Neste projeto estudou-se a interação da enzima peroxidase de raiz forte (HRP) em interfaces nanoestruturadas e sua possível aplicação em biossensores de peróxido de hidrogênio. Foram utilizadas as técnicas de Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) e automontagem por adsorção física para formar filmes nanoestruturados. A interação da enzima com espécies em interfaces foi investigada com materiais que serviram de matrizes de adsorção, ou seja, a quitosana (Ch) e o fosfolipídio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)] (sal de sódio) (DPPG). Os filmes de Langmuir foram caracterizados com medidas de pressão e potencial de superfície, espectroscopia no infravermelho, e tensão superficial dinâmica. Para os filmes LB e automontados, empregaram-se espectroscopias de fluorescência, ultravioleta-visível e infravermelho e microgravimetria por cristal de quartzo. A peroxidase de raiz forte apresentou forte interação com DPPG, confirmada em filmes de Langmuir por medidas de pressão de superfície, elasticidade dinâmica e de espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho, com modulação por polarização (PM-IRRAS). A massa de peroxidase transferida em filmes Langmuir-Blodgett (LB) mistos com DPPG foi de aproximadamente 200 ng, de acordo com medidas com uma microbalança de cristal de quartzo. A atividade da HRP foi mantida no filme LB, inclusive com atividade catalítica maior do que em meio homogêneo e nos filmes automontados com quitosana. As medidas de atividade não afetaram a morfologia dos filmes LB, estudada com microscopia de força atômica (AFM), ao contrário dos filmes automontados. Conclui-se que a imobilização de HRP é mais eficiente num filme LB, com matriz fosfolipídica, apresentando boas perspectivas de emprego em biossensores de peróxido de hidrogênio. / A study has been performed on the interaction of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in nanostructured interfaces and their possible application in biosensors for hydrogen peroxide. The nanostructured films were obtained with the Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) and layer-by-layer (LbL) methods. The interaction between HRP and species at interfaces was investigated using materials that served as matrix for immobilization, viz. chitosan (Ch) and the phospholipid 1,2-dipalmytoil-sn-glycero-3-[phosphatidyl-rac-(1-glycerol)] (sodium salt) (DPPG). The Langmuir films were characterized with surface pressure, surface potential, elasticity measurements and polarization-modulation reflection and absorption infrared spectroscopy (PM-IRRAS). For LB and LbL films, use was made of fluorescence, absorption in the UV-vis. and infrared spectroscopy. HRP displayed strong interaction with DPPG, which was confirmed in Langmuir films with measurements of surface pressure, dynamic elasticity and PM-IRRAS. The mass of HRP transferred onto a solid support in a mixed LB film with DPPG was 200 ng, according to data from a quartz crystal microbalance. The HRP activity was preserved in the mixed LB film, with a catalytic activity that was even higher than in solution or in LbL films of HRP/Ch. The catalytic activity measurements did not affect the morphology of the LB films, studied with atomic force microscopy (AFM), in contrast to the LbL films. The main conclusion is that HRP immobilization is more efficient in an LB film with a phospholipid matrix, with good prospects for developing biosensors for hydrogen peroxide.

A enzima glutationa peroxidase (GPx-1) possui um importante papel na detoxificação de espécies reativas de oxigênio. Neste estudo foi verificada a influência do polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 nos níveis de malondialdeído (MDA) e proteínas carboniladas de 84 voluntários expostos ambientalmente ao chumbo (28 homens e 56mulheres; idade: 18 a 60 anos). Os genótipos para o polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 foram determinados por PCR seguido por digestão com enzima de restrição. Chumbo no plasma (Pb_P) e chumbo no sangue total (Pb_S) foram determinados por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado e espectrometria de absorção atômica com forno de grafite, respectivamente. As freqüências alélicas para os alelos T (que codifica o aminoácido prolina) e C (que codifica o aminoácido leucina) da GPx-1 foram 0,73 e 0,27, respectivamente. Os voluntários foram separados em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência do alelo que codifica leucina. Não foi encontrada diferença significativa para as concentrações de Pb_P e Pb_S, bem como para os marcadores de estresse oxidativo entre os grupos. Deste modo, os resultados obtidos sugerem que o polimorfismo Pro198Leu da GPx-1 não torna indivíduos ambientalmente expostos ao chumbo, mais suscetíveis aos danos do estresse oxidativo induzidos pelo metal. / Glutathione peroxidase (GPx-1) plays an important role in scavenger reactive oxygen species (ROS). This study was carried out to assess the effects of GPx-1 gene polymorphism (Pro198Leu) on malondialdehyde (MDA) and carbonyl protein ratio in 84 subjects environmentally exposed to lead. Genotypes for the GPx-1 Pro198Leu polymorphism were determined by PCR and restriction fragment length digestion. Lead in plasma (Pb_P) and lead in total blood (Pb_B) were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry and by graphite furnace atomic absorption spectrometry, respectively. The allele frequencies for T (which express the proline aminoacid) and C (which express the leucine aminoacid) were 0.73 e 0.27, respectively. The volunteers were divided in two groups, according to the presence or absence of C allele. No significant differences were found in Pb_P and Pb_B, as well as for the other oxidative biomarkers between the groups. Therefore, the obtained results suggest that the GPx-1 Pro198Leu polymorphism do not affect individuals environmentally exposed to lead greater susceptible to oxidative damage induced for this metal.

Organic hydroperoxide resistance (Ohr) proteins are highly efficient thiol-based peroxidases that play central roles in bacterial response towards organic hydroperoxides. In Fungi, Ohr frequently presents a N-terminal extension, which is predicted to target them to mitochondria. The catalytic triad of Ohr comprises the peroxidatic Cys (Cp), the catalytic Arg (Rc) and a Glu (Ec) are fully conserved and interact among themselves by a salt bridge network in a reduced form of the enzyme (the so-called closed state). After getting oxidized to sulfenic acid (Cys-SOH), Cp condenses with the sulfhydryl group of resolution Cys (Cr) in a disulfide bond. The absence of negativity of the thiolate (RS-) in Cp facilitates the opening of the Arg-loop (containing the Rc) away from the active site, generating the so-called open state. However, the molecular events associated with the high reactivity of Ohr enzymes towards hydroperoxides and its specific reducibility by the dihydrolipoamide (DHL) or by lipoylated proteins were still elusive before this work. Additionally, several factors support the idea of Ohr as a target for drug development: (i) Ohr displays unique physicochemical properties; (ii) bacteria mutant for Ohr (Δ ohr) are highly sensitive to oxidative stress; (iii) the indications that Ohr might be involved in bacterial virulence; and (iv) its absence in mammals and vascularized plants. In this thesis, several aspects of Ohr enzymes were evaluated. In chapter 2, we biochemically characterized the Ohr homologs from the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), the causative agent of Black Sigatoka disease in banana plants, which presented extraordinary reactivity towards linoleic acid hydroperoxides (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Furthermore, through subcellular fractionation of M fijiensis protoplast cells followed by western blot analysis, we confirmed the in silico prediction that MfOhr is a mitochondrial protein. In chapter 3 and 4, we described seven new crystallographic structures from two opportunistic pathogen, one from Xylella fastidiosa and six from Chromobacterium violaceum (including the first representative of the complex between Ohr and its biological reductant, DHL). Taken together these structures might represent new snapshots along the catalysis. Furthermore, several molecular modelling approaches, such as classical mechanics (MM), steered molecular dynamics (SMD), hybrid quantum mechanics (QM-MM) and together with enzymatic assays of point mutations, indicated that Ohr underwent unique structural switches to allow an intermittent opening (oxidized state) and returning to a more stable closed form (reduced state) of an Arg-loop along catalysis. Remarkably, dihydrolipoamide directly assisted the closing the Arg-loop and thereby the turnover of the enzyme. In chapter 5, we describe the identification of two compounds (C-31 & C-42) that could represent a framework for further studies attempting to find specific Ohr inhibitors, either through ab initio design of chemical compounds and virtual screening using pharmacophoric models. The IC50 calculated for C-31 and C-42 were 124.4-248.5 µM and 243.3-321.7 µM, respectively. Finally, this thesis highlights several new aspects related to Ohr function: 1 - evidence that eukaryotic Ohr are preferentially located in mitochondria and share several biochemical properties with the prokaryotic ones; 2 - the network of polar interactions among residues of the catalytic triad (Cp, Rc and E) strongly contributed to stabilize Ohr in the closed state, in an optimum configuration for hydroperoxide reduction; 3 - evidence that disulfide bond formation and the product release (alcohol derived from hydroperoxide reduction) facilitate the opening of the Rc loop to an intermediate state (probably not to the excessively open state presented in crystallographic structures); 4 - mapping the interactions between the biological reductant (DHL) and the Ohr active site; 5 - strong indications that DHL is not able to fit and react with Ohr in the close conformation; 6 - the first trials for search of molecules to specifically target Ohr proteins, although further assays must be performed to verify the specificity of the selected compounds to target Ohr. Therefore, we describe relevant new information for an antioxidant protein that displays highly efficient catalysis, comparable to other very important hydroperoxide removing enzymes, such as GSH peroxidase and peroxiredoxin / As proteínas Ohr (Organic hydroperoxide resistance) são peroxidases dependente de tiól extremamente eficientes e têm um papel central na resposta das bactérias contra peróxidos orgânicos. Em fungos, as proteínas Ohr apresentam uma extensão N-terminal, cujo predições in silico apontam estar associada ao direcionamento da proteína para a mitocôndria. A tríade catalítica é composta pela cisteína peroxidatic (Cp), a arginina (Rc) e o glutamato (Ec) catalíticos que são totalmente conservados e interagem entre eles por uma rede de interações de ponte salina, na forma reduzida da proteína (conformação fechada). Após se tornarem oxidadas em ácido sulfênico (Cis-SOH), a Cp condensa com o grupo sulfidrila da cisteína de resolução (Cr) numa ligação disulfeto. A ausência da carga negativa do tiolato (RS-) da Cp facilita a abertura da alça que contem a Rc para longe do centro ativo, gerando a conformação aberta. No entanto, os eventos moleculares associados a alta reatividade das enzimas Ohr contra hidroperóxidos e a sua redução pela dihydrolipoamida (presente em proteínas lipoiladas), ainda está descrita de forma bem superficial. Adicionalmente, vários fatores suportam a ideia de que a Ohr seria um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas: (i) a Ohr exibe propriedade físico-químicas únicas; (ii) as bactérias mutantes para Ohr (Δohr) são fortemente sensíveis ao stress oxidativo; (iii) indicações de que a Ohr poderá está envolvida na virulência de várias bactérias; e (iv) a ausência de Ohr em mamíferos e plantas vascularizadas. Nesta tese, vários aspetos relacionados com as enzimas Ohr foram avaliados. No Capitulo 2, foi caracterizada bioquimicamente a proteína Ohr homologa de fungo ascomiceto, Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), o agente causador da doença de bananas, Sigatoka-negra. A enzima apresentou eficiente atividade contra peroxido de ácido linoleico (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Além disso, através do fracionamento sub celular de protoblasto de M fijiensis seguido de western blot, foram confirmadas as predições in silico de que a MfOhr é uma proteína mitocondrial. No capítulo 3 e 4, foram descritas sete estruturas cristalográficas oriundas de dois patógenos oportunistas, uma de Xylella fastidiosa e seis de Chromobacterium violaceum (incluindo o primeiro representante do complexo entre a Ohr e o seu redutor biológico, DHL). Estas estruturas poderão representar diferentes conformações ao longo do ciclo catalítico. Adicionalmente, várias abordagens de modelagem molecular, tais como mecânica clássica (MM), mecânica molecular direcionada (SMM) e mecânica quântica híbrida (QM-MM), juntamente com ensaios experimentais com mutações pontuais, indicaram que a Ohr sofre várias mudanças conformacionais para permitir uma abertura intermitente (estado oxidado) e o retorno para uma conformação fechada mais estável (estado reduzido) da alça da arginina ao longo da catálise. Notavelmente, a dihydrolipoamide assistiu diretamente o fechamento da alça da arginina e por consequência o turnover da enzima. No capítulo 5, foi descrita a identificação de dois compostos (C-31 e C-42) que representam estudos iniciais com a finalidade de encontrar inibidores específicos para a enzima Ohr. Estes compostos foram encontrados por ab initio design e por varrimento virtual com o uso de modelos farmacofóricos. Os IC50 calculados para o C-31 e C-42 foram de 124.4-248.5 µM e 243.3-321.7 µM, respectivamente. Finalmente, esta tese descreve vários aspetos relacionados com a função da Ohr: 1 - evidências que as Ohr de eucariotos estão preferencialmente localizadas na mitocôndria e partilham várias propriedades bioquímicas com as Ohr de bactéria; 2 - a rede de interações polares entre os resíduos da tríade catalítica (Cp, Rc e Ec) contribuem fortemente para a estabilização do estado fechado, a configuração ótima para a redução de hydroperoxidos; 3 - evidências de que a formação da ligação disulfeto e a liberação do produto (álcool derivado da redução do hydroperoxido) facilitam a abertura da alça da arginina até um estado intermediários (provavelmente não o estado totalmente exposto apresentado nas estruturas cristalográficas) 4 - o mapeamento das interações entre o redutor biológico no centro ativo da Ohr; 5 - fortes indicações de que a DHL não é capaz de interagir e reagir com a Ohr na conformação fechada; 6 - os primeiros ensaios para a procura por moléculas que especificamente interajam com a Ohr, apesar de que futuros ensaios terão de ser executados para verificar a especificidade dos compostos selecionados. Assim, nós descrevemos nova informação relevante sobre uma proteína antioxidante que exibe uma alta eficiência catalítica, comparável com outras importantes enzimas removedores de hydroperoxidos, tais como glutationa peroxidases e peroxiredoxinas

O selênio (Se) é um mineral essencial para o corpo humano, com ação no sistema imunológico, na glândula tireoide, dentre outras funções. É um nutriente importante na proteção das células contra os efeitos dos radicais livres, já que faz parte da enzima glutationa peroxidase (GPX). O consumo alimentar de Se é dependente da concentração desse elemento nos alimentos que varia em função da concentração do mesmo nos solos. Deste modo, este estudo teve como objetivo geral avaliar o estado nutricional relativo ao selênio de indivíduos adultos da cidade de Manaus-AM, por ser considerada região com solo rico nesse nutriente. Casuística: o estudo foi do tipo transversal baseado em amostra não probabilística de conveniência. A população estudada foi composta por 124 voluntários de ambos os gêneros com idade entre 20 a 59 anos. Critérios de inclusão: não ser atleta de elite, não ser etilista, não apresentar doenças crônicas não transmissíveis e não fazer o uso de suplementos vitamínico-minerais e/ou anti-inflamatórios. Não foram incluídos no estudo os participantes que não entregaram os formulários e questionários solicitados (alimentação e/ou ficha cadastral) e/ou que não compareceram para coleta de sangue. A coleta de sangue foi em jejum de 8 a 12 horas para determinação de selênio no plasma e eritrócitos e da atividade da GPX nos eritrócitos, também foram avaliados o consumo alimentar e as medidas antropométricas. Os resultados antropométricos mostraram que 60,0% dos participantes apresentava excesso de peso, a distribuição dos macronutrientes ficou dentro do recomendado pelas DRIs (Dietary Reference Intakes), a ingestão média de selênio ficou acima do recomendado (72±48,0µg/dia), a concentração média para o selênio plasmático foi de 111,4± 37,0 µg/L, de selênio eritrocitário 211± 62,4 µg/L e a atividade da GPX foi de 73± 21,9 U/g Hb, não sendo observada correlação entre as concentrações obtidas para plasma e eritrócito, porém com correlação positiva para Se eritrocitário e atividade da GPX (r= 0,393). Pode-se, portanto concluir do presente estudo que a boa parte dos indivíduos avaliados, habitantes da cidade de Manaus, foi considerada deficiente, apesar de consumirem quantidade desse mineral consideradas adequadas porém, nenhum apresentando parâmetros bioquímicos de deficiência, a maioria dentro da normalidade, entretanto, com um percentual de indivíduos apresentando risco de toxicidade. / Selenium (Se) is an essential mineral for the human body, with function on the immune system, thyroid glands and other ones. It is an important nutrient in protecting cells against the effects of free radicals because it is part of glutathione peroxidase enzyme (GPX). Selenium intake depends on the mineral concentration in aliments which varies based on the mineral content in soils. Thus, this study had as main objective to evaluate the nutritional status related to selenium on adults in Manaus-AM because it is considered as a region of high selenium soil content region. Casuistic: This study was transversal type based in a non-probabilistic convenience sample. The population consisted of 124 volunteers (both genders) aged from 20 to 59 years. Inclusion criteria: To not be an elite athlete or alcoholic, do not have chronic non-communicable diseases and do not use vitamin-mineral supplements and/or anti-inflammatory pills. People who did not submit the requested forms and questionnaires (registration form and/or alimentation) and/or did not attend for blood collection were not included. Blood collection was fasting from 8 to 12 hours for determining selenium in plasma and erythrocytes and the activity of GPX in erythrocytes. Food intake and anthropometric measures were also evaluated. Anthropometric results showed that 60,0% were overweight, macronutrient distribution was within the recommended by DRIs (Dietary Reference Intakes). Average selenium intake was above recommended (72±48,0 µg/day), mean plasmatic selenium concentration was 111,4 ± 37,0 µg/L, for erythrocytes selenium was 211 ± 62,4 µg/L and activity of GPX average was 73 ± 21,9 U/g Hb. No correlation between concentration of Se in plasma and erythrocyte, however, there was positive correlation between GPX activity and Se concentration in erythrocytes (r=0,393). Finally, we conclude that most of the people that were evaluated, citizens of Manaus city, were considered as deficient, although they consumed adequate quantities of this mineral. However, none of them showed biochemical deficiency parameters, most within normality, but with a percentage of them showing toxicity risk.

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:17:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final Jovana.pdf: 7776045 bytes, checksum: ce1bfe99dfd7dc4e69f1df2120161421 (MD5) Previous issue date: 2006-09-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Assai (Euterpe oleraceae, Mart) is commonly consumed as a regional food in the Northern part of Brazil. Its nutritional properties are well known and for that, assai started to be consumed in many other regions of the country. It is commercially offered in the market as pulp in the refrigerated or frozen form, without any other previous heat treatment. Even when the product in maintained under refrigeration, it does not least more than 12 hours. After this period, color and flavour start changing. Freezing is inconvenient for transportation from far way regions (country areas) for the lack or small availability of freezing equipment. There are very few commercial products made from assai. The main purposes of this research work were: To make an assai tropical fruit juice and submit it to a heat treatment known as Ultra High Temperature UHT, as well as observe its conservation. The raw material used in this work was acquired from a cooperative food plant located in Codajás, State of Amazonas Brazil. Assai was analyzed, classified and transformed into tropical fruit juice, and submitted to UHT treatment. The juice was filled in appropriate Tetra Pak Cartoon Packages and its conservation was observed at 0, 30 and 60 days after processing. In these analysis, enzyme activity, commercial sterilization, and anthocyanin levels were determined. It was also determined the nutritional value of the juice and its sensory evaluation was carried. The commercial sterility of the juice was achieved, the pH 4.3 was found stable under storage conditions, and the heat treatment was enough to inactivate 99.98 % of peroxidase and 99.80% of polyphenoloxidase, without any change. The level of anthocyanin pigment decreased after 60 days observation. The most important nutrient in the assai tropical juice was fat (6 g per 200 ml). The calorie value per 200 ml portion was 74. The juice did not show any sensory change while bonded at room temperature. Panelists considered the juice as a very good product. / O açaí (Euterpe precatoria, Mart) faz parte da cultura alimentar das populações dos Estados do Norte do Brasil e suas propriedades nutricionais são bastante exploradas pelo mercado, o que ampliou seu consumo em todo o país. A forma usual de comercialização é resfriado ou congelado, que geralmente ocorre sem tratamento térmico prévio. Mesmo quando mantido sob refrigeração, o açaí não se conserva por mais de 12 horas, quando começam a ocorrer mudanças de cor e sabor. O congelamento é inconveniente para o transporte, pois está sujeito a cadeias de frio ainda pouco disponíveis nas áreas de produção. Produtos comerciais derivados do açaí são poucos. Este trabalho teve por objetivos principais produzir, submeter o suco tropical de açaí ao tratamento térmico UHT (Ultra High Temperature) e avaliar sua conservação. Foi utilizada como matéria-prima açaí produzido em uma indústria cooperativa localizada no município de Codajás AM. O açaí foi analisado, classificado de acordo com a legislação vigente, transformado em suco tropical, o qual foi submetido ao tratamento térmico UHT. O acondicionamento foi feito em embalagens cartonadas da marca Tetra Pak e sua conservação foi analisada aos 0, 30 e 60 dias após processamento. Nestas análises os níveis de atividade de enzimática (peroxidase e polifenoloxidase), esterilidade comercial e teor de antocianinas foram determinadas. Também foi determinado valor nutricional e feita avaliação sensorial. A esterilidade do suco tropical foi alcançada. O pH 4,3 manteve-se estável durante os períodos de observação. O tratamento empregado foi suficiente para inativar 99,98% da atividade da peroxidase e 99,80% da polifenoloxidase que se mantiveram estáveis durante armazenagem. Houve redução no teor de antocianina após 60 dias de armazenagem. O nutriente predominante na composição do suco foi gordura (6g/ 200mL). O valor calórico foi de 74 kcal por porção de 200ml do suco. O suco tropical não apresentou alterações sensoriais quando armazenado em temperatura ambiente até dois meses de observação. A aceitabilidade foi considerada muito boa pelos provadores.

Este trabalho compreendeu estudar e definir as condições de cultivo que maximizam a produção de manganês peroxidases (MnPs) e lacases (Lacs) por C. subvermispora, fungo de degradação branca da madeira envolvido em processos industriais de biopolpação. O estudo envolveu cultivos submersos, em superfície ou com micélio imobilizado em espuma de poliuretano em meios complexo ou definido, e cultivos imobilizados em meio definido nos quais foram avaliados os efeitos: de diferentes concentrações de Mn2+, dos indutores 2,5-xilidina e álcool veratrílico, e do surfactante Tween 80, que levaram a diferentes níveis de expressões de Lacs e MnPs. Para a determinação de como essas condições afetam a produção das enzimas oxidativas (MnPs e Lacs), os cultivos foram avaliados cineticamente quanto à concentração de proteínas, às atividades enzimáticas, ao espectro de absorção de luz na região UV-VIS, ao teor de açúcares redutores, ao crescimento micelial, ao teor de amônio, ao pH, à condutividade elétrica. Também foram realizadas análises eletroforéticas de extratos de cultivos selecionados. Nos cultivos que tiveram como inóculo discos de micélio, a condição imobilizada em meio de composição complexa demonstrou potencial para produção de Lac (147,5 UI/L). Já nos cultivos inoculados com suspensão de micélio macerado em água, a condição imobilizada em meio de composição definida se destacou com produção seletiva de MnP (277,5 UI/L). Verificou-se que os cultivos em meio complexo nas formas submersa e imobilizada favoreceram a produção de Lac em detrimento de MnP. Nos cultivos de C. subvermispora imobilizado em espuma de poliuretano, em meio definido, a variação da concentração de manganês no meio de cultura alterou a produção de MnP, sendo a concentração de 11 ppm de Mn+2 promotora da máxima atividade (108,5 UI/L). No entanto, ao suprimir manganês do meio, ocorreu produção seletiva de Lac (15,5 UI/L). Com a suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com 0,5 e 1,0 mM de 2,5-xilidina, foram alcançados máximos de atividade de Lac de 14,0 e 22 UI/L, respectivamente. A atividade máxima de MnP não foi afetada pela adição de 2,5-xilidina. Não houve aumentos significativos nas atividades máximas de Lac e de MnP quando o meio foi suplementado com álcool veratrílico. A suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com Tween 80 nas concentrações de 0,05% e 0,5% v/v, em adição a 2,5-xilidina 1,0 mM, aumentou ainda mais a produção de Lac, com máximos de atividade de 53 e 61 UI/L, e de MnP, com picos de 175 e 182 UI/L, respectivamente. As eletroforeses em condições desnaturantes revelaram bandas proteicas de 12,4 a 118,3 KDa e nos géis de atividade foram detectadas atividades de MnP e Lac com mais de uma banda de atividade. Durante os cultivos, a exaustão de açúcares redutores acarretou em diminuição da concentração de micélio fúngico e aumento da concentração de nitrogênio amoniacal no meio, provavelmente devido à ocorrência de autólise celular. O pH e a condutividade variaram relativamente pouco. Em meio complexo, obsevou-se aumento da condutividade durante o cultivo, provavelmente devido à secreção de ácidos orgânicos pelo fungo. / This work involved the research and definition of the culture conditions that maximize the production of manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) by C. subvermispora, a white-rot fungus studied in biopulping industrial processes. The study involved submerged or static cultures with immobilized mycelium in polyuretane foam in complex or defined medium, and immobilized cultures in defined medium with different concentrations of Mn2+ and inductors, 2.5-xylidin and veratryl alcohol, and surfactant, Tween 80, resulting in different expressions levels of MnPs and Lacs. To determine how these conditions affect the production of oxidative enzymes (MnP and Lac), the cultures were evaluated kinetically regarding the concentration of proteins, enzymatic activities, the absorption of light in the UV-VIS regions, the concentration of reducing sugars, the micelyal growth, the concentration of ammonium, pH, electrical conductivity. We also performed electrophoretic analysis of some selected cultures. In the cultures inoculated whith discs of mycelium, the condition immobilized in poliuretane foam whith complex medium showed potential for producing Lac (147.5 IU / L). In the cultures inoculated with homogenized mycelium, the immobilized condition whith defined medium showed selective production of MnP (277.5 IU/L). It was found that the submerged and immobilized cultures in complex medium increased the production of Lac instead of MnP. In the immobilized cultures with defined medium, the variation of the concentration of manganese in the medium altered the production of MnP, being the concentration of 11 ppm that promoting maximum activity (108.5 IU/L). However, in the absence of manganese in the medium, the selective production of Lac (15.5 IU / L) was observed. With the supplementation of the defined medium containing 11 ppm Mn+2 with 0.5 or 1.0 mM 2.5-xylidine, maximum activities of Lac of 14.0 and 22.0 IU / L, respectively, were achieved. The maximum activity of MnP was not affected by the addition of 2.5-xylidine. There was no significant increase in the maximum activities of Lac and MnP when the medium was supplemented with veratryl alcohol. Supplementation of the medium with Tween 80, at concentrations of 0.05% and 0.5% v/v, in addition to 11 ppm Mn+2 and 1.0 mM 2.5-xylidine, further increased the production of Lac, with highest activities of 53 and 61 IU/L; MnP activities were 175 and 182 IU/L, respectively. Electrophoresis under denaturing conditions revealed bands of approximately 12.4-118.3 KDa in the electrophoresis non-denaturing PAGE showed MnP and Lac activities in differents bands. During the cultivations, the exhaustion of sugars led to decreased concentrations of mycelium and increased concentrations of ammonia in the extracts, probably due to the occurrence of cellular autolysis. The pH and conductivity showed low variations. The culture in complex medium showed an increased conductivitywith time, probably due to the secretion of organic acids by the fungus.

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.

Biosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutkörperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. Für empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung dafür ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfläche. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene poröse graphitähnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen für die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Größe eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enthält in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molekül mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molekül oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so veränderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, dafür aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie. / Biosensors are often used for the measurement of specific substances in complex media, e.g. glucose in blood. They consist of a physicochemical sensor, the transducer, onto which a biological component, the recognition element, is immobilised. In this work, an electrode was used as transducer and the enzyme “horseradish peroxidase” (HRP) as biological component. Such HRP electrodes are used for the measurement of hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 is produced in the body by white blood cells to destroy bacteria, is partially exhaled and can be measured in breath condensate. Since a lot of white blood cells are destroyed during chemotherapy and patients get more prone to infections, their amount must be checked regularly. Currently blood samples are taken for this purpose. In the first part of this work it was investigated, if the amount of white blood cells can be checked without taking blood by measuring H2O2. A correlation between the amount of exhaled H2O2 and the number of white blood cells could not be found. For a sensitive H2O2 measurement with an HRP electrode a quick exchange of electrons between electrode and enzyme is needed. One condition for this is a short distance between the active centre of the enzyme and the electrode surface. In order to achieve a short distance, several porous graphite-like materials made of pyrolysed cobalt porphyrins where used in the second part of this work for the electrode production. It turned out that one of the tested materials, which had pores about the same size as the enzyme, did exchange electrons with the enzyme about 200 times faster than solid graphite. HRP itself contains an iron protoporphyrin, i.e. a planar molecule consisting of four rings with an iron atom in the middle, its active centre. When HRP reacts with H2O2, it takes two electrons from the peroxide. One of these electrons is stored at the iron, the other in the ring system, until they are passed on to another molecule or the electrode. In the last part of this work, the iron was exchanged with osmium. The modified enzyme takes only one electron from peroxides. Thus it reacts slower with hydrogen peroxide, but faster with tert-butylhydroperoxide, an organic member of the peroxide family.

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2002. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains ix, 67 p. : ill. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 63-67).