Peroxidase de rábano (\"horseradish peroxidase - HRP), atuando como uma oxidase frente a substratos apropriados, catalisa a formação de espécies eletronicamente excitadas triplete. Os produtos obtidos são os esperados da clivagem de um intermediário 1,2-dioxetânico hipotético. Espécies tripletes geradas enzimaticamente são capazes de transferir energia a vários aceptores incluindo macromoléculas tais como: fitocromo, RNA, DNA e proteínas, além de organelas como cloroplastos. Acompanhamos a oxidação aeróbica de aldeídos alifáticos lineares (C2-C6) catalisada pela HRP; esta reação gera o aldeído inferior (Cn-1) no estado excitado triplete e ácido fórmico. Dois aspectos principais são abordados neste trabalho: (i) análise dos resultados em base ao comprimento da cadeia carbônica do substrato (C2 → C6) e (ii) a procura de emissões sensitizadas em estruturas biológicas (cloroplastos e microsomas). - Oxidação aeróbica dos aldeídos alifáticos lineares C2-C6 catalisada pela HRP. Corantes xantênicos e clorofila a solubilizada em micelas foram utilizados para monitorar estados eletronicamente excitadas geradas pela oxidação aeróbica dos aldeídos alifáticos lineares catalisada pela HRP. Quando eosina é o aceptor fluorescente, máxima emissão ocorre com butanal. Este resultado é discutido em conecçao com o fato de que uma série de efeitos biológicos de ácidos alifáticos lineares são máximos com o ácido butírico. A possível paticipação de estados excitados no processo que desencadeia as atividades biológicas deste ácido é sugerida. - TransferêncIa de energia para cloroplastos. Aldeídos alifáticos lineares (C2-C6) promovem emissão em cloroplastos na região de fluorescência de clorofila. Esta habilidade deve provavelmente constituir um caso de \"luminescência escura\" (\"dark luminescence\") . Se HRP estiver presente o aldeído (Cn) é oxidado ao homólogo inferior (Cn-1) no estado triplete, o qual sensitiza direta e/ou indiretamente a fluorescência de clorofila. Clorofila excitada por este processo é incapaz de reduzir um aceptor de Hill. - Quimioluminescência de microsomas expostos à oxidação aeróbica de aldeídos lineares catalisada pela HRP. Microsomas expostos ao sistema propanal/HRP/O2 desenvolvem luminescência de baixa intensidade. Este processo emissivo é distinto daquele originário durante a peroxidação de lipídeos uma vez que: (i ) a emissão se situa próxima a 560 nm e não na região espectral do vermelho (como esperado para a emissão bimol de oxigênio singlete) e (ii) não há formação de malonaldeído. Acetaldeído triplete parecer ser a espécie responsável pela indução deste processo através da excitação de algum componente microsomal, possivelmente uma flavoproteína. / Horseradish peroxidase (HRP), acting as anoxidase upon appropriate substrates, promotes the formation of electronically excite triplet species. The products obtained are those which would be expected from the cleavage of a hypothetical 1,2 dioxetane intermediate. Enzyme-generated triplet species are able to transfer energy to several acceptors, including macromolecules such as phytochrome, RNA, DNA and proteins, as well as to organeles such as chloroplasts. In the present study, we investigated the HRP-catalyzed aerobic oxidation of linear aliphatic aldehydes (C2 to C6), a reaction which generates the next lower aldehyde in the triplet state and formic acid. Two main aspects were emphasized in this work: (i ) the dependence of the results of the length of the carbonic chain of the substrate (C2 to C6) and (ii) the possibility of inducing sensitized emission from biological structures (chloroplasts and microsomes). HRP-catalyzed aerobic oxidation of aliphatic aldehydes. Xanthene dyes and micelle-solubilized chlorophyll-a were used to monitor the electronically excited species generated by the peroxidase-catalyzed aerobic oxidation of C2-C6 linear aldehydes. Maximal emission occurs with butanal as substrate and eosine as the fluorescent acceptor. This result is discussed in connection with the fact that the multiple biological effects of short chain aliphatic acids are maximal for butyric acid. Our observations strengthen the case for a possible role of excited state formation in the biological activity butyrate. Energy transfer to chloroplasts Linear aldehydes trigger red emission from chloroplasts. If horseradish peroxidase is also present, the aldehyde is oxidized to the next lower homolog in the triplet state, which in turn sensitizes (directly or indirectly) chlorophyll fluorescence. This phenomenon probably is a case of \"dark luminescence\"; the chlorophyll excited by this process is unable to reduce a Hill acceptor. MIicrosomal luminescence elicited by enzymatic systems that generate triplet species. Microsomes exposed to the propanal/HRP/02 system develop a weak luminescence. The underlying process is distinct from that occuring during lipid peroxidation because the emission intensity peaks at around 560 nm rather than in the red (as would be expected for bimol singlet oxygen emission) and no malonaldehyde is formed. Triplet acetaldehyde appears to be responsible for initiating the process, which in turn leads to excitation of a component of microsomes, possibly a flavoprotein.

A enzima glutationa peroxidase (GPx-1) possui um importante papel na detoxificação de espécies reativas de oxigênio. Neste estudo foi verificada a influência do polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 nos níveis de malondialdeído (MDA) e proteínas carboniladas de 84 voluntários expostos ambientalmente ao chumbo (28 homens e 56mulheres; idade: 18 a 60 anos). Os genótipos para o polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 foram determinados por PCR seguido por digestão com enzima de restrição. Chumbo no plasma (Pb_P) e chumbo no sangue total (Pb_S) foram determinados por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado e espectrometria de absorção atômica com forno de grafite, respectivamente. As freqüências alélicas para os alelos T (que codifica o aminoácido prolina) e C (que codifica o aminoácido leucina) da GPx-1 foram 0,73 e 0,27, respectivamente. Os voluntários foram separados em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência do alelo que codifica leucina. Não foi encontrada diferença significativa para as concentrações de Pb_P e Pb_S, bem como para os marcadores de estresse oxidativo entre os grupos. Deste modo, os resultados obtidos sugerem que o polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 não torna indivíduos ambientalmente expostos ao chumbo, mais suscetíveis aos danos do estresse oxidativo induzidos pelo metal. / Glutathione peroxidase (GPx-1) plays an important role in scavenger reactive oxygen species (ROS). This study was carried out to assess the effects of GPx-1 gene polymorphism (Pro198Leu) on malondialdehyde (MDA) and carbonyl protein ratio in 84 subjects environmentally exposed to lead. Genotypes for the GPx-1 Pro198Leu polymorphism were determined by PCR and restriction fragment length digestion. Lead in plasma (Pb_P) and lead in total blood (Pb_B) were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry and by graphite furnace atomic absorption spectrometry, respectively. The allele frequencies for T (which express the proline aminoacid) and C (which express the leucine aminoacid) were 0.73 e 0.27, respectively. The volunteers were divided in two groups, according to the presence or absence of C allele. No significant differences were found in Pb_P and Pb_B, as well as for the other oxidative biomarkers between the groups. Therefore, the obtained results suggest that the GPx-1 Pro198Leu polymorphism do not affect individuals environmentally exposed to lead greater susceptible to oxidative damage induced for this metal.

O chumbo (Pb) é um metal altamente tóxico no qual os sinais de intoxicação variam bastante ao considerar as diferenças interindividuais. Um dos principais mecanismos de toxicidade do Pb ocorre pela inibição da enzima ácido delta aminolevulínico desidratase (ALAD) no sistema hematopoiético. O Pb também desempenha um importante papel no desbalanço do estado redox, pois sabe-se que ele tem o potencial de aumentar a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROS) e inibir enzimas antioxidantes, como por exemplo a glutationa peroxidase (GPx). No entanto, poucos estudos avaliaram estes parâmetros em população ocupacionalmente exposta brasileira. Assim, o presente estudo, objetiva estudar a correlação entre as concentrações de Pb no sangue (Pb-S) de trabalhadores de fábricas de bateria e as atividades das enzimas ALAD e GPx associados com os polimorfismos genéticos da ALAD e GPx. Para tal, foram utilizadas 278 amostras de sangue de trabalhadores expostos ao Pb. As determinações de Pb foram realizadas por espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (ELAN DRCII Perkin- Elmer). As genotipagens dos polimorfismos genéticos da ALAD e da GPx foram realizadas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real e as atividades das enzimas ALAD e GPx foram determinadas no sangue por espectrofotometria de UV/VIS. A média da concentração de Pb-S foi de 22,8 ± 14,7 ?g/dL. Foram observadas correlações negativas entre Pb-S e atividade da ALAD (rs -0,24 p<0,01) e Pb-S e atividade de GPx (rs -0,27 p<0,05). Também foi verificada correlação negativa entre a porcentagem de inibição da ALAD e a atividade de GPx (rs -0,21 p<0,01). Em relação aos polimorfismos genéticos, não observamos associação entre os genótipos do ALAD (? -0,19 P>0,05) e GPx (genótipo CT: ? -1,37 P>0,05; genótipo TT: ? -8,37 P>0,05) e a concentração de Pb-S. Não foram observadas associações entre o polimorfismo rs1800668 e a atividade de GPx (genótipo CT: ? -0,016 P>0,05; genótipo TT: ? -0,004 P>0,05). No entanto, foi constatada uma associação entre o genótipo ALAD 1-1 do polimorfismo rs1800435 e a atividade da enzima ALAD (? 3,5 P<0,05). Neste sentido, os resultados deste estudo mostram que o genótipo ALAD 1-1 do polimorfismo rs1800435 do gene ALAD está associado a uma maior atividade da enzima ALAD nos indivíduos expostos ao Pb. Além disso, o polimorfismo rs1800668, localizado no gene que codifica a enzima GPx, não modula a atividade desta enzima nos indivíduos expostos ao metal. Ambos os polimorfismos dos genes ALAD e GPx parecem não influenciar nas concentrações de Pb-S na população estudada. / Lead (Pb) is a highly toxic metal which signs of intoxication vary greatly when considering the interindividual differences. One of the main mechanism of toxicity of Pb is due to inhibition of the enzyme acid delta aminolevulinic dehydratase (ALAD) in the hematopoietic system. Pb also plays an important role in the redox state of unbalance, since it is known that it has the potential of increasing the concentrations of reactive oxygen species (ROS) and inhibit antioxidant enzymes such as glutathione peroxidase (GPx). However, few studies have evaluated these parameters in Brazilian population occupationally exposed. Thus, the present study aims to study the correlation between the concentrations of Pb in the blood (B-Pb) of workers of battery factories and the activities of ALAD and GPx enzymes associated with genetic polymorphisms in ALAD and GPx. Then, blood samples of 278 workers exposed to Pb were collected. Pb was measured by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (Perkin-Elmer ELAN DRCII). The genotyping of genetic polymorphisms of ALAD and GPx was performed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) and activity of ALAD and GPx enzymes in the blood was determined by spectrophotometry UV / VIS. The mean concentration of B-Pb was 22.81 ± 14.73 mg / dL. Negative correlation was found between B-Pb and ALAD activity (rs -0.24 p < 0.01) and B-Pb and GPx activity (rs -0.27 p < 0.05). There was also a negative correlation between the percentage of inhibition of ALAD and GPx activity (rs -0.21 p < 0.01). Considering the genetic polymorphisms, no association between ALAD genotypes (? -0.19 P < 0.05) and GPx (CT genotype: ? -1.37 P > 0.05, TT genotype : ? -8.37 P > 0.05 ) and the concentration of B-Pb. No association between rs1800668 polymorphism and GPx activity (CT genotype: ? -0.016 P > 0.05, TT genotype : ? -0.004 P > 0.05). However an association was found between ALAD 1-1 rs1800435 genotype and ALAD enzyme activity (? 3.5 P < 0.05). Accordingly, the results of this study show that the ALAD 1-1 genotype of rs1800435 polymorphism in ALAD gene is associated with increased activity of ALAD enzyme in individuals exposed to Pb. Furthermore the rs1800668 polymorphism located in a gene encoding the enzyme GPx does not modulate the activity of this enzyme in individuals exposed to the metal. Both polymorphisms of ALAD and GPx genes seem to have no influence in the concentrations of B-Pb in the population studied.

Neste projeto estudou-se a interação da enzima peroxidase de raiz forte (HRP) em interfaces nanoestruturadas e sua possível aplicação em biossensores de peróxido de hidrogênio. Foram utilizadas as técnicas de Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) e automontagem por adsorção física para formar filmes nanoestruturados. A interação da enzima com espécies em interfaces foi investigada com materiais que serviram de matrizes de adsorção, ou seja, a quitosana (Ch) e o fosfolipídio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)] (sal de sódio) (DPPG). Os filmes de Langmuir foram caracterizados com medidas de pressão e potencial de superfície, espectroscopia no infravermelho, e tensão superficial dinâmica. Para os filmes LB e automontados, empregaram-se espectroscopias de fluorescência, ultravioleta-visível e infravermelho e microgravimetria por cristal de quartzo. A peroxidase de raiz forte apresentou forte interação com DPPG, confirmada em filmes de Langmuir por medidas de pressão de superfície, elasticidade dinâmica e de espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho, com modulação por polarização (PM-IRRAS). A massa de peroxidase transferida em filmes Langmuir-Blodgett (LB) mistos com DPPG foi de aproximadamente 200 ng, de acordo com medidas com uma microbalança de cristal de quartzo. A atividade da HRP foi mantida no filme LB, inclusive com atividade catalítica maior do que em meio homogêneo e nos filmes automontados com quitosana. As medidas de atividade não afetaram a morfologia dos filmes LB, estudada com microscopia de força atômica (AFM), ao contrário dos filmes automontados. Conclui-se que a imobilização de HRP é mais eficiente num filme LB, com matriz fosfolipídica, apresentando boas perspectivas de emprego em biossensores de peróxido de hidrogênio. / A study has been performed on the interaction of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in nanostructured interfaces and their possible application in biosensors for hydrogen peroxide. The nanostructured films were obtained with the Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) and layer-by-layer (LbL) methods. The interaction between HRP and species at interfaces was investigated using materials that served as matrix for immobilization, viz. chitosan (Ch) and the phospholipid 1,2-dipalmytoil-sn-glycero-3-[phosphatidyl-rac-(1-glycerol)] (sodium salt) (DPPG). The Langmuir films were characterized with surface pressure, surface potential, elasticity measurements and polarization-modulation reflection and absorption infrared spectroscopy (PM-IRRAS). For LB and LbL films, use was made of fluorescence, absorption in the UV-vis. and infrared spectroscopy. HRP displayed strong interaction with DPPG, which was confirmed in Langmuir films with measurements of surface pressure, dynamic elasticity and PM-IRRAS. The mass of HRP transferred onto a solid support in a mixed LB film with DPPG was 200 ng, according to data from a quartz crystal microbalance. The HRP activity was preserved in the mixed LB film, with a catalytic activity that was even higher than in solution or in LbL films of HRP/Ch. The catalytic activity measurements did not affect the morphology of the LB films, studied with atomic force microscopy (AFM), in contrast to the LbL films. The main conclusion is that HRP immobilization is more efficient in an LB film with a phospholipid matrix, with good prospects for developing biosensors for hydrogen peroxide.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (&#963;E) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (&#963;E) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

O selênio (Se), mineral traço essencial para o ser humano, exerce sua função no organismo por meio de sua participação nas selenoproteínas, dentre as quais destacam-se as glutationas peroxidase (GPx), importantes no sistema de defesa antioxidante. São conhecidas sete isoformas da GPx, sendo a GPx 1 (citosólica) a mais abundante. Como a atividade dessa enzima encontra-se fortemente correlacionada com a concentração sanguínea de Se, este parâmetro é normalmente utilizado como indicador do balanço metabólico do mineral. A concentração de Se nos alimentos depende do local onde foram cultivados e reflete diretamente o teor do mineral no solo, sendo os alimentos da região Norte e Nordeste mais ricos nesse nutriente quando comparados às demais regiões brasileiras. O consumo inadequado de Se provoca uma diminuição da atividade dessa enzima, o que por sua vez pode afetar a proteção antioxidante. Além disso, estudos vêm mostrando que o polimorfismo Pro198Leu no gene da GPx1 também pode diminuir a atividade da GPx. O presente estudo se propôs a verificar a relação entre esse polimorfismo e o estado nutricional relativo ao selênio de uma população adulta residente no município de Fortaleza/Ceará. A população do estudo foi constituída por 176 indivíduos (79 homens e 97 mulheres), com média de idade de 30,4 ± 8,9 anos. Foram realizadas a avaliação da composição corporal por antropometria e a avaliação do consumo alimentar, por meio de três recordatórios de 24h. Os biomarcadores para avaliação do estado nutricional dos indivíduos quanto ao selênio foram: a concentração de Se plasmático e eritrocitário e a atividade da GPx total no eritrócito. Também foi determinado o polimorfismo Pro198Leu no gene que codifica para a GPx 1 por meio de PCR em Tempo Real. Foram encontradas concentrações médias de 62,6 &#181;g/L para Se plasmático e de 101,5 &#181;g/L para Se eritrocitário, não sendo observada correlação entre os dois. A média de ingestão de selênio foi de 76,88 &#181;g/dia, apresentando correlação positiva com o consumo de energia e proteína. Separando por gênero, encontrou-se que as médias de Se plasmático e de Se ingerido dos homens foram significativamente maiores que as das mulheres (p<0,05). A média da atividade da GPx foi de 38,6 U/g Hb. Para o polimorfismo Pro198Leu no gene que codifica para a GPx 1, foram encontrados 96 (54,5%) indivíduos com genótipo selvagem Pro/Pro, 67 (38,1%) indivíduos Pro/Leu e 13 (7,4%) indivíduos Leu/Leu. A frequência encontrada estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Não foram encontradas diferenças estatísticas significativas nas concentrações de selênio entre os grupos de acordo com o genótipo, no entanto, para a atividade da GPx, houve diferença entre o grupo Pro/Pro e Pro/Leu (p<0,05). No grupo Pro/Pro, foi encontrada correlação positiva entre a concentração de selênio eritrocitário e a atividade eritrocitária total da GPx (p<0,05). Desta forma, podemos concluir que o estado nutricional da população estudada estava adequado com relação ao selênio e que o polimorfismo Pro198Leu apresentou influência sobre a atividade da GPx, que apresentou-se reduzida nos indivíduos que apresentaram alelo variante em seu genótipo. / Selenium (Se) is an essential trace mineral for humans which exerts its function in the body in selenoproteins, among which we highlight the glutathione peroxidase (GPx), important in the antioxidant defense system. There are seven known GPx isoforms and the GPx 1 (cytosolic) is the most abundant. As the activity of this enzyme is strongly correlated with selenium blood concentration this parameter is usually used as an indicator of the mineral metabolic balance. Selenium concentration in food depends on the location where they were grown and directly reflects the soil mineral content. Food in the North and Northeast are richer in selenium when compared to other Brazilian regions. Inadequate consumption of Se causes a decrease in GPx activity, what affects the antioxidant protection. Furthermore, studies have shown that the Pro198Leu polymorphism at GPx1 gene of can also decrease the activity of GPx. Our study aimed to investigate the relationship between this polymorphism and nutritional selenium status in an adult population living in Fortaleza/Ceará/Brazil. The study population consisted of 176 individuals (79 men and 97 women) with a mean age of 30.4 ± 8.9 years. The body composition was assessed by anthropometry and the food intake assessment was done using three 24-hour records. The selenium Se concentration was measured in plasma and erythrocyte and GPx activity was measured in erythrocytes. The Pro198Leu polymorphism at GPx 1 gene was determined by Real Time PCR. We found concentrations of 62.6 &#181;g/L for Se plasma and 101.5 &#181;g/L for erythrocyte. There was no correlation observed between these two markers. The average selenium intake was 76.88 &#181;g/day and it showed positively related to the energy and protein consumption. Separating by gender, men selenium plasma concentration and selenium consumption were significantly higher than for women (p < 0.05). The GPx activity was 38.6 U/g Hb. The Pro198Leu polymorphism at GPx 1 gene frequency were 96 (54.5%) subjects with Pro/Pro, 67 (38.1%) subjects Pro/Leu and 13 (7.4%) individuals Leu/Leu. The rate found was in Hardy -Weinberg equilibrium. There were no statistically significant differences in selenium concentrations between groups according to the genotype. However, for GPx activity we found difference between the group Pro/Pro and Pro/Leu (p< 0.05). We also found positive correlation between Se erythrocyte concentration and GPx activity in Pro/Pro group (p<0.05). Thus, we conclude that the selenium nutritional status of the population studied was adequate and that Pro198Leu polymorphism showed influence on the activity of GPx, which was lower in individuals with the variant allele in their genotype.

O selênio (Se) é um mineral essencial para o corpo humano, com ação no sistema imunológico, na glândula tireoide, dentre outras funções. É um nutriente importante na proteção das células contra os efeitos dos radicais livres, já que faz parte da enzima glutationa peroxidase (GPX). O consumo alimentar de Se é dependente da concentração desse elemento nos alimentos que varia em função da concentração do mesmo nos solos. Deste modo, este estudo teve como objetivo geral avaliar o estado nutricional relativo ao selênio de indivíduos adultos da cidade de Manaus-AM, por ser considerada região com solo rico nesse nutriente. Casuística: o estudo foi do tipo transversal baseado em amostra não probabilística de conveniência. A população estudada foi composta por 124 voluntários de ambos os gêneros com idade entre 20 a 59 anos. Critérios de inclusão: não ser atleta de elite, não ser etilista, não apresentar doenças crônicas não transmissíveis e não fazer o uso de suplementos vitamínico-minerais e/ou anti-inflamatórios. Não foram incluídos no estudo os participantes que não entregaram os formulários e questionários solicitados (alimentação e/ou ficha cadastral) e/ou que não compareceram para coleta de sangue. A coleta de sangue foi em jejum de 8 a 12 horas para determinação de selênio no plasma e eritrócitos e da atividade da GPX nos eritrócitos, também foram avaliados o consumo alimentar e as medidas antropométricas. Os resultados antropométricos mostraram que 60,0% dos participantes apresentava excesso de peso, a distribuição dos macronutrientes ficou dentro do recomendado pelas DRIs (Dietary Reference Intakes), a ingestão média de selênio ficou acima do recomendado (72±48,0&#181;g/dia), a concentração média para o selênio plasmático foi de 111,4± 37,0 &#181;g/L, de selênio eritrocitário 211± 62,4 &#181;g/L e a atividade da GPX foi de 73± 21,9 U/g Hb, não sendo observada correlação entre as concentrações obtidas para plasma e eritrócito, porém com correlação positiva para Se eritrocitário e atividade da GPX (r= 0,393). Pode-se, portanto concluir do presente estudo que a boa parte dos indivíduos avaliados, habitantes da cidade de Manaus, foi considerada deficiente, apesar de consumirem quantidade desse mineral consideradas adequadas porém, nenhum apresentando parâmetros bioquímicos de deficiência, a maioria dentro da normalidade, entretanto, com um percentual de indivíduos apresentando risco de toxicidade. / Selenium (Se) is an essential mineral for the human body, with function on the immune system, thyroid glands and other ones. It is an important nutrient in protecting cells against the effects of free radicals because it is part of glutathione peroxidase enzyme (GPX). Selenium intake depends on the mineral concentration in aliments which varies based on the mineral content in soils. Thus, this study had as main objective to evaluate the nutritional status related to selenium on adults in Manaus-AM because it is considered as a region of high selenium soil content region. Casuistic: This study was transversal type based in a non-probabilistic convenience sample. The population consisted of 124 volunteers (both genders) aged from 20 to 59 years. Inclusion criteria: To not be an elite athlete or alcoholic, do not have chronic non-communicable diseases and do not use vitamin-mineral supplements and/or anti-inflammatory pills. People who did not submit the requested forms and questionnaires (registration form and/or alimentation) and/or did not attend for blood collection were not included. Blood collection was fasting from 8 to 12 hours for determining selenium in plasma and erythrocytes and the activity of GPX in erythrocytes. Food intake and anthropometric measures were also evaluated. Anthropometric results showed that 60,0% were overweight, macronutrient distribution was within the recommended by DRIs (Dietary Reference Intakes). Average selenium intake was above recommended (72±48,0 &#181;g/day), mean plasmatic selenium concentration was 111,4 ± 37,0 &#181;g/L, for erythrocytes selenium was 211 ± 62,4 &#181;g/L and activity of GPX average was 73 ± 21,9 U/g Hb. No correlation between concentration of Se in plasma and erythrocyte, however, there was positive correlation between GPX activity and Se concentration in erythrocytes (r=0,393). Finally, we conclude that most of the people that were evaluated, citizens of Manaus city, were considered as deficient, although they consumed adequate quantities of this mineral. However, none of them showed biochemical deficiency parameters, most within normality, but with a percentage of them showing toxicity risk.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

To gain a better understanding of the mechanisms by which the white-rot decay fungus Phanerochaete chrysosporium regulates selective delignification versus simultaneous decay, differential gene expression of its two key enzymes were measured over the course of aspen and birch wood decay tests. The type of decay was determined by differential staining and scanning electron microscopy. Real-time qPCR assessed gene expression of four lignin peroxidase genes and two manganese peroxidase genes at each stage of decay. Differential expression was significant in the mnp2 gene between aspen and birch decay tests during incipient decay; abundant expression of mnp2 in aspen corresponded to early initiation of selective delignification, whereas birch underwent initial simultaneous decay in the absence of abundant mnp2 expression. The lipC gene was the most abundantly expressed lip gene at all time points in both wood species and likely plays an important role in regulating wood decay.

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