Thesis (M.S.)--Northern Michigan University, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 56-67).

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Berlin.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2010. / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 283289.pdf: 1774666 bytes, checksum: 4cea65b80d632b894077e19814ee7a1e (MD5) / Neste trabalho foram desenvolvidas diferentes estratégias de imobilização da peroxidase, empregando como materiais nanoestruturados bicamadas lipídicas suportadas em Au (111) via SAMs de ditiotreitol (DTT) e nanopartículas de poliuretano peguiladas (PU-PEG). Foi possível constatar que a HRP foi imobilizada com sucesso nas bicamadas de DMPC suportadas em SAMs de DTT em Au (111), tendo sido possível a detecção de dopamina. No entanto, não foi possível realizar estudos de estabilidade, repetibilidade e reprodutibilidade pois o sistema se mostrou instável para fins de aplicação do dispositivo. Os resultados obtidos no estudo de caracterização das nanopartículas de PU-PEG indicaram que a técnica de AFM permitiu observar a forma, a distribuição das nanopartículas, assim como a interação das mesmas em diferentes suportes sólidos. Além disso, as nanopartículas de PU-PEG foram suportes adequados para a imobilização da peroxidase extraída do pinhão e o eletrodo de pasta de carbono construído com este sistema foi de fácil preparação, apresentando baixo custo, rapidez nas análises, boa sensibilidade e estabilidade na determinação de dopamina. Para a obtenção de informações mais precisas a respeito do processo de adsorção da peroxidase nas nanopartículas, foi realizado um estudo sistemático da interação da HRP purificada em nanopartículas de PU-PEG. O eletrodo de pasta de carbono modificado com a HRP imobilizada em nanopartículas de PU-PEG apresentou resultados adequados para a determinação de dopamina, hesperidina e diosmina, obtendo-se amplas faixas de concentração e baixos limites de detecção.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T17:53:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289049.pdf: 2194956 bytes, checksum: b452b6f1481004b823297a22e0146d91 (MD5) / Derivados maleimídicos, sintetizados a partir da filantimida, apresentam diversas atividades biológicas, sendo as mais relatadas: antifúngicas, antibacterianas e antitumorais. A inflamação é caracterizada por eventos celulares e bioquímicos. A mieloperoxidase (MPO) é uma importante enzima pró-oxidante e microbicida, liberada e ativada durante o processo de fagocitose dos neutrófilos, cuja atividade é essencial para uma efetiva resposta imune inata. O câncer é uma das doenças mais temidas pela sociedade, por causa do estigma de dor e morte. Dentre os diversos tipos de tumores, o melanoma é uma neoplasia maligna originada a partir dos melanócitos, e é a principal causa de morte por doença de pele, pois tem alta capacidade metastática. A leucemia é uma doença mesenquimal caracterizada pela proliferação ou maturação descontrolada de células mieloides e linfoides da medula óssea. A leucemia apresenta alta taxa de cura em crianças, porém, em adultos a taxa de remissão e cura é baixa, devido à resistência das células tumorais aos tratamentos. Este trabalho avaliou a ação de derivados maleimídicos sobre a atividade da enzima mieloperoxidase, além da atividade antitumoral destas substâncias em células de melanoma murino B16F10 e em células de leucemia murino L1210. A atividade da MPO foi monitorada através de métodos espectrofotométricos, através da oxidação da orto-dianisidina. A atividade citotóxica in vitro foi avaliada pela viabilidade celular e os mecanismos de morte avaliados por métodos colorimétricos e fluorimétricos. A atividade antimelanoma in vivo foi avaliada macroscopicamente e microscopicamente. Dos nove derivados maleimídicos avaliados, apenas dois, alteraram a atividade da MPO. As substâncias N-fenil-maleimida (M2) e 4-metil-N-fenil-maleimida (M5) induziram a atividade da MPO e a migração celular, indicando possível atividade pró-inflamatória. Quanto à atividade citotóxica in vitro, tanto para células melanoma B16F10 quanto para células leucêmicas L1210, os derivados maleimídicos cujo anel imídico apresentava-se ciclizado e sem substituintes, a atividade antitumoral foi significativa em concentrações de 10 µM. O provável mecanismo relacionado a ação antileucêmica é o estresse oxidativo, e o dano mitocondrial induzido pelas maleimidas. In vivo, observou-se que M2, M5 e 4-metoxi-N-fenil-maleimida (M7), reduziram o tamanho do tumor (57%, 67% e 42% respectivamente), e o número de animais com tumor (22%, 63% e 58% respectivamente). Os tratamentos inibiram a metástase pulmonar, e também apresentarem baixa toxicidade, conforme parâmetros histológicos, hematológicos e bioquímicos avaliados. N-fenil-etil-maleimida (M9) não apresentou atividade antitumoral no modelo avaliado, mas alterou parâmetros bioquímicos, indicando possível ação hepatotóxica. Conclui-se que os derivados maleimídicos apresentam atividade antitumoral, e este efeito está relacionado com a estrutura química, sendo os aspectos mais relevantes a proximidade entre o anel imídico e o anel aromático; a integridade do anel imídico e a ausência de substituintes nestes. O significativo efeito antitumoral in vivo observado para M2 e M5, pode também estar relacionado com a ação pró-inflamatória destas substâncias, visto que, vários estudos apontam a ativação da resposta imune inata como mecanismo para aumentar a resposta antimelanoma de quimioterápicos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T01:30:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290162.pdf: 1212939 bytes, checksum: 5e8f187e1033ccfb75a0911d3b9173f9 (MD5) / O presente trabalho apresenta a síntese de uma série de selenetos e selenóxidos com grande diversidade estrutural e a avaliação de seus potenciais para mimetizar a enzima glutationa peroxidase. Para este estudo empregou-se o método de Tomoda, o qual utiliza H2O2 como peróxido e PhSH como substituto da glutationa e acompanha-se a 305 nm a formação do PhSSPh (produto oxidado da reação). A estratégia sintética adotada permitiu a preparação de diversos compostos e, consequentemente, o estudo da relação de suas estruturas/atividades. Além disso, a partir de evidências cinéticas, foi proposto um novo ciclo catalítico para os mesmos, quando empregados na reação de oxidação de PhSH com H2O2. Os catalisadores de selênio sintetizados e empregados nesse estudo foram: Ebselen 1, benzil fenil seleneto 2, 1-(2-(benzil)benzilseleneto)pirrolidina 3, benzil fenil selenóxido 4, benzil(4-metóxifenil)selenóxido 5, benzil(3,5- bis(trifluorometil)fenil)selenóxido 6, (2-(benzil)fenilselenóxido)metanol 7, 1-(2- (benzil)benzilselenóxido)pirrolidina 8. Sabe-se que compostos orgânicos de selênio são catalisadores eficientes em uma variedade de reações de oxidação utilizando peróxidos, incluindo GPx like. Esta capacidade está intimamente associada à natureza eletrônica dos substituintes do catalisador. Sendo assim, com os compostos 2 - 8 em mãos, partiu-se para a investigação do uso dos mesmos, em quantidades catalíticas para obter-se a relação entre suas estruturas e atividades como miméticos da GPx, utilizando o Ebselen 1 como padrão. As atividades dos compostos foram apresentadas em termos de velocidades iniciais, a partir de um gráfico traçado pela Absorbância (em 305 nm) em função do Tempo. Os selenóxidos 4, 5 e 6 apresentaram atividade semelhante, concluindo-se que no mecanismo desse tipo de compostos como miméticos da GPx, os substituintes (doadores ou retiradores de elétrons) não causam grande influência na atividade catalítica. Porém, quando empregou-se os selenóxidos 7 e 8, houve um significativo aumento da velocidade de formação do produto (PhSSPh) em comparação com os outros selenóxidos. Esta diferença de atividade foi associada ao fato de que nos selenóxidos 7 8 os átomos de nitrogênio ou oxigênio podem quelar-se ao átomo de selênio. Com o intuito de determinar o mecanismo da reação, realizou-se alguns ensaios em quantidades estequiométricas, a fim de facilitar a observação da formação do PhSSPh. Foram preparadas soluções dos compostos 2 e 4 como ativadores de H2O2, na oxidação de PhSH, ambas em metanol. O mecanismo da reação de selenetos e selenóxidos como miméticos da GPx, utilizando-se PhSH como cofator, foi revisado. As evidências experimentais e cinéticas observadas sugeriram que durante a oxidação de PhSH pelos selenóxidos na presença de H2O2 uma nova espécie, presume-se que seja a perhidróxi selenona, foi formada. Esta espécie é um melhor agente oxidante do que o selenóxido. Isso se deve, pois nos ensaios realizados, a velocidade inicial de oxidação do PhSH frente ao H2O2, ativada por selenóxidos, foi 9000 vezes maior do na reação sem peróxido. Além disso, selenóxidos não foram reduzidos ao correspondente seleneto, como era descrito previamente, uma vez que isolou-se o mesmo depois de 30 minutos de reação.

Neste trabalho é apresentado um estudo da imobilização da enzima horseradish peroxidase (HRPO) em matriz polimérica através de dois métodos diferentes. O primeiro consiste em um método de uma etapa, no qual a HRPO é imobilizada por eletropolimerização de pirrol em meio aquoso com eletrodo de platina – técnica esta denominada entrapment – visando a confecção de biossensores enzimáticos para a detecção amperométrica de peróxido de hidrogênio (H2O2). A matriz polimérica com a enzima imobilizada foi analisada por reação colorimétrica, confirmando as afirmações de alguns autores sobre a baixa quantidade de enzima imobilizada, e FTIR mostrando espectros bastante semelhantes entre os filmes de polipirrol (PPy) puro e de PPY + HRPO. Foram realizados estudos do efeito das concentrações de monômero, enzima e eletrólito, assim como dos parâmetros eletroquímicos para a otimização da preparação do biossensor. Os valores dos parâmetros otimizados serviram de referência para o estudo do segundo método de imobilização, no qual é utilizado um anticorpo específico para a enzima HRPO, o V3.5R3, imobilizado via entrapment com a HRPO inoculada ao sistema através da imersão do substrato formado (PPy-V3.5R3) em uma solução de HRPO. Os dois métodos de confecção dos biossensores para a determinação quantitativa de H2O2 são comparados: em relação ao parâmetro comportamento linear, verificou-se uma faixa de concentração de 0 a 15 mmol/L de H2O2 para o método via entrapment, enquanto que através do método com inoculação foi verificado um comportamento linear de 2 a 8 mmol/L de H2O2. Em relação à resposta do biossensor, tem-se para a concentração de 8 mmol/L de H2O2, uma corrente de aproximadamente 600 nA utilizando biossensores preparados pelo método de entrapment e 300 nA pelo método com inoculação. Apesar do baixo desempenho da imobilização do anticorpo V3.5R3 para a detecção de H2O2, o sucesso na imobilização de diferentes biocomponentes e o desenvolvimento de mecanismos como a inoculação amplia o espectro de possibilidades para o estudo de biossensores. / In this work is presented a study of the immobilization of the enzyme horseradish peroxidase (HRPO) in polymeric matrix by two different methods. The first one consist in a one-step method, in which the HRPO is immobilized by electropolymerization of pyrrole in aqueous solution onto platin electrode – techniques denominated entrapment – aiming the confection of enzymatic biosensors for the amperometric detection of hydrogen peroxide (H2O2). The polymeric matrix with the immobilized enzyme (substrate PPy-HRPO) was analyzed by colorimetric reaction, confirming the affirmations of some authors about the low quantities of enzymatic immobilization, and FTIR, what shows very similar specters for the polypyrrole (PPy) film and the PPy + HRPO. Studies of the concentrations of monomer, enzyme and electrolyte, as well as of the electrochemical parameters, have been carried through for the optimization of the biossensor. The values of the optimized parameters were used as reference for the study of the second immobilization method, in which is used a specific antibody for enzyme HRPO, the V3.5R3, immobilized via entrapment. The HRPO is, then, inoculated to the system by immersion of the PPy-V3.5R3 substrate in HRPO solution. The results of the biossensores confectioned by the two methods are compared: about the linear behavior it was verified a range of concentration form 0 to 15 mmol/L of H2O2, while through the second method was verified a linear range of 2 to 8 mmol/L of H2O2. About the signal response, for the same concentration of 8 mmol/L of H2O2, an electric current of 600 nA was reached, against 300 nA with the biosensors constructed by the second method. Although the low performance of the immobilization of the antibody V3.5R3 for the H2O2 detection, the success in different biocomponents immobilization and the development of mechanisms as the inoculation increases the possibilities specter for biosensors research.

FONTENELE, A. V. de. Defesa antioxidativa em plantas de arroz duplamente silenciadas nas APXs citosólicas e expostas a estresses abióticos. 93 f. 2011. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T17:21:05Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Rejected by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br), reason: descrição on 2013-05-20T19:16:48Z (GMT) / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:16Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to characterize physiological and biochemical aspects that show if rice plants (Oryza sativa) knockdown on cytosolic ascorbate peroxidase enzyme (cAPX) are more susceptible to oxidative stress than the wild type plants. APX is an important enzyme from oxidative metabolism of plants, acting on regulation of the endogenous levels of hydrogen peroxide (H2O2). For this, rice plants knockdown on cAPX (Apx1/2s) and wild type (WT) were used for the experimentation. The plants were silenced by interference RNA technical (iRNA) and were grown for 35 days into 1.5 L pots containing nutritive solution under greenhouse conditions. The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiológicos e bioquímicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosólica peroxidase do ascorbato (cAPX) são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX é uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulação dos níveis endógenos do peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas não transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentação. As plantas foram silenciadas pela técnica do RNA de interferência (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo solução nutritiva sob condições de casa de vegetação. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologênio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicação dos seguintes estresses abióticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nível basal de H2O2 maior do que os níveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nível de H2O2 próximo de um nível de sinalização celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 após 1h de tratamento sugere a necessidade de um nível sinalizador de H2O2 para ativação dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteúdo de H2O2, indicando uma provável remoção do excesso de H2O2. Após 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existência de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s não apresentaram diferenças nos parâmetros fotoquímicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossíntese em condições controle. A dissipação do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em média, maior que das plantas WT, indicando uma possível maior eficiência na dissipação de energia. Mesmo com eficiente dissipação de energia ambas as plantas não conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibição e danos no aparato fotossintético (Fv/Fm). Em relação às plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condições controle, na provável tentativa de compensar a ausência da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplástica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausência da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteção antioxidativa para compensar essa ausência e responder mais rápida e eficientemente a situações de estresse.

CASTRO, J. L. S. A toxidade do ácido ascórbico em plantas de arroz silenciadas nas APXs cloroplásticas induz estresse oxidativo não dependente da fotossíntese. 2014. 79 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-22T18:39:40Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jlscastro.pdf: 1579441 bytes, checksum: 4f35a992cef56b64959af93486c78676 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-29T19:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jlscastro.pdf: 1579441 bytes, checksum: 4f35a992cef56b64959af93486c78676 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T19:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jlscastro.pdf: 1579441 bytes, checksum: 4f35a992cef56b64959af93486c78676 (MD5) Previous issue date: 2014 / Ascorbic acid (AA) is one of the most important antioxidants in plant protection against the oxidative stress generated by abiotic stresses. In animal cells, several works have shown that high concentrations of this acid can cause toxicity and cell death. The proposed mechanism is related to a pro-oxidant action by the reduction of Fe+3 to Fe+2 and by the action of this Fe+2 in the Fenton reaction with generation of reactive oxygen species (ROS). To the best of our knowledge, this mechanism has not been reported yet. The objective of this work was to elucidate toxicity mechanisms of high concentrations of AA in plants using rice mutants with deficiency (gene silencing) in two chloroplastic APX (stromal and thylakoidal) as model. Forty-five days old silenced plants and non-transformed (NT) were exposed to 10 mM (moderate concentration) and 50 mM (high concentration) of exogenous AA (sprayed on leaves). These concentrations were defined based on dose-dependent experiments from 0 to 50 mM using leaf segments in plates. In order to assess the protective effect (antioxidant) of the AA, plants and leaf segments were exposed to high light intensity (1000 µmol m-2 s 1) to induce photooxidative stress. AA concentrations higher than 30 mM induced oxidative stress (increase in the TBARS level) in leaf segments and this effect was enhanced by high light. In addition to the oxidative damage, these AA concentrations induced an increase in membrane damage (electrolytes leakage) and reduction in photosystem II integrity (Fv/Fm). Interestingly, the 10 and 20 mM concentrations did not mitigate the negative effects caused by the light excess. The high AA concentration (50 mM) induced leaf senescence under high light, indicated by the decrease in chlorophyll and carotenoids contents. Plants deficient in two chloroplast APX (APX7/8) displayed higher sensibility to AA toxicity, especially in combination with high light. These effects were indicated by exhibition of higher levels of TBARS (lipid peroxidation), electrolyte leakage, H2O2 and superoxide radical. Curiously, the transgenic plants under high AA concentrations did not exhibited differences for several photosynthetic parameters: CO2 assimilation rate and PSII (ΦPSII, ETR, NPQ e Fv/Fm) and PSI efficiency indicators (ΦPSI, ETR e P700), apart from the estimation of cyclic flux (CEF), compared with NT. Despite the AA toxicity have not changed the parameters of photosynthesis in APX-deficient plants, the sole presence of high light caused changes in some parameters of photochemical activity in these plants.The data set of this work shows that the excess of AA may cause toxicity in plants. The intensity of these effects is strongly enhanced by the excess of light but they are not dependent on photosynthesis. In this work, the roles of the two chloroplastic APX and/or high light on the AA toxicity still unclear, despite the deficient plants had showed increased sensibility. Apparently, the mechanism of AA toxicity in plants is similar to the proposed for animal cells.This antioxidant, when in excess, can act as a pro-oxidant stimulating Fenton reactions, inducing the accumulation of ROS and resulting oxidative stress. Further studies are needed to elucidate the role of the chloroplast APXs and high light on the toxicity of ascorbic acid in plants. / O ácido ascórbico (AA) é um dos antioxidantes mais importante na proteção das plantas contra o estresse oxidativo gerado por estresses abióticos. Em células animais, diversos trabalhos têm demonstrado que concentrações elevadas desse ácido podem causar toxicidade e morte celular. O mecanismo proposto é de uma ação pro-oxidante, por meio da redução de Fe+3para Fe+2 e ação desse último na reação de Fenton, com geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Até o nosso conhecimento, esse mecanismo ainda não foi relatado em plantas. O objetivo deste trabalho foi elucidar mecanismos de toxicidade de concentrações elevadas de AA em plantas, utilizando como modelo mutantes de arroz com deficiência (silenciamento gênico) nas duas APX de cloroplasto (estromal e tilacoidal). Plantas silenciadas e não transformadas (NT) com 45 dias de idade foram expostas a 10 mM (concentração moderada) e 50 mM (concentração elevada) de AA exógeno (pulverizado nas folhas). Essas concentrações foram definidas a partir de experimentos dose-dependente de 0 a 50 mM utilizando segmentos foliares em placa. No sentido de avaliar o efeito protetor (antioxidante) do AA, plantas e segmentos foliares foram expostos a intensidade de luz elevada (1000 µmol m-2 s-1) para induzir estresse fotoxidativo. Concentrações de AA acima de 30 mM induziram estresse oxidativo (aumento no nível de TBARS) em segmentos de folhas e esse efeito foi potencializado por luz elevada. Além de dano oxidativo, esses níveis de AA induziram aumento no dano de membrana (vazamento de eletrólitos) e redução na integridade do fotossistema II (Fv/Fm). É interessante notar que as concentrações de 10 e 20 mM de AA não mitigaram os efeitos negativos causados pelo o excesso de luz. A concentração elevada de AA (50 mM) induziu senescência foliar na presença de luz elevada, indicada por redução nos conteúdos de clorofilas e carotenoides. As plantas deficientes nas duas APXs de cloroplasto (APX7/8) apresentaram maior sensibilidade a toxicidade do AA, especialmente na combinação com luz elevada. Esses efeitos foram indicados por exibirem maiores níveis de TBARS (peroxidação lipídica), vazamento de eletrólitos, H2O2e radical superóxido. Curiosamente, as plantas mutantes na presença de AA elevadonão apresentaram diferenças em diversos parâmetros da fotossíntese: taxa de assimilação de CO2 e indicadores de eficiência doFSII (ΦPSII, ETR, NPQ e Fv/Fm) e FSI (ΦPSI, ETR e P700), além da estimativa do fluxo cíclico (CEF), quando compradas com as NT. A despeito da toxicidade de AA não ter alterado os parâmetros da fotossíntese nas plantas deficientes em APX, a presença de luz elevada, isoladamente, causou mudanças em alguns parâmetros da atividade fotoquímica nessas plantas. O conjunto dos dados deste trabalho mostra que o excesso de AA pode causar toxicidade em plantas. A intensidade desses efeitos é fortemente potencializada pelo excesso de luz, mas eles não são dependentes da fotossíntese. O papel das duas APXs de cloroplasto e da luz elevada na toxicidade de AA não ficou claro neste trabalho, apesar das plantas deficientes terem mostrado maior sensibilidade. Aparentemente, o mecanismo de toxicidade de AA em plantas é semelhante ao proposto para células animais. Esse antioxidante quando em excesso pode atuar como pro-oxidante estimulando as reações de Fenton, induzindo a acumulação de EROs e gerando estresse oxidativo. Novos estudos são necessários para elucidar o papel das APXs de cloroplasto e da luz elevada na toxicidade de ácido ascórbico em plantas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-08-01T04:10:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347210.pdf: 3165267 bytes, checksum: d309f673326fd96a18cbb10863c68a11 (MD5) Previous issue date: 2016 / A cultura da macieira (Malus domestica BORKH) é uma das principais da região sul do Brasil. Na região serrana do sul do Brasil, há condições climáticas ideais para o cultivo, com horas de frio necessárias durante o inverno. Porém na primavera e o verão, a cultura pode ser severamente afetada por doenças, em especial pela mancha foliar de Glomerella (MFG) e a podridão amarga (PA), ambas ocasionadas por espécies do gênero Colletotrichum. Em campo, frutos afetados pelo agente causal da MFG apresentam pequenas lesões marrons, que normalmente não evoluem para PA. Assim, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o processo infeccioso de isolados de Colletotrichum fructicola com diferentes níveis de agressividade provenientes de folhas e frutos, bem como as respostas de defesas bioquímicas e histológicas que os frutos apresentam durante a interação com o patógeno. Realizaram-se três experimentos a campo nas safras de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016 em plantas da cultivar Gala. Realizaram-se inoculações de isolados de C. fructicola (MANE 41, proveniente de frutos com PA, e MANE 147, proveniente de folhas com MFG) em três estágios de desenvolvimento dos frutos (J1, J2, J3) e foi avaliada a incidência dos frutos com doença em plantas mantidas em campo experimental. Quando no ponto de maturação, parte dos frutos previamente inoculados foram colhidos e levados à câmara fria e as infecções quiescentes avaliadas na fase pós-colheita. Em experimento sob condições controladas, frutos colhidos em três estágios de desenvolvimento (J1, J2, L) foram utilizados para a avaliação de patogenicidade de quatro isolados de C. fructicola (MANE 34, 41, 57 e 147), para a determinação da atividade de proteínas relacionadas à patogênese e para a quantificação de compostos fenólicos totais. Ainda foi avaliada por histopatologia a interação dos isolados com os frutos. Frutos inoculados no campo com o isolado MANE 147 apresentaram pequenas lesões durante o estágio J1 (fruto verde) na safra de 2013/2014 e no estágio J1 e J3 (fruto no início da maturação) na safra 2015/2016. O isolado MANE 41 só provocou pouca doença em frutos verdes inoculados em campo. Porém, os frutos, quando levados à câmara fria, apresentaram PA quando inoculados com o isolado MANE 41 durante os três estágios de desenvolvimento, nas três safras avaliadas, e quando inoculados com o isolado MANE 147 nas safras de 2014/2015 e 2015/2016. Em contraste, frutos inoculados com o isolado MANE 147, na safra de 2013/2014, só foram observadas pequenas lesões marrons e essas não evoluíram para PA. Nas analises microscópicas foi observado que células reagiram à infecção fúngicapela forte fluorescência devido ao acúmulo de compostos fenólicos presentes nas células epidérmicas e do mesocarpo. Em laboratório, no teste de patogenicidade de frutos de maçã nos três estágios de desenvolvimento, somente o isolado MANE 57 provocou PA em frutos. com ou sem ferimento. O isolado MANE 41 somente provocou PA quando inoculado no estágio J2 (fruto intermediário) e L (fruto maduro) e com a presença ferimento. O isolado MANE 147 provocou pequenas lesões marrons durante os estágios J1 e J2 sem ferimento, e lesões restritas em frutos com ferimento. O isolado MANE 34 não provocou PA nos frutos com ou sem ferimento. A atividade das enzimas peroxidases (POX), fenilalanina-amonia liase (FAL) e a concentração de compostos fenólicos totais (CFT) em frutos de maçã foram alteradas pela inoculação de isolados de C. fructicola. Na análise microscópica observou-se que o isolado MANE 57 colonizou as células da epiderme e mesocarpo durante os três estágios de desenvolvimento do fruto. Os isolados MANE 34, 41 e 147 ficaram quiescentes nos frutos nos estágios J1 e J2. Pode-se concluir que a campo, isolados de C. fructicola causam lesões nos frutos, que podem evoluir para PA no pós-colheita, independente do isolado utilizado ou do estágio de desenvolvimento no qual o fruto havia sido inoculado. Sob condições controladas, os isolados de C. fructicola podem causar PA com diferentes graus de agressividade nos frutos, independente do estagio de desenvolvimento e, mesmo ocorrendo a ativação de alguns mecanismos de defesa no fruto, o desenvolvimento da doença não é interrompido.<br> / Abstract : Apple tree (Malus domestica BORKH) is one of the main cultivations in Southern Brazil. In the mountain southern region of Brazil, the weather conditions are ideal for the crop by having the needed amount of cold hours during wintertime. However, during spring and summer seasons, apple crop can be severely affected by some diseases. Particularly by Glomerella leaf spot (GLS) and apple bitter rot (ABR), both caused by species from genus Colletotrichum. On field, fruits affected by GLS show little brownish spots that in general will not evolve to ABR. This study wants to evaluate the infectious process on Colletotrichum fructicola by using isolates taken from leaves and fruits presenting different severity degrees and evaluating biochemical and histological defense responses shown during interaction with the pathogen. Three field experiments with Gala crop plants were performed during the seasons of 2013/2014, 2014/2015 and 2015/2016. Inoculations of Colletotrichum fructicola isolates during three different fruit development stages (J1, J2 and J3) were done (MANE 41, from fruits with ABR, and MANE 147, from leaves with GLS), as well as the evaluation of the disease incidence on plants maintained in experimental field. In relation with maturation, part of the fruits previously inoculated were harvested and sent to a cold chamber; in aims to evaluate quiescent infections during post-harvest stage. In the microscopic analysis was observed that cells responded to the fungal infection by the strong fluorescence due to the accumulation of phenolic compounds present in epidermal and mesocarp cells. An experiment was conducted to evaluate the pathogenicity of four isolates C. fructicola (MANE 34, 41, 57 and 147) in fruits harvested in three different development stages (J1, J2 and L), under controlled conditions. These fruits were also used to determine the activity of proteins involved in the pathogenesis and quantifying the total phenolic compounds. In addition, histopathology and interaction of isolates and fruits were evaluated. Fruits inoculated on field with the isolate MANE 147 showed little injuries in stage J1 (unripe fruit) during the 2013/2014 season and in stages J1 and J3 (starting maturation) during 2015/2016 season. The MANE 41 isolate only provoke little disease on unripe fruits inoculated on field. However, fruits sent to cold chamber and inoculated with MANE 41 showed ABR in the three development stages and during the three seasons and also during the seasons 2014/2015 and 2015/2016 when inoculated with MANE 147. In contrast, fruits inoculated with MANE 147 during 2013/2014 season only exibited little brownish spots and they didn?tevolve to ABR. In the lab, during the pathogenicity test only the isolate MANE 57 provoked ABR independently of the presence of injury, on fruits of the three development stages. MANE 41 only provoked ABR when inoculated during stage J2 (intermediary fruit) and L (mature fruit) and in the presence of injury. MANE 147 isolate, provoked little brownish spots during I and II stages in the absence of injury, and a wound restricted to fruits with injury. MANE 34, didn?t provoke ABR either in presence or absence of injury. The activity of the enzymes peroxidases (POX) and phenylalanine ammonia-lyase (FAL) and concentration of total phenolic compounds (CFT) in apple fruits were altered by the inoculation of C. fructicola isolates. In the microscopic analysis it was observed that the isolate MANE 57 colonized the cells of the epidermis and mesocarp during the three stages of development of the fruit. MANE 34, 41 and 147 isolates are quiescent in fruits in stages J1 and J2. We can conclude that in field isolates of C. fructicola can cause injuries in fruits which can evolve in ABR during the post-harvesting season, independently of the isolate used or development stage when isolate is inoculated. Under controlled conditions isolates of C. fructicola succeed to provoke ABR at different severity degrees in fruits disregarding the stage of development; even in presence of some defense mechanisms on fruits, the development of disease is not suspended.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012. / Made available in DSpace on 2013-06-25T23:45:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314819.pdf: 1098085 bytes, checksum: bd70802185c208ad297487a645311564 (MD5) / O probucol é um composto antilipidêmico que apresenta propriedades anti-inflamatória e antioxidante em diferentes modelos experimentais de neurotoxicidade/neuropatologia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de explorar o possível efeito protetor deste fármaco sobre o modelo experimental da doença de Alzheimer (DA), além de tentar elucidar seu mecanismo de proteção através de experimentos in vitro e in vivo. A DA é uma condição neurodegenerativa, caracterizada por perda cognitiva e alterações no comportamento, e o mecanismo de neurodegeneração na DA parece estar relacionado com o processo de estresse oxidativo. Inicialmente, foi avaliado o possível efeito protetor do probucol contra a neurotoxicidade induzida pela administração intracerebroventricular (i.c.v.) do peptídeo B-amilóide 1-40 (AB1-40) em camundongos através de parâmetros comportamentais, bioquímicos e imuno-istoquímicos. A administração do AB1-40 resultou em danos na memória e aprendizado dos animais, bem como diminuição nos níveis de sinaptofisina e aumento na atividade da acetilcolinesterase (AChE) hipocampal. O tratamento com probucol (10 mg/kg/dia, durante 2 semanas) atenuou os efeitos deletérios causados pelo peptídeo AB1-40, como danos cognitivos e bioquímicos (aumento da peroxidação lipídica e da atividade da enzima acetilcolinesterase; e perda sináptica) no hipocampo dos animais. Estudos anteriores demonstraram que o probucol pode aumentar a atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase (GPx), envolvida na detoxificação de peróxidos intracelulares. Assim, com o objetivo de investigar os efeitos do probucol sobre a atividade e expressão desta enzima ensaios in vitro e in vivo foram realizados. O probucol (10 µM) foi capaz de aumentar significativamente a atividade da GPx em cultura de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y), embora não tenha aumentado a quantidade dessa proteína. Além disso, o tratamento com probucol (3 e 10 µM) protegeu as células SH-SY5Y da citotoxicidade e da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) induzida por hidroperóxido orgânico. Da mesma forma, camundongos tratados com probucol (10 mg/kg/dia, durante 5 semanas) mostraram um aumento na atividade da GPx no fígado, rim, coração e hipocampo, mas os níveis da enzima não foram alterados nesses tecidos. Por fim, os estudos enzimáticos com a GPx-1 purificada mostraram que o probucol (10 e 30 nM) foi capaz de modular positivamente a atividade dessa enzima, aumentando a velocidade máxima (Vmax) quando foi utilizado um gradiente de concentração de glutationa (GSH) ou de tert-butilhidroperóxido (tBuOOH); enquanto que valores de KM não foram modificados. Em conjunto, os dados aqui apresentados mostram, pela primeira vez, que o probucol é capaz de aumentar diretamente a Vmax da GPx-1. Considerando que (i) o probucol mostrou um papel protetor em um modelo experimental da DA, que (ii) o composto preveniu a morte celular induzida por peróxidos e aumentou a atividade da GPx-1 in vitro e in vivo, e que (iii) esta enzima apresenta um importante papel na patofisiologia de condições neurodegenerativas. Nesse contexto, o presente estudo apresenta um novo alvo e mecanismo de ação para um "antigo fármaco", onde a modulação da atividade da GPx pode representar uma importante estratégia terapêutica.<br> / Abstract : Probucol is a lipid-lowering agent with anti-inflammatory and antioxidant properties, which plays protective effects in experimental models of neurotoxicity/neuropathology. The present study was aimed to explore the possible protective effect of this drug on experimental model of Alzheimer's disease (AD), and attempt to elucidate its mechanism of protection through in vitro and in vivo experiments. AD is a neurodegenerative disorder characterized by cognitive impairment and behavioral changes, and the mechanisms of neurodegeneration of this disease appear to be related to the process of oxidative stress. Initially, we evaluated the possible protective effect of probucol against the neurotoxicity induced by intracerebroventricular (icv) administration of ?-amyloid peptide 1-40 (AB1-40) in mice through behavioral, biochemical and immunohistochemical parameters. The administration of AB1-40 resulted in damage to the memory and learning of animals, as well as decreased levels of synaptophysin and increased acetylcholinesterase (AChE) activity in hippocampus. Treatment with probucol (10 mg/kg/day, for 2 weeks) attenuated the deleterious effects caused by the peptide AB1-40, such as cognitive impairment and biochemical changes (increased acetylcholinesterase activity, lipid peroxidation and synaptic loss in the hippocampus). Previous studies have shown that probucol may increase the activity of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx), involved in the detoxification of intracellular peroxides. Thus, in order to investigate the effects of this phenolic compound on the expression and activity of the GPx in vitro and in vivo experiments were performed. Probucol (10 µM) significantly increased GPx activity in in vitro experiments with cultured human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) without increasing the amount of this protein. Furthermore, treatment with probucol (3 and 10 µM) protected against SH-SY5Y cells cytotoxicity and production of reactive oxygen species (ROS) induced by organic hydroperoxide. Similarly, mice treated with probucol (10 mg/kg/day, for 5 weeks) showed an increase in the GPx activity in liver, kidney, heart and hippocampus, but the enzyme levels were not altered in these tissues. Finally, the enzymatic studies with purified GPx-1 showed that probucol (10 and 30 nM) was able to positively modulate the activity of this enzyme by increasing the maximum velocity (Vmax) when a concentration gradient of glutathione (GSH) or tert-butyl hydroperoxide (tBuOOH) was used, while KM values were not modified. Taken together, these data show for the first time that probucol is capable of directly increasing the Vmax of GPx-1, and this event is probably related to the increased GPx-1 activity in cell culture and in mice. Taking into account that (i) probucol showed a neuroprotective role in an experimental model of AD, (ii) the compound prevented cell death induced by peroxides and increased the activity of GPx-1 in vitro and in vivo, and (ii) this enzyme has an important role in the pathophysiology of neurodegenerative diseases.. In this scenario, this study represents a new target and mechanism of action for an "old drug", where the modulation of its activity may represent an important therapeutic strategy.