A catepsina L, uma cisteína proteinase da família da papaína, é a principal proteinase digestiva do besouro Tenebrio molitor. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que existem três catepsinas L no intestino médio do T. molitor, uma delas é lisossômica (CAL 1) e as outras duas são digestivas (CAL 2 e CAL 3). As estruturas 3D das enzimas digestivas foram recentemente elucidadas. Com o objetivo de estudar em detalhes as propriedades das enzimas digestivas, CAL 3 foi expressa como um zimógeno em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade e autoativada em meio ácido. Foram realizados ensaios de atividade com 63 peptídeos FRET derivados da sequência Abz-KLRSSKQ-EDDnp em um espectrofluorímetro termostatizado a 30 ºC, monitorando-se continuamente a variação de fluorescência em 320 nm (λex) e 420 nm (λem). Os parâmetros kcat e KM obtidos foram utilizados na determinação da hidrofobicidade dos subsítios (H) e da função de cada subsítio através da razão das energias livres de ativação do complexo enzima-substrato (ΔG‡T) e de ligação da enzima com o substrato (ΔGs). Os resultados mostram que o subsítio S2 está envolvido prioritariamente em catálise e é bastante seletivo para substratos com resíduos hidrofóbicos em P2. Esse subsítio é o mais hidrofóbico dentre os analisados, encontrando-se num bolsão localizado no interior da enzima. O subsítio S\'2, por outro lado, é o que apresentou a menor especificidade dentre os analisados. Este subsítio está envolvido prioritariamente na ligação com o substrato e se localiza na superfície da enzima, o que pode facilitar a acomodação de diferentes cadeias laterais em P\'2 do substrato, não oferecendo muitas restrições espaciais. O subsítio S1, hidrofílico, não é muito seletivo, o que pode ser consequência de sua localização na superfície da enzima. Esse subsítio está prioritariamente envolvido na ligação com o substrato. O subsítio S\'1, assim como S1, está localizado na superfície da enzima, é hidrofílico e não muito seletivo. No entanto, esse subsítio tem papel na catálise além de atuar na ligação do substrato. Numa análise inicial da estrutura 3D deste subsítio, sua função catalítica foi atribuída à presença de parte da cavidade oxiânica. Uma enzima com mutação no resíduo W187, pertencente à cavidade oxiânica e a S\'1, foi produzida e purificada, no entanto essa enzima não apresentou atividade. Uma análise mais aprofundada mostrou que a falta de atividade pode ser atribuída ao fato do resíduo de aminoácido mutado fazer parte de um cluster aromático essencial à estabilização da tríade catalítica. Os dados obtidos na caracterização de S\'1 e S\'2 permitem inferir que a acilação é o passo limitante da reação da CAL 3. Além disso, os resultados deste trabalho mostram que o conceito de hidrofobicidade de subsítios proposto anteriormente pelo grupo parece ser aplicável a subsítios que apresentem especificidades mais restritas. / Cathepsin L, a cysteine proteinase of the papain family, is the major digestive proteinase in the beetle Tenebrio molitor. Previous studies of our group showed that there are three cathepsins L in T. molitor midgut, one is lysosomal (CAL1) and two are digestive (CAL2 and CAL3). The 3D structures of the digestive enzymes were recently elucidated. With the aim to study in details the digestive enzymes specificities, CAL3 was expressed in E. coli as a zymogen, purified by affinity chromatography and autoactivated in acid conditions. Activity assays were performed in a thermostated spectrofluorometer at 30 ºC with 63 FRET peptides derived from the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp, continuously monitoring the fluorescence changes at 320 nm (λex) and 420 nm (λem). The parameters kcat and KM were used in the determination of subsite hydrophobicity (H) and subsite role based on the ratio of complex enzyme-substrate activation energy (ΔG‡T) and free energy of substrate binding (ΔGs). The data obtained suggest that the S2 is mainly involved in catalysis and is very selective to substrates with hydrophobic residues in P2. This subsite is the most hydrophobic among the analyzed and is located in a pocket in the enzyme interior. S\'2, on the other hand, is the less selective subsite and is mainly involved in substrate binding and is located on the enzyme surface, what can ease the accommodation of different side chains located in P\'2 by not imposing many spatial restrictions. S1, is hydrophilic and not very selective, what may be a consequence of its location on the enzyme surface. This subsite is mainly involved in substrate binding. S\'1, just like S1, is located on the enzyme surface, is hydrophilic and not very selective. However this subsite has a role in catalysis besides the role in substrate binding. In an initial 3D structure analysis its catalytic function was attributed to the presence of a part of the oxyanion hole. An enzyme with mutation in the residue W187, which apparently belonged both to the oxyanion hole and S\'1, was produced and purified, but this enzyme was inactive. A better analysis showed that the lack of activity can be attributed to the fact that the mutated residue belongs to an aromatic cluster that is essential to the catalytic triad stabilization. The data obtained in S\'1 and S\'2 characterization suggest that acylation is the limiting step in CAL 3 reaction. The results presented in this work support the concept of subsite hydrophobicity previously proposed by our group, which seems to be true to subsites with more restrict specificities

Nós isolamos e seqüenciamos genes que codificam Catepsina L-like em diversos isolados de T.rangeli de humano, mamíferos silvestres e Rhodnius spp., do centro e sul da América. Análises filogenéticas de seqüências que codificam a proteína madura de T. rangeli, outras espécies de Trypanosoma e Leishmania e duas espécies de bodonídeos, posicionaram T.rangeli próximo a T.cruzi de acordo com a ordem de divergência determinada em filogenias baseadas em SSUrDNA. Uma análise de 17 seqüências do domínio catalítico de CatL-like de isolados representativos da diversidade filogenética e distribuição geográfica de T. rangeli, apoiaram as mesmas linhagens filogenéticas previamente definidas. Seqüências do gene CatL-like também foram usados para padronizar ensaios de PCR para diagnóstico de T. cruzi e T. rangeli. Além disso, um método de genotipagem por PCR multiplex segregou os isolados de T. rangeli nas principais linhagens previamente estabelecidas. Este é o primeiro estudo usando um gene codificador de proteína para comparar isolados de T. rangeli de linhagens distintas. / We have isolated and sequenced genes encoding cathepsin L-like (CatL-like) cysteine proteases from isolates of T. rangeli from human, wild mammals and Rhodnius spp., from Central and South America. Phylogenetic analysis of sequences encoding the mature CatL-like enzymes from T. rangeli (Rangelipain), other Trypanosoma and Leishmania species, and two species of bodonids, positioned T. rangeli closest to T. cruzi corroborating the same order of divergence showed in phylogenies based on SSU rDNA. Analysis of 17 sequences of the catalytic domains of CatL-like genes isolates representative of the phylogenetic diversity and geographical range of T.rangeli supported previously defined phylogenetic lineages. Sequences of CatL-like genes were used to standardize PCR assays for the diagnosis of T. rangeli and T. cruzi, and a genotyping method of multiplex-PCR distributed of isolates of T. rangeli in the major phylogenetic lineages previously established. This is the first study using protein-encoding genes to compare isolates from T. rangeli of distinct lineages.

A catepsina L, uma cisteína proteinase da família da papaína, é a principal proteinase digestiva do besouro Tenebrio molitor. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que existem três catepsinas L no intestino médio do T. molitor, uma delas é lisossômica (CAL 1) e as outras duas são digestivas (CAL 2 e CAL 3). As estruturas 3D das enzimas digestivas foram recentemente elucidadas. Com o objetivo de estudar em detalhes as propriedades das enzimas digestivas, CAL 3 foi expressa como um zimógeno em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade e autoativada em meio ácido. Foram realizados ensaios de atividade com 63 peptídeos FRET derivados da sequência Abz-KLRSSKQ-EDDnp em um espectrofluorímetro termostatizado a 30 ºC, monitorando-se continuamente a variação de fluorescência em 320 nm (λex) e 420 nm (λem). Os parâmetros kcat e KM obtidos foram utilizados na determinação da hidrofobicidade dos subsítios (H) e da função de cada subsítio através da razão das energias livres de ativação do complexo enzima-substrato (ΔG‡T) e de ligação da enzima com o substrato (ΔGs). Os resultados mostram que o subsítio S2 está envolvido prioritariamente em catálise e é bastante seletivo para substratos com resíduos hidrofóbicos em P2. Esse subsítio é o mais hidrofóbico dentre os analisados, encontrando-se num bolsão localizado no interior da enzima. O subsítio S\'2, por outro lado, é o que apresentou a menor especificidade dentre os analisados. Este subsítio está envolvido prioritariamente na ligação com o substrato e se localiza na superfície da enzima, o que pode facilitar a acomodação de diferentes cadeias laterais em P\'2 do substrato, não oferecendo muitas restrições espaciais. O subsítio S1, hidrofílico, não é muito seletivo, o que pode ser consequência de sua localização na superfície da enzima. Esse subsítio está prioritariamente envolvido na ligação com o substrato. O subsítio S\'1, assim como S1, está localizado na superfície da enzima, é hidrofílico e não muito seletivo. No entanto, esse subsítio tem papel na catálise além de atuar na ligação do substrato. Numa análise inicial da estrutura 3D deste subsítio, sua função catalítica foi atribuída à presença de parte da cavidade oxiânica. Uma enzima com mutação no resíduo W187, pertencente à cavidade oxiânica e a S\'1, foi produzida e purificada, no entanto essa enzima não apresentou atividade. Uma análise mais aprofundada mostrou que a falta de atividade pode ser atribuída ao fato do resíduo de aminoácido mutado fazer parte de um cluster aromático essencial à estabilização da tríade catalítica. Os dados obtidos na caracterização de S\'1 e S\'2 permitem inferir que a acilação é o passo limitante da reação da CAL 3. Além disso, os resultados deste trabalho mostram que o conceito de hidrofobicidade de subsítios proposto anteriormente pelo grupo parece ser aplicável a subsítios que apresentem especificidades mais restritas. / Cathepsin L, a cysteine proteinase of the papain family, is the major digestive proteinase in the beetle Tenebrio molitor. Previous studies of our group showed that there are three cathepsins L in T. molitor midgut, one is lysosomal (CAL1) and two are digestive (CAL2 and CAL3). The 3D structures of the digestive enzymes were recently elucidated. With the aim to study in details the digestive enzymes specificities, CAL3 was expressed in E. coli as a zymogen, purified by affinity chromatography and autoactivated in acid conditions. Activity assays were performed in a thermostated spectrofluorometer at 30 ºC with 63 FRET peptides derived from the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp, continuously monitoring the fluorescence changes at 320 nm (λex) and 420 nm (λem). The parameters kcat and KM were used in the determination of subsite hydrophobicity (H) and subsite role based on the ratio of complex enzyme-substrate activation energy (ΔG‡T) and free energy of substrate binding (ΔGs). The data obtained suggest that the S2 is mainly involved in catalysis and is very selective to substrates with hydrophobic residues in P2. This subsite is the most hydrophobic among the analyzed and is located in a pocket in the enzyme interior. S\'2, on the other hand, is the less selective subsite and is mainly involved in substrate binding and is located on the enzyme surface, what can ease the accommodation of different side chains located in P\'2 by not imposing many spatial restrictions. S1, is hydrophilic and not very selective, what may be a consequence of its location on the enzyme surface. This subsite is mainly involved in substrate binding. S\'1, just like S1, is located on the enzyme surface, is hydrophilic and not very selective. However this subsite has a role in catalysis besides the role in substrate binding. In an initial 3D structure analysis its catalytic function was attributed to the presence of a part of the oxyanion hole. An enzyme with mutation in the residue W187, which apparently belonged both to the oxyanion hole and S\'1, was produced and purified, but this enzyme was inactive. A better analysis showed that the lack of activity can be attributed to the fact that the mutated residue belongs to an aromatic cluster that is essential to the catalytic triad stabilization. The data obtained in S\'1 and S\'2 characterization suggest that acylation is the limiting step in CAL 3 reaction. The results presented in this work support the concept of subsite hydrophobicity previously proposed by our group, which seems to be true to subsites with more restrict specificities

Nós isolamos e seqüenciamos genes que codificam Catepsina L-like em diversos isolados de T.rangeli de humano, mamíferos silvestres e Rhodnius spp., do centro e sul da América. Análises filogenéticas de seqüências que codificam a proteína madura de T. rangeli, outras espécies de Trypanosoma e Leishmania e duas espécies de bodonídeos, posicionaram T.rangeli próximo a T.cruzi de acordo com a ordem de divergência determinada em filogenias baseadas em SSUrDNA. Uma análise de 17 seqüências do domínio catalítico de CatL-like de isolados representativos da diversidade filogenética e distribuição geográfica de T. rangeli, apoiaram as mesmas linhagens filogenéticas previamente definidas. Seqüências do gene CatL-like também foram usados para padronizar ensaios de PCR para diagnóstico de T. cruzi e T. rangeli. Além disso, um método de genotipagem por PCR multiplex segregou os isolados de T. rangeli nas principais linhagens previamente estabelecidas. Este é o primeiro estudo usando um gene codificador de proteína para comparar isolados de T. rangeli de linhagens distintas. / We have isolated and sequenced genes encoding cathepsin L-like (CatL-like) cysteine proteases from isolates of T. rangeli from human, wild mammals and Rhodnius spp., from Central and South America. Phylogenetic analysis of sequences encoding the mature CatL-like enzymes from T. rangeli (Rangelipain), other Trypanosoma and Leishmania species, and two species of bodonids, positioned T. rangeli closest to T. cruzi corroborating the same order of divergence showed in phylogenies based on SSU rDNA. Analysis of 17 sequences of the catalytic domains of CatL-like genes isolates representative of the phylogenetic diversity and geographical range of T.rangeli supported previously defined phylogenetic lineages. Sequences of CatL-like genes were used to standardize PCR assays for the diagnosis of T. rangeli and T. cruzi, and a genotyping method of multiplex-PCR distributed of isolates of T. rangeli in the major phylogenetic lineages previously established. This is the first study using protein-encoding genes to compare isolates from T. rangeli of distinct lineages.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.