A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de Km obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram consideráveis alterações quando comparado entre eles, esse efeito não foi percebido para a eficiência catalítica. Conclui-se que as mutações pouco alteraram a capacidade da enzima converter o subsrato em produto, mas houve significantes alterações no reconhecimento do substrato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que a existência do nucleotídeo está relacionada com o mecanismo de ativação da proteína. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which infects the plant xylem system causing in many cases precocious maturation and diminution of fruits. It is responsible for economically important plant diseases, such as the Citrus Variegated Chlorosis (CVC). Proteases might be involved in the infection process by disrupting plant tissue. Xylellain is a cysteine protease which is differently expressed in strain pathogen and non-pathogen of X. fastidiosa. The 3D structure of xylellain was solved by our group and structural studies show that this protein has a proenzyme form and a ribonucleotideo close to the amine terminal region. Our hypothesis is that protein-nucleotide interactions are related to xylellains activation mechanism. To evaluate the influence of the nucleotide in the functional activity of enzyme, point mutations in aminoacids which interact directly with this ribonucleotide were carried out. The point mutations are phenylalanine 45 (F45) and arginine 43 (R43), individually mutated for alanine (A) residues. One way to quantify the changes caused by the alteration of a nucleotide is the direct comparison between the kinetic enzyme assays of native and mutant proteins. Greater variations between the values of Km than in the values of catalytic efficiency were observed. This suggests that the speed of production varied by enzyme-substrate. However the mutations caused little change on the ability of the protease to catalyze the reaction. This result is in agreement with the hypothesis that the nucleotide provides the structural support for the hinge formation on the N-terminal domain, thus directing the inhibitory peptide inside the active site of the enzyme. Therefore, the nucleotide may be exerting regulatory functions in vivo, possibly in the folding or activation of the protein and performance of catalytic function.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1677.pdf: 3237644 bytes, checksum: 05775a00384d5ed86dce49771ff93425 (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / ABSTRACT Tumor metastasis is usually a major cause of death among cancer patients. Degradation and invasion of the extracellular matrix and basement membrane, key steps in the metastatic process, rely on the activity of proteolytic enzymes. The levels and activities of cathepsins B and L are considerably increased in cancer cells, and have been related to the invasive potential of these cells. Moreover, the levels of their endogenous inhibitors, the cystatins, are decreased, which results in an imbalance that contributes to the development of the metastatic phenotype. Thus, the potential use of cystatins as therapeutic agents in novel anti cancer strategies has been suggested. The sugarcane genome project (SUCEST FAPESP) allowed the identification of about 20 putative cystatins in this plant. In the present study, we describe the heterologous expression, purification and characterization of three cystatins from sugarcane, dubbed as CaneCPI-2, CaneCPI-3 and CaneCPI-4, which showed different inhibitory activities against human cathepsins B and L. While the three recombinant cystatins inhibited cathepsin L activity with Ki values of 0.17, 0.6 and 0.021 nM, respectively, only CaneCPI-4 was capable of efficiently inhibiting cathepsin B activity (Ki = 0.83 nM). Considering the involvement of these cathepsins in tumor cell invasion, the effect of the cystatins on the invasive ability of human breast cancer MDA-MB-231 cells was assessed after the addition of the recombinant cystatins to the cells, and in cell clones expressing the sugarcane cystatins. Overall, the Ki values correlated with the ability of the cystatins to inhibiting the cysteine cathepsin activity of the tumor cells as well as the cell invasion through a Matrigel matrix. A slight reduction in the invasive ability was observed in the MDA-MB-231 cells expressing CaneCPI-4. In addition, a substantial reduction of ~ 60% in the cell invasion was obtained in the presence of 2 µM recombinant CaneCPI-2 or CaneCPI- 3, or 0.2 µM of CaneCPI-4. Finally, the cystatins showed negligible effects on the adhesion and proliferation of the cells. Our results open the possibility of considering these as well as other phytocystatins as therapeutics agents in anti-cancer strategies. / A principal causa de mortalidade em pacientes com câncer está associada ao estabelecimento de metástases pelo organismo. A degradação e invasão da matriz extracelular e lâmina basal, etapas chave no processo da metástase, envolvem a ação de enzimas proteolíticas. Em linhagens de células cancerosas as quantidades e a atividade das catepsinas B e L estão consideravelmente aumentadas, e têm sido correlacionadas ao potencial invasivo destas células. Ao mesmo tempo, as quantidades de seus inibidores endógenos, as cistatinas, estão consideravelmente diminuídas, gerando um desequilíbrio que contribui para o desenvolvimento do fenótipo metastático. Assim, no sentido de restabelecer o equilíbrio existente na célula normal, o uso das cistatinas como possíveis agentes terapêuticos em novas estratégias anti-câncer tem sido sugerido. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST FAPESP) possibilitou a identificação de cerca de 20 possíveis cistatinas nesta planta. No presente trabalho, descreve-se a expressão heteróloga, purificação e caracterização de três cistatinas da cana-de-açúcar, denominadas CaneCPI-2, CaneCPI-3 e CaneCPI-4, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra as catepsinas B e L humanas. Enquanto as três cistatinas inibiram a catepsina L com valores de Ki de 0,17, 0,6 e 0,021 nM, respectivamente, somente a CaneCPI-4 foi capaz de inibir eficientemente a catepsina B (Ki = 0,83 nM). Considerando o envolvimento das catepsinas B e L na invasão das células tumorais, o efeito das cistatinas da cana-de-açúcar sobre a habilidade invasiva da linhagem celular de câncer mamário humano MDA-MB-231 foi avaliado por meio da adição das cistatinas recombinantes às células, e também utilizando células transfectadas com os genes das cistatinas. De modo geral, os valores de Ki correlacionaram-se com a capacidade das cistatinas de inibir a atividade de cisteíno catepsinas das células tumorais, assim como, a invasão celular através de uma matriz de Matrigel. As células que expressavam a cistatina CaneCPI-4 apresentaram uma pequena redução na habilidade invasiva. Por outro lado, uma redução de ~ 60% na invasão celular foi obtida com 2 µM das cistatinas recombinantes CaneCPI-2 ou CaneCPI-3, ou 0,2 µM de CaneCPI-4. Entretanto, as cistatinas não apresentaram nenhum efeito sobre a adesão e a proliferação destas células. Nossos resultados abrem a possibilidade de considerar estas, assim como outras fitocistatinas, como possíveis agentes terapêuticos em estratégias anti-câncer.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de Km obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram consideráveis alterações quando comparado entre eles, esse efeito não foi percebido para a eficiência catalítica. Conclui-se que as mutações pouco alteraram a capacidade da enzima converter o subsrato em produto, mas houve significantes alterações no reconhecimento do substrato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que a existência do nucleotídeo está relacionada com o mecanismo de ativação da proteína. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which infects the plant xylem system causing in many cases precocious maturation and diminution of fruits. It is responsible for economically important plant diseases, such as the Citrus Variegated Chlorosis (CVC). Proteases might be involved in the infection process by disrupting plant tissue. Xylellain is a cysteine protease which is differently expressed in strain pathogen and non-pathogen of X. fastidiosa. The 3D structure of xylellain was solved by our group and structural studies show that this protein has a proenzyme form and a ribonucleotideo close to the amine terminal region. Our hypothesis is that protein-nucleotide interactions are related to xylellains activation mechanism. To evaluate the influence of the nucleotide in the functional activity of enzyme, point mutations in aminoacids which interact directly with this ribonucleotide were carried out. The point mutations are phenylalanine 45 (F45) and arginine 43 (R43), individually mutated for alanine (A) residues. One way to quantify the changes caused by the alteration of a nucleotide is the direct comparison between the kinetic enzyme assays of native and mutant proteins. Greater variations between the values of Km than in the values of catalytic efficiency were observed. This suggests that the speed of production varied by enzyme-substrate. However the mutations caused little change on the ability of the protease to catalyze the reaction. This result is in agreement with the hypothesis that the nucleotide provides the structural support for the hinge formation on the N-terminal domain, thus directing the inhibitory peptide inside the active site of the enzyme. Therefore, the nucleotide may be exerting regulatory functions in vivo, possibly in the folding or activation of the protein and performance of catalytic function.

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais: Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River, Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti, há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária, dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de 11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural (extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal. Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV, para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2 foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal. Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38, em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal. / The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong, Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases, such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4); and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain (Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control. The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿ insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting. RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with histidine tail at the N-terminal portion.

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.

As cisteíno-proteases da família da papaína desempenham funções essenciais em processos biológicos, entre eles o desenvolvimento e crescimento do organismo, vias de sinalização celular e apoptose, invasão de parasitas em células hospedeiras. Assim, trata-se de uma classe de proteínas de grande interesse para as indústrias farmacêuticas, sendo utilizada como alvo para o tratamento de doenças como o câncer e metástases, osteoporose. Disfunções relacionadas ao sistema imune, doenças parasitárias como malária, leishmaniose, doença do sono e doença de Chagas. Esta última é uma enfermidade considerada negligenciada pelas grandes indústrias farmacêuticas, sem nenhum tratamento eficaz e seguro disponível, que gera um problema econômico de mais de sete bilhões de dólares anuais devido à perda de mão de obra e gastos com tratamento para amenizar os efeitos da doença. A cisteíno protease cruzaína de Trypanosoma cruzi, causador da Doença de Chagas, desponta como um alvo validado na busca de novos fármacos contra essa enfermidade. Essa enzima apresenta um par de aspartatos que interagem entre si, para os quais foi predito um pKa de 7, sendo possível a forma desprotonada desse par em condições biológicas. Neste caso, pode levar à exposição de uma nova cavidade por meio do movimento da alça entre os resíduos 57-62, segundo as simulações de dinâmica molecular desse trabalho, que se trata de uma possível candidata a ponto de seletividade de inibidores de cisteínoproteases de parasitos em relação às suas ortólogas em Homo sapiens que não possuem o par de aspartatos. Em pH ácido, foi mostrado por meio de análise de componentes principais de simulações de dinâmica molecular que as cisteíno protease apresentam uma restrição gradual na amostragem conformacional do sítio ativo quando complexadas com as formas não covalente e covalente de inibidores derivados de dipeptidil nitrilas. Isso sugere que esse sistema segue o modelo de seleção conformacional para flexibilidade de proteína. Notou-se também que o perfil de restrição de ligantes que inibem na faixa de nmol.L-1 difere daqueles a µmol.L-1 , o que possibilitou a construção de uma árvore de decisão para identificar os complexos que apresentam afinidade a nmol.L-1 . / The papain-like cysteine proteases are essentials for biological process, performing important roles on the parasite development, growth and also in the parasite invasion process on the host cell, in cellular signaling pathways and apoptosis, among others. Thus, the pharmaceutical industry widely uses this class of protein as target for the development of new drugs, against cancer and metastasis, osteoporosis and immune system disorders, resulting in many approved drugs. Additionally, these enzymes are validated target against parasitic diseases as leishmaniose, malaria and African and American trypanosomiasis. The last one, also known as Chagas\' disease, is neglected disease for which, further a century form this discovery, there is no effective and safe chemotherapy and is responsible for an economic loss of around seven billion dollars in the world per year due to the health care and lost productivity from infected people. Faced with this situation, the Cruzain, a cysteine protease from the Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\' disease, is emerging as interesting and validated target to the search for new drugs against this sickness. This enzyme has a pair of interactiong Asp for which was predicted a pKa of 7, by computational methods. By this way, this pair under neutral to alkaline pH adopts the deprotonated form, which exposed a new cavity through a movement of loop of residues 57-62, as we showed here by molecular dynamics simulations. This cavity emerges as a possible selectivity point of the cruzain inhibitors, once Homo sapiens enzynes does not present the aspartic acid - aspartate pair. In condition of acidic pH, principal component analysis of molecular dynamics simulations showed a gradual reduction of the conformational space covered by the active site of cruzain, cathepsin K and cathepsin L in it free form and complexed with dipeptidyl nitrilelike molecules in it noncovalent e covalent forms. This suggests these systems follows the conformational selection model of protein flexibility. Furthermore, we observed the ligands that inhibits the protein at nmol.L-1 induces the protein flexibility in a similar way, while the µmol.L-1 ones leads to another pattern. That made possible the construction of a decision tree which is able to identify nmol.L-1 from µmol.L-1 complexes.

Nós isolamos e seqüenciamos genes que codificam Catepsina L-like em diversos isolados de T.rangeli de humano, mamíferos silvestres e Rhodnius spp., do centro e sul da América. Análises filogenéticas de seqüências que codificam a proteína madura de T. rangeli, outras espécies de Trypanosoma e Leishmania e duas espécies de bodonídeos, posicionaram T.rangeli próximo a T.cruzi de acordo com a ordem de divergência determinada em filogenias baseadas em SSUrDNA. Uma análise de 17 seqüências do domínio catalítico de CatL-like de isolados representativos da diversidade filogenética e distribuição geográfica de T. rangeli, apoiaram as mesmas linhagens filogenéticas previamente definidas. Seqüências do gene CatL-like também foram usados para padronizar ensaios de PCR para diagnóstico de T. cruzi e T. rangeli. Além disso, um método de genotipagem por PCR multiplex segregou os isolados de T. rangeli nas principais linhagens previamente estabelecidas. Este é o primeiro estudo usando um gene codificador de proteína para comparar isolados de T. rangeli de linhagens distintas. / We have isolated and sequenced genes encoding cathepsin L-like (CatL-like) cysteine proteases from isolates of T. rangeli from human, wild mammals and Rhodnius spp., from Central and South America. Phylogenetic analysis of sequences encoding the mature CatL-like enzymes from T. rangeli (Rangelipain), other Trypanosoma and Leishmania species, and two species of bodonids, positioned T. rangeli closest to T. cruzi corroborating the same order of divergence showed in phylogenies based on SSU rDNA. Analysis of 17 sequences of the catalytic domains of CatL-like genes isolates representative of the phylogenetic diversity and geographical range of T.rangeli supported previously defined phylogenetic lineages. Sequences of CatL-like genes were used to standardize PCR assays for the diagnosis of T. rangeli and T. cruzi, and a genotyping method of multiplex-PCR distributed of isolates of T. rangeli in the major phylogenetic lineages previously established. This is the first study using protein-encoding genes to compare isolates from T. rangeli of distinct lineages.

As cisteíno-proteases da família da papaína desempenham funções essenciais em processos biológicos, entre eles o desenvolvimento e crescimento do organismo, vias de sinalização celular e apoptose, invasão de parasitas em células hospedeiras. Assim, trata-se de uma classe de proteínas de grande interesse para as indústrias farmacêuticas, sendo utilizada como alvo para o tratamento de doenças como o câncer e metástases, osteoporose. Disfunções relacionadas ao sistema imune, doenças parasitárias como malária, leishmaniose, doença do sono e doença de Chagas. Esta última é uma enfermidade considerada negligenciada pelas grandes indústrias farmacêuticas, sem nenhum tratamento eficaz e seguro disponível, que gera um problema econômico de mais de sete bilhões de dólares anuais devido à perda de mão de obra e gastos com tratamento para amenizar os efeitos da doença. A cisteíno protease cruzaína de Trypanosoma cruzi, causador da Doença de Chagas, desponta como um alvo validado na busca de novos fármacos contra essa enfermidade. Essa enzima apresenta um par de aspartatos que interagem entre si, para os quais foi predito um pKa de 7, sendo possível a forma desprotonada desse par em condições biológicas. Neste caso, pode levar à exposição de uma nova cavidade por meio do movimento da alça entre os resíduos 57-62, segundo as simulações de dinâmica molecular desse trabalho, que se trata de uma possível candidata a ponto de seletividade de inibidores de cisteínoproteases de parasitos em relação às suas ortólogas em Homo sapiens que não possuem o par de aspartatos. Em pH ácido, foi mostrado por meio de análise de componentes principais de simulações de dinâmica molecular que as cisteíno protease apresentam uma restrição gradual na amostragem conformacional do sítio ativo quando complexadas com as formas não covalente e covalente de inibidores derivados de dipeptidil nitrilas. Isso sugere que esse sistema segue o modelo de seleção conformacional para flexibilidade de proteína. Notou-se também que o perfil de restrição de ligantes que inibem na faixa de nmol.L-1 difere daqueles a µmol.L-1 , o que possibilitou a construção de uma árvore de decisão para identificar os complexos que apresentam afinidade a nmol.L-1 . / The papain-like cysteine proteases are essentials for biological process, performing important roles on the parasite development, growth and also in the parasite invasion process on the host cell, in cellular signaling pathways and apoptosis, among others. Thus, the pharmaceutical industry widely uses this class of protein as target for the development of new drugs, against cancer and metastasis, osteoporosis and immune system disorders, resulting in many approved drugs. Additionally, these enzymes are validated target against parasitic diseases as leishmaniose, malaria and African and American trypanosomiasis. The last one, also known as Chagas\' disease, is neglected disease for which, further a century form this discovery, there is no effective and safe chemotherapy and is responsible for an economic loss of around seven billion dollars in the world per year due to the health care and lost productivity from infected people. Faced with this situation, the Cruzain, a cysteine protease from the Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\' disease, is emerging as interesting and validated target to the search for new drugs against this sickness. This enzyme has a pair of interactiong Asp for which was predicted a pKa of 7, by computational methods. By this way, this pair under neutral to alkaline pH adopts the deprotonated form, which exposed a new cavity through a movement of loop of residues 57-62, as we showed here by molecular dynamics simulations. This cavity emerges as a possible selectivity point of the cruzain inhibitors, once Homo sapiens enzynes does not present the aspartic acid - aspartate pair. In condition of acidic pH, principal component analysis of molecular dynamics simulations showed a gradual reduction of the conformational space covered by the active site of cruzain, cathepsin K and cathepsin L in it free form and complexed with dipeptidyl nitrilelike molecules in it noncovalent e covalent forms. This suggests these systems follows the conformational selection model of protein flexibility. Furthermore, we observed the ligands that inhibits the protein at nmol.L-1 induces the protein flexibility in a similar way, while the µmol.L-1 ones leads to another pattern. That made possible the construction of a decision tree which is able to identify nmol.L-1 from µmol.L-1 complexes.

A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), ΔH,ΔG,ΔS e ΔCp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( ΔG) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de ΔCp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de ΔHITC com ΔHvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), ΔH, ΔG, ΔS and ΔCp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (ΔG) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The ΔCp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its ΔHITC relationship with ΔHvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.