was higher among smokers and those with no signs suggestive of reflux. In the same analysis, E-cadherin was higher in all patients with local recurrence. Conclusion: Smoking patients who have moderate or severe dysplasia, carcinoma in situ and high levels of cathepsin-B were more susceptible to local recurrence of disease. Those with signs suggestive of gastroesophageal reflux disease had lower IE of cathepsin-B, independent of histologic differentiation. The increase in cathepsin-B expression, for high grade lesions group, indicates this protein as a possible marker of aggressiveness to leukoplastic vocal cord lesions. The rate of expression of Ecadherin is shown as a potential marker for recurrence of leukoplastic vocal fold lesions. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-01Bitstream added on 2014-06-13T19:30:16Z : No. of bitstreams: 1 mazon_rc_me_arafcf.pdf: 520188 bytes, checksum: 4af452f70d4ec4f1806399a4a3c1661c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O mdm2 parece controlar o tráfego da proteína p53 do núcleo-citoplasma enquanto a proteína p27 é um inibidor de CDK que controla a fase G1 para S do ciclo celular. Em contraste, a catepsina B parece induzir um sinal de apoptose independente de caspase na presença do HPV. Entretanto, a influência da infecção pelo HPV na carcinogênese oral e o envolvimento na desregulação das proteínas do ciclo celular não são claras. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre a expressão de proteínas do ciclo celular, p27, mdm2 e catepsina B e câncer oral na presença do HPV. Cinqüenta e cinco biópsias orais representando lesões benignas (LB), lesões potencialmente malignas (LPM) e lesões malignas (LM). A detecção e tipagem do HPV (6/11,16,18, 31 e 33) foi realizada pela reação da polimerase em cadeia (PCR). A expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B foi analisada pela reação imunohistoquímica. Vinte e uma (38%) de 55 lesões orais foram positivas para HPV. O DNA do HPV 6/11 foi encontrado em 6 (33%), HPV 16 em 1(5%) e o HPV 18 em 14 (72%). Não foi encontrado HPV 31 e 33. De 55 biópsias, foi encontrada alta expressão de todas as proteínas: o p27 foi encontrado em 37 (67,2%) lesões, mdm2 em 17 (30,9%) e a catepsina B em 37 (67,2%). Entre lesões orais de HPV positivo, uma superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B foi encontrada, respectivamente, em 6 (33%) de 18 lesões benignas, 4 (22%) de 18 lesões potencialmente malignas e 11 (57,9%) de 19 lesões malignas. Adicionalmente, o HPV16/18 (11/58%) foi detectado em lesões malignas com alta expressão de todas as proteínas. Nós concluímos que os tipos de HPVs de alto risco devem estar associados com carcinoma oral, bem como, com a superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B. Estes resultados sugerem que os tipos de HPVs de alto risco podem desregular o controle do ciclo celular, contribuindo para a carcinogênese oral. / Mdm2 seems to control p53 nucleus-cytoplasm traffic while p27 is a CDK inhibitor which control G1 to S phase of the cell-cycle. In contrast, cathepsin B is reported in HPVinduced apoptotic signalling caspase-independent. However, the influence of HPV infection in oral carcinogenesis and its involvement to this cell-cycle proteins dysfunction remain still unclear. The purpose of this study was to clarify the association between the expression of cell-cycle proteins, p27, mdm2 and cathepsin B and oral cancer HPV-related. Fifty-five oral biopsies presenting benign oral lesions (BL), potentially malignant lesions (PML) and malignant oral lesions (ML). HPV detection and typing (6/11, 16, 18, 31 and 33) was performed using polymerase chain reaction. p27, mdm2 and cathepsin B quantitative expression were performed by immunohistochemistry. Twenty one (38%) of the 55 oral lesions were positive for HPV, of which HPV6/11 DNA was found in 6 (33%), HPV 16 in 1(5%) e o HPV 18 in 14 (72%). No HPV positivity was found to HPV31 and 33. Of the 55 biopsies, a high expression of all proteins was found: to p27 in 37 (67,2%), mdm2 was observed in 17 (30,9%) slides, and cathepsin B in 37 (67,2%). Among HPV-positive oral lesions, an overexpression for mdm2, p27 and cathepsin B was found, respectively, in 6 (33%) out of 18 BL, 4 (22%) out of 18 PML and 11 (57,9%) out of 19 ML. In addition, HPV16/18 (11/58%) was detected in OSSC with high expression of all proteins. We conclude that high-risk HPV types might be associated with oral carcinoma, as well as, with the overexpression of mdm2, p27 and cathepsin B. These results suggest that high-risk HPV types might deregulate cell-cycle control, contribuiting to oral carcinogenesis.

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GiocondaEDDM.pdf: 827312 bytes, checksum: dd690ec78d2921013aa0e24b334bac19 (MD5) Previous issue date: 2007-12-14 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this study, a BCR-ABL expressing human chronic myelogenous leukaemia cell line (K562) was used to investigate the antitumoral potential of a novel lectin (CvL) purified from the marine sponge Cliona varians. CvL inhibited the growth of K562 cells with an IC50 value of 70 g/ml, but was ineffective to normal human peripheral blood lymphocytes in the same range of concentrations tested (180 g/ml). Cell death occurred after 72 h of exposure to the lectin and with sign of apoptosis as analysed by DAPI staining. Investigation of the possible effectors of this process showed that cell death occurred in the presence of Bcl-2 and Bax expression, and involved a caspase-independent pathway. Confocal fluorescence microscopy indicated a major role for the lysosomal protease cathepsin B in mediating cell death. Accordingly, pre-incubation of K562 cells with the cathepsin inhibitor L-trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane (E-64) abolished the cytotoxic effect of CvL. Furthermore, we found upregulation of tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and down-modulation of p65 subunit of nuclear factor kappa B (NFB) expression in CvL-treated cells. These effects were accompanied by increased levels of p21 and downmodulation of pRb, suggesting that CvL is capable of cell cycle arrest. Collectively, these findings suggest that cathepsin B acts as death mediator in CvL-induced cytotoxicity possibly in a still uncharacterized connection with the membrane death receptor pathway / Neste trabalho, a linhagem K562 de c?lulas de leucemia miel?ide cr?nica, expressando a prote?na oncog?nica BCR-ABL, foi usada como modelo para investigar a atividade antitumoral da lectina CvL purificada da esponja marinha Cliona varians. CvL inibiu o crescimento de c?lulas K562 com um IC50 de 70 g/mL, mas n?o afetou a viabilidade celular de linf?citos normais de sangue perif?rico humano no mesmo intervalo de concentra??es testadas (1 80 g/mL). A morte celular ocorreu ap?s 72 horas de exposi??o ? lectina e com altera??es nucleares t?picas de apoptose como analisado pela fluoresc?ncia de DAPI. Investiga??o dos poss?veis efetores deste processo mostrou que a morte celular ocorreu sem ativa??o de caspases e na presen?a de express?es aumentadas de Bcl-2 e Bax. O fato de CvL desencadear a libera??o de catepsina B, como evidenciado pela microscopia de fluoresc?ncia, e do inibidor E-64 bloquear completamente a morte celular induzida por CvL, sugerem papel central dessa protease lisossomal na ativa??o de uma via alternativa de morte celular. CvL tamb?m induziu o aumento de express?o do receptor de morte TNFR-1 e a diminui??o dos n?veis de NFκB. Estes efeitos foram acompanhados pelo aumento significativo na express?o de p21 e pela modula??o negativa de pRb, mostrando que CvL foi capaz de bloquear a progress?o do ciclo celular. Juntos, estes dados sugerem que catepsina B age como mediador da citotoxicidade induzida por CvL possivelmente atrav?s de uma conex?o ainda n?o caracterizada com a via dos receptores de morte

A L-Asparaginase II de Escherichia coli (EcA II) é uma enzima amplamente utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), atuando na depleção do aminoácido L-asparagina, o qual é fundamental para a multiplicação das células cancerosas. Contudo, o tratamento com a EcA II está associado a altos índices de hipersensibilidade, devido à formação de anticorpos anti-L-asparaginase e à clivagem da enzima pelas proteases sanguíneas asparagina endopeptidase (AEP) e catepsina B (CTSB). Também ocorre neurotoxicidade associada ao efeito L-glutaminase da enzima. O principal objetivo do presente trabalho é a obtenção de mutantes da EcA II (gene ansB) com equivalente eficiência catalítica, maior resistência à clivagem proteolítica e menor atividade glutaminase. Para este propósito, através da reação em cadeia da polimerase propensa a erro (epPCR) do gene ansB, foi construída uma biblioteca de 1128 clones expressos no vetor pET15b em BL21(DE3). Nenhum mutante com atividade asparaginásica equivalente à EcA II selvagem apresentou atividade glutaminásica inferior à esta. Dentre os clones triados obtivemos um mutante (T161I) resistente à clivagem proteolítica pela CTSB e dois mutantes (Q190L e P40S/S206C) resistentes à clivagem proteolítica por ambas AEP e CTSB. Estes três mutantes apresentaram atividade asparaginásica e glutaminásica equivalentes a EcA II selvagem. Nossos resultados mostram promissoras possibilidades de EcA II mutantes com maior estabilidade frente às proteases sanguíneas humanas e possivelmente menos imunogênicas. / Escherichia coli L-asparaginase (EcA II) is an enzyme widely used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), acting in the depletion of the amino acid L-asparagine, which is essential for cancer cells proliferation. However, treatment with L-asparaginase is associated with a high rate of hypersensitivity, due to formation of anti-L-asparaginase antibody and the enzyme cleavage by the serum proteases asparagine endopeptidase (AEP) and cathepsin B (CTSB). Furthermore, the neurotoxicity is associated with the effect of the enzyme L-glutaminase activity. The main aim of the current work is to obtain variants of EcA II (gene ansB) with an equivalent catalytic efficiency, greater resistance to proteolytic cleavage and a reduced glutaminase activity. For such purpose, through error-prone polymerase chain reaction (epPCR) of gene ansB, a library of 1128 clones was constructed in pET15b vector and expressed in BL21(DE3). None mutant with an asparaginase activity equivalent to EcA II wild type showed a reduced glutaminase activity. Among the screened clones, one mutant (T161I) was resistant to CTSB proteolytic cleavage and two mutants (Q190L e P40S/S206C) were resistant to both CTSB and AEP proteolytic cleavages. These three mutants were EcA II wild type equivalents in asparaginase and glutaminase activities. Our data show promising new possibilities of mutant EcA II presenting higher stability against human serum proteolytic cleavage and maybe lower immunogenicity.