Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-10-21T18:46:59Z No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) Previous issue date: 2008 / A renina é uma aspartil protease sintetizada in vivo pela remoção proteolítica do prósegmento amino-terminal de seu precursor, a pró-renina. A catepsina B, uma tiol protease, tem sido sugerida como candidata à enzima conversora de pró-renina devido à sua colocalização com a renina nos grânulos secretórios e também pela sua capacidade de processar a pró-renina em renina in vitro e em cultura de células. Vetores de expressão de pró-renina selvagem (WT) e mutantes foram co-transfectados com catepsina B em células hipofisárias de ratos GH4C1, que naturalmente não converte pró-renina em renina. Mutações pontuais foram utilizadas para identificar quais aminoácidos presentes no sítio de clivagem da pró-renina são reconhecidos pela catepsina B. Experimentos de pulse-chase foram realizados para rastrear se a pró-renina radiomarcada é capaz de seguir para os grânulos secretórios das células GH4C1. Para investigar se a pró-renina humana poderia ativar o promotor do Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) em cardiomiócitos de ratos neonatos, essas células foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter BNP-luciferase com (ou sem) angiotensinogênio humano. Os cardiomiócitos foram co-incubados com as células não-aderentes U937 transfectadas com pró-renina humana WT ou mutantes (-1-2 ou +5). Os cardiomiócitos foram lisados 96 horas após a eletroporação para a análise de geração de luciferase. Células não-transfectadas U937 foram usadas como grupo controle. Captopril e Losartan (10-7 M) foram usados para testar a participação da enzima conversora de angiotensina (ECA) e dos receptores AT1. Os resultados demonstraram que mutações pontuais na metionina -3(M/A), lisina -2(K/A) e leucina +2(L/A) reduzem o processamento da pró-renina pela catepsina B. Além disso, a remoção da cadeia glicosídica na asparagina +5 aumenta a conversão de pró-renina, sugerindo que a glicosilação poderia impedir o processamento enzimático da pró-renina. Nos experimentos de pulse-chase, a pró-renina não foi direcionada aos grânulos secretórios e a presença de catepsina B não alterou esse resultado, indicando que o processamento de pró-renina provavelmente ocorre fora dessas organelas. A pró-renina WT secretada pelas células U937 é capaz de ativar o promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos transfectados com angiotensinogênio humano. O par de aminoácidos básicos arginina-lisina e a cadeia glicosídica +5 parecem ser tão importantes quanto a atividade enzimática da ECA e os receptores AT1 para a ativação do promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos neonatos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Renin is an aspartyl protease synthesized in vivo by proteolytic removal of amino-terminal prosegment of its precursor, prorenin. Cathepsin B, a thiol protease, has been proposed to be a good candidate for prorenin processing enzyme because of its co-localization with renin in secretory granules and also by its ability to activate prorenin in vitro and in cell culture. It was co-transfected vectors expressing wild type and mutant prorenins with cathepsin B in rat pituitary GH4C1 cells, which normally do not activate prorenin into renin unless cotransfected with a prorenin processing enzyme. Scanning mutagenesis was used to identify which amino acids at prorenin cleavage site are specifically recognized by cathepsin B. Pulsechase experiments were performed to follow whether radiolabeled prorenin is sorted to secretory granules. To investigate whether human prorenin could activate the Brain Natriuretic Peptide promoter (BNP) in neonatal rat cardiomyocytes, these cells were cotransfected with a reporter gene BNP-luciferase associated or not with a human angiotensinogen. The cardiomyocytes were co-incubated with no adherent U937 cells transfected with human prorenin wild type (WT) or mutants (-1-2 or +5). Cardiomyocytes were lysated 96 hours after electroporation for luciferase generation analysis. No transfected U937 cells were used as a control group. Captopril and Losartan at 10-7 M were used to test angiotensin converting enzyme (ACE) and AT1 receptors participation in this process. The results demonstrated that single mutations at - 3 methionine (M/A), -2 lysine (K/A) and +3 leucine (L/A) reduced prorenin processing by cathepsin B. Moreover, removal of N-linked oligosaccharides at +5 asparagine enhanced prorenin conversion by cathepsin B, showing that glycosylation seems impair enzymatic prorenin processing. In pulse-chase experiments, prorenin was not targeted to secretory granules and cathepsin B co-transfection did not changed this sorting, indicating that prorenin processing probably occurs outside these organelles. These findings suggest that cathepsin B removes prorenin prosegment at correct cleavage site and this proteolysis occurs outside the dense core granules. Prorenin WT secreted by U937 cells could activate the BNP promoter in rat cardiomyocytes transfected with human angiotensinogen. Dibasic arginine-lisine prorenin amino acids and N-linked glycosilation seems to be important as well as ACE enzymatic activity and AT1 receptors for BNP promoter activation.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of present study was to investigate (Pro)renin receptor function in the theca and granulosa cells during the preovulatory period and luteinization in cattle. During the initial preovulatory period, prorenin induced the resumption of oocyte meiosis even in the presence of follicular hemisections or forskolin. In granulosa cells, pró-renina did not increase LHinduced epiregulin (EREG) mRNA after 6 h of culture. Treatment with prorenin plus LH increased amphiregulin (AREG) and prostaglandin synthase 2 (PTGS2) mRNA in granulosa cells. The absence of prorenin effect to stimulate EREG, AREG, and PTGS2 in granulosa cells was established using different combinations of treatments with prorenin and/or aliskiren ([P]RR inhibitor) and/or LH. Treatment of granulosa cells with LH plus EGFR antagonist (AG1478) did not regulate prorenin and (P)RR after 6 h of culture. This result was confirmed in vivo using a model of intrafollicular treatment with AG1478 and intramuscular treatment with GnRH. Finally, (P)RR protein and transcripts for prorenin and pro-fibrotic genes increased in the granulosa cells from 12 h post-GnRH. In the theca cells, (P)RR mRNA and protein increased 6 h after treatment of cows with GnRH. The LH effect to stimulate (P)RR transcript was confirmed in vitro. Intrafollicular treatment with aliskiren did not reduce the ovulation rate. In cultured theca cells, AREG and EREG mRNA were not significantly expressed and ADAM17 was not stimulated by prorenin. Intrafollicular injection of AG1478 did not regulate LH-induced (P)RR, although increased CYP17A1 protein. Prorenin did not induce androstenedione and testosterone synthesis in cultured theca cells. In the corpus luteum, prorenin and (P)RR mRNA were increased at day 10 of estrous cycle compared to day 5, but were not regulated by prostaglandin in vivo, as observed for profibrotic genes. Intrafollicular treatment with aliskiren reduces serum progesterone levels in cows that ovulated. Prorenin role in progesterone synthesis through (P)RR was also evidenced in vitro. Moreover, prorenin induced ERK1/2 phosphorylation in luteal cells, although ERK1/2 inhibition (PD0325901) did not completely inhibit prorenin-induced progesterone synthesis, as evidenced using AG1478. In summary, these results demonstrate that prorenin and (P)RR are stimulated by LH at the end of the preovulatory period and, therefore, they are not related to genes regulated by LH at the initial ovulatory process in granulosa cells; (P)RR is stimulated by LH in the theca cells independently of EGFR; and prorenin stimulate progesterone synthesis through (P)RR, which involves ERK1/2 and EGFR participation. In conclusion, (P)RR is upregulated in granulosa and theca cells after gonadotropins peak and prorenin/(P)RR play an important role in the resumption of oocyte meiosis and on progesterone synthesis in the corpus luteum in cattle. / O objetivo do presente trabalho foi investigar a função do receptor de (pro)renina [(P)RR] nas células da teca e da granulosa durante o período pré-ovulatório e luteinização em bovinos. No início do período pré-ovulatório, pró-renina reiniciou a meiose oocitária bloqueada tanto pelas metades foliculares, quanto por forscolina. Nas células da granulosa, pró-renina não aumentou a expressão de RNAm para epirregulina (EREG) que foi induzido por LH após 6 horas de cultivo. Pró-renina mais LH aumentaram a expressão de RNAm para anfirregulina (AREG) e prostaglandina endoperoxidase sintetase-2 (PTGS2). Contudo, a ausência do efeito de prórenina para estimular o RNAm para EREG, AREG e PTGS2 nas células da granulosa foi evidenciada utilizando as diferentes combinações de tratamento com pró-renina e/ou alisquireno [inibidor do (P)RR] e/ou LH. O tratamento das células da granulosa com LH e antagonista de EGFR (AG1478) não regularam o RNAm para pró-renina e (P)RR após 6 horas de cultivo. Esse resultado foi confirmado in vivo, utilizando um modelo de tratamento intrafolicular com AG1478 e GnRH intramuscular em vacas. Por fim, (P)RR e o RNAm para pró-renina e genes prófibróticos aumentaram nas células da granulosa a partir das 12 horas após tratamento de vacas com GnRH. Nas células da teca, a expressão de (P)RR aumentaram 6 horas após tratamento de vacas com GnRH. O estimulo de LH sobre o transcrito de (P)RR foi confirmado in vitro. O tratamento intrafolicular com alisquireno não reduziu a taxa de ovulação. No nosso cultivo de células da teca, a expressão de RNAm para AREG e EREG não foi significativa e ADAM17 não foi estimulado por pró-renina. Injeção intrafolicular com AG1478 não regulou (P)RR estimulado por LH, mas aumentou a proteína para CYP17A1. Pró-renina não induziu a síntese de androstenediona e testosterona no nosso sistema de cultivo. No corpo lúteo, RNAm para pró-renina e (P)RR foi aumentado no dia 10 do ciclo estral comparado ao dia 5 e não foram regulados por prostaglandina in vivo, como observado para os genes pró-fibróticos. O tratamento intrafolicular com alisquireno diminuiu os níveis de progesterona plasmática em vacas que ovularam. O papel de pró-renina na síntese de progesterona através de (P)RR também foi evidenciado in vitro. Ainda, pró-renina induziu a phosphorilação de ERK1/2 nas células luteais, embora o bloqueio de ERK1/2 (PD0325901) não inibiu completamente a síntese de progesterona induzida por pró-renina, como evidenciado pelo uso de AG1478. Em resumo, esses resultados demonstram que pró-renina e (P)RR são estimulados por LH no final do período pré-ovulatório e, portanto, não estão relacionados com os genes regulados por LH no início do processo ovulatório nas células da granulosa; (P)RR é estimulado por LH nas células da teca de forma independente de EGFR; e a pró-renina estimula a síntese de progesterona via (P)RR envolvendo a participação de ERK1/2 e EGFR neste processo. Em conclusão, (P)RR é regulado positivamente nas células da granulosa e da teca após o pico de LH e a pró-renina/(P)RR possui um importante papel no reinicio da meiose oocitária e na síntese de progesterona pelo corpo lúteo em bovinos.