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Salmonella causes gastrointestinal illness in humans. The purpose of the study was to determine the relative contribution of different food commodities to sporadic cases of salmonellosis (attribution analysis) caused by Salmonella Newport (SN) using Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) patterns and antimicrobial sensitivity (AST) data submitted by public health laboratories and regulatory agencies from 2003 to 2006. The genetic relationship between isolates from non-human (348) and human (10,848) sources was studied by two unique clustering methods: UPGMA and Ward. Results show poultry was the highest contributor of human SN infections, followed by tomatoes and beef. Beef was the largest contributing food commodity of multi-drug resistant (MDR)-AmpC infection patterns. Results from this pilot study show that PFGE and AST can be useful tools in performing attribution analysis at the national level and that SN MDR-AmpC patterns are decreasing and seem to be restricted to isolates from animal sources.

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: Introdução: o isolamento de estafilococos coagulase negativos (ECN) de pacientes em Unidades de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) pode representar, muitas vezes, uma contaminação ao invés de bacteremia. O padrão ouro para o diagnóstico de sepse neonatal é a positividade de duas hemoculturas coletadas num intervalo de 48 horas associada às manifestações clínicas sugestivas de sepse. A resistência aos antimicrobianos e a formação de biofilme são fatores seletivos na persistência de cepas de S. epidermidis e S. haemolyticus. A técnica de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE), altamente discriminatória, é frequentemente usada para a investigação de surtos. A tipagem por Multilocus Sequence Typing (MLST) se tornou o método de escolha no estudo epidemiológico em longo prazo. Objetivos: esse estudo teve como objetivos caracterizar o perfil das infecções de corrente sanguínea por Staphylococcus spp. em RNs internados na UTIN, os fatores de risco para infecção, perfil de virulência e resistência antimicrobiana dos estafilococos isolados, bem como a presença de clones prevalentes na unidade. Resultados: foram isolados 72 Staphylococcus spp. de hemoculturas de 54 recém-nascidos de Março de 2014 a Agosto de 2015. Foram confirmados 37 episódios de Infecção da Corrente Sanguínea (ICS) causados por Staphylococcus spp., sendo 27 associados a espécie S. epidemidis, 3 S. haemolyticus, 2 S. capitis e 5 S. aureus. A maioria dos Recém-nascidos (RNs) possuía extremo baixo peso, nasceu com me... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Abstract Introduction: The isolation of coagulase negative staphylococci (CoNS) of Neonatal Intensive Care Unit (NICU) patients can often represent contamination instead of bacteremia. The golden standard for the diagnosis of sepsis is the positivity of two blood cultures, collected within a 48-hour gap, associated to clinic manifestations suggestive of sepsis. Resistance to antimicrobials and biofilm formation are selective factors to S. epidermidis and S. haemoyticus strains to persist. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), a highly discriminatory technique, is often used in investigating outbreaks. Multilocus Sequence Typing (MLST) has become the preferred method when it comes long-term epidemiologic studies. Objectives: this research aimed to characterize the profile of infections caused by Staphylococcus spp. at NICU, the virulence profile and antimicrobial resistance of isolated staphylococci, as well as the presence of clusters prevalent in the unit. Results: 72 Staphyloccocus spp. have been isolated from blood cultures taken from 54 newborns from March 2014 to August 2015. Thirty-seven bloodstream infection (BSI) episodes caused by Staphylococcus spp. were confirmed, 27 of which are associated to S. epidemidis, 3 to S. haemolyticus, 2 to S. capitis and 5 to S. aureus. Most newborns presented extremely low weight, were born before the 31st week of pregnancy (72.2%), used catheter and mechanical ventilation. From the 72 samples of Staphylococcus spp. under analysis, ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As características fenotípicas e genotípicas de 203 isolados de Enterococcus spp. proveniente de diferentes amostras clínicas em dois hospitais localizados na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil, foram estudadas. As espécies foram identificadas através de testes bioquímicos convencionais e pelo uso do sistema automatizado VITEK 2 (BioMérieux). As concentrações inibitórias mínimas (CIM) para aminoglicosídeos foram determinadas pelo método de diluição em ágar. O alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) e à ampicilina foi avaliado pelo mesmo método e adicionalmente pelo método de disco-difusão. A diversidade genética de amostras de Enterococcus faecalis com HLAR foi determinada através da digestão do DNA cromossômico com a enzima SmaI seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE). O E. faecalis foi a espécie mais prevalente (93,6%) seguido por E. faecium (4,4%). A resistência entre os isolados clínicos foi de 2,5% à ampicilina, 0,5% à vancomicina, 0,5% à teicoplanina, 33% ao cloranfenicol, 2% à nitrofurantoína, 62,1% à eritromicina, 64,5% à tetraciclina, 24,6% à rifampicina, 30% ao ciprofloxacino e 87,2% à quinupristina-dalfopristina. A prevalência de HLAR foi de 10,3%, sendo 23,6% para gentamicina e 37,4% para estreptomicina. A maioria das amostras sensíveis aos aminoglicosídeos pelo método de disco-difusão apresentaram CIM inferior a 125 μg/mL e 500μg/mL para gentamicina e estreptomicina, respectivamente. A prevalência de Enterococcus resistentes à vancomicina (ERV) foi muito baixa neste estudo. Um grupo clonal predominante foi encontrado entre amostras de E. faecalis com HLR-Ge/St. Os isolados incluídos no grupo clonal foram provenientes de ambos os hospitais, indicando uma disseminação intra e inter-hospitalar deste clone. / The phenotypic and genotypic characteristics of 203 Enterococcus spp isolates recovered from different clinical sources of two hospitals in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil, were studied. The species were identified by conventional biochemical tests and the automated system VITEK 2 (BioMérieux). The minimal inhibitory concentrations (MIC) for aminoglycosides were evaluated by agar dilution method. The evaluation of high-level resistance to aminoglycosides (HLAR) and resistance to ampicillin were carried out by the same method as well as by the disc-diffusion method. The genetic diversity of HLAR E. faecalis was assessed by pulsed-field gel electrophoresis of cromossomal DNA after SmaI digestion. The E. faecalis was the most frequent specie (93.6%), followed by E. faecium (4.4%). The percentage of resistance among the clinical isolates was: 2.5% to ampicillin, 0.5% to vancomycin, 0.5% teicoplanin, 33% to chloramphenicol, 2% to nitrofurantoin, 66.1% to erythromycin, 66.5% to tetracycline, 24.6% to rifampicin, 30% to ciprofloxacin and 87.2% to quinupristin-dalfopristin. A total of 10.3% proved to be HLAR, with 23.6% resistant to gentamicin and 37.4% to streptomycin. Most of the aminoglycosides susceptible isolates by the disc-diffusion method presented MIC lower than 125 μg/mL and 500μg/mL for gentamicin e streptomycin, respectively. The prevalence of vancomycin resistance Enterococcus (VRE) was very low in this study. One predominant clonal group was found among E. faecalis exhibiting HLR-Ge/St. The isolates included in the clonal group were recovered from both hospitals, indicating both intrahospital and interhospital spread of this clone.

As características fenotípicas e genotípicas de 203 isolados de Enterococcus spp. proveniente de diferentes amostras clínicas em dois hospitais localizados na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil, foram estudadas. As espécies foram identificadas através de testes bioquímicos convencionais e pelo uso do sistema automatizado VITEK 2 (BioMérieux). As concentrações inibitórias mínimas (CIM) para aminoglicosídeos foram determinadas pelo método de diluição em ágar. O alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) e à ampicilina foi avaliado pelo mesmo método e adicionalmente pelo método de disco-difusão. A diversidade genética de amostras de Enterococcus faecalis com HLAR foi determinada através da digestão do DNA cromossômico com a enzima SmaI seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE). O E. faecalis foi a espécie mais prevalente (93,6%) seguido por E. faecium (4,4%). A resistência entre os isolados clínicos foi de 2,5% à ampicilina, 0,5% à vancomicina, 0,5% à teicoplanina, 33% ao cloranfenicol, 2% à nitrofurantoína, 62,1% à eritromicina, 64,5% à tetraciclina, 24,6% à rifampicina, 30% ao ciprofloxacino e 87,2% à quinupristina-dalfopristina. A prevalência de HLAR foi de 10,3%, sendo 23,6% para gentamicina e 37,4% para estreptomicina. A maioria das amostras sensíveis aos aminoglicosídeos pelo método de disco-difusão apresentaram CIM inferior a 125 μg/mL e 500μg/mL para gentamicina e estreptomicina, respectivamente. A prevalência de Enterococcus resistentes à vancomicina (ERV) foi muito baixa neste estudo. Um grupo clonal predominante foi encontrado entre amostras de E. faecalis com HLR-Ge/St. Os isolados incluídos no grupo clonal foram provenientes de ambos os hospitais, indicando uma disseminação intra e inter-hospitalar deste clone. / The phenotypic and genotypic characteristics of 203 Enterococcus spp isolates recovered from different clinical sources of two hospitals in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil, were studied. The species were identified by conventional biochemical tests and the automated system VITEK 2 (BioMérieux). The minimal inhibitory concentrations (MIC) for aminoglycosides were evaluated by agar dilution method. The evaluation of high-level resistance to aminoglycosides (HLAR) and resistance to ampicillin were carried out by the same method as well as by the disc-diffusion method. The genetic diversity of HLAR E. faecalis was assessed by pulsed-field gel electrophoresis of cromossomal DNA after SmaI digestion. The E. faecalis was the most frequent specie (93.6%), followed by E. faecium (4.4%). The percentage of resistance among the clinical isolates was: 2.5% to ampicillin, 0.5% to vancomycin, 0.5% teicoplanin, 33% to chloramphenicol, 2% to nitrofurantoin, 66.1% to erythromycin, 66.5% to tetracycline, 24.6% to rifampicin, 30% to ciprofloxacin and 87.2% to quinupristin-dalfopristin. A total of 10.3% proved to be HLAR, with 23.6% resistant to gentamicin and 37.4% to streptomycin. Most of the aminoglycosides susceptible isolates by the disc-diffusion method presented MIC lower than 125 μg/mL and 500μg/mL for gentamicin e streptomycin, respectively. The prevalence of vancomycin resistance Enterococcus (VRE) was very low in this study. One predominant clonal group was found among E. faecalis exhibiting HLR-Ge/St. The isolates included in the clonal group were recovered from both hospitals, indicating both intrahospital and interhospital spread of this clone.

As características fenotípicas e genotípicas de 203 isolados de Enterococcus spp. proveniente de diferentes amostras clínicas em dois hospitais localizados na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil, foram estudadas. As espécies foram identificadas através de testes bioquímicos convencionais e pelo uso do sistema automatizado VITEK 2 (BioMérieux). As concentrações inibitórias mínimas (CIM) para aminoglicosídeos foram determinadas pelo método de diluição em ágar. O alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) e à ampicilina foi avaliado pelo mesmo método e adicionalmente pelo método de disco-difusão. A diversidade genética de amostras de Enterococcus faecalis com HLAR foi determinada através da digestão do DNA cromossômico com a enzima SmaI seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE). O E. faecalis foi a espécie mais prevalente (93,6%) seguido por E. faecium (4,4%). A resistência entre os isolados clínicos foi de 2,5% à ampicilina, 0,5% à vancomicina, 0,5% à teicoplanina, 33% ao cloranfenicol, 2% à nitrofurantoína, 62,1% à eritromicina, 64,5% à tetraciclina, 24,6% à rifampicina, 30% ao ciprofloxacino e 87,2% à quinupristina-dalfopristina. A prevalência de HLAR foi de 10,3%, sendo 23,6% para gentamicina e 37,4% para estreptomicina. A maioria das amostras sensíveis aos aminoglicosídeos pelo método de disco-difusão apresentaram CIM inferior a 125 μg/mL e 500μg/mL para gentamicina e estreptomicina, respectivamente. A prevalência de Enterococcus resistentes à vancomicina (ERV) foi muito baixa neste estudo. Um grupo clonal predominante foi encontrado entre amostras de E. faecalis com HLR-Ge/St. Os isolados incluídos no grupo clonal foram provenientes de ambos os hospitais, indicando uma disseminação intra e inter-hospitalar deste clone. / The phenotypic and genotypic characteristics of 203 Enterococcus spp isolates recovered from different clinical sources of two hospitals in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil, were studied. The species were identified by conventional biochemical tests and the automated system VITEK 2 (BioMérieux). The minimal inhibitory concentrations (MIC) for aminoglycosides were evaluated by agar dilution method. The evaluation of high-level resistance to aminoglycosides (HLAR) and resistance to ampicillin were carried out by the same method as well as by the disc-diffusion method. The genetic diversity of HLAR E. faecalis was assessed by pulsed-field gel electrophoresis of cromossomal DNA after SmaI digestion. The E. faecalis was the most frequent specie (93.6%), followed by E. faecium (4.4%). The percentage of resistance among the clinical isolates was: 2.5% to ampicillin, 0.5% to vancomycin, 0.5% teicoplanin, 33% to chloramphenicol, 2% to nitrofurantoin, 66.1% to erythromycin, 66.5% to tetracycline, 24.6% to rifampicin, 30% to ciprofloxacin and 87.2% to quinupristin-dalfopristin. A total of 10.3% proved to be HLAR, with 23.6% resistant to gentamicin and 37.4% to streptomycin. Most of the aminoglycosides susceptible isolates by the disc-diffusion method presented MIC lower than 125 μg/mL and 500μg/mL for gentamicin e streptomycin, respectively. The prevalence of vancomycin resistance Enterococcus (VRE) was very low in this study. One predominant clonal group was found among E. faecalis exhibiting HLR-Ge/St. The isolates included in the clonal group were recovered from both hospitals, indicating both intrahospital and interhospital spread of this clone.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T13:00:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Maria Paloma Silva de Barros_PPGG UFPE.pdf: 8103324 bytes, checksum: 8a69c263eb54cdd37eb3275985c8eb30 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T13:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Maria Paloma Silva de Barros_PPGG UFPE.pdf: 8103324 bytes, checksum: 8a69c263eb54cdd37eb3275985c8eb30 (MD5) Previous issue date: 2012-09-14 / A peste é uma doença que permanece enraizada em inúmeros focos naturais por todo o mundo. Embora o Brasil passe por um período de silenciamento epidemiológico, anticorpos antipestosos são detectados nas atividades de vigilância, sugerindo que estes focos permanecem ativos. A Yersinia pestis, agente causador da peste, apresenta uma história evolutiva recente e é considerada uma espécie, geneticamente, muito homogênea. Diante da necessidade de estudos mais aprofundados sobre as características moleculares e evolutivas dos isolados de Y. pestis dos focos do Brasil, realizamos neste trabalho uma caracterização de cepas da coleção biológica (Fiocruz-CYP) de Yersinia, provenientes de cinco focos de peste do Brasil, com a finalidade de compreender a adaptação da bactéria no ambiente. Realizamos a padronização e a análise de macrorestrição (PFGE) em 22 cepas de Y. pestis, 17 de um surto ocorrido em 1986 e cinco isoladas da atividade de vigilância. O PFGE não separou os isolados da rotina e do surto, entretanto foi capaz de revelar diversidade genética entre as cepas. As técnicas MLVA e CRISPR também foram utilizadas na genotipagem das cepas de Y. pestis. Doze locos VNTR (MLVA) analisados em 37 cepas, pertencentes a dois eventos epidemiológicos distintos, permitiram observar a separação dos grupos por evento e estabelecer uma relação epidemiológica. Três locos CRISPR (YPa, YPb e YPc) foram analisados em 146 cepas, apenas dois (YPa e YPb) se mostraram polimórficos. A análise desta região permitiu realizar uma caracterização intraespecífica e microevolutiva dos isolados de peste dos focos brasileiros. O MLVA e o CRISPR demonstraram uma melhor relação entre os dados epidemiológicos e moleculares, enquanto o PFGE apenas diferenciou os isolados de Y. pestis. Os dados gerados pelas três técnicas estudadas permitiram confirmar que houve apenas a entrada de um clone de Y. pestis no Brasil e observar que alguns processos adaptativos foram necessários para sua interiorização e fixação nos focos do país.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:43:13Z No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / CPqAM CAPES CNPq Serviço de Referência em Peste / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:45:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaPalomaBarros.pdf: 8071319 bytes, checksum: 0b3f7f14ac7d15cf16b3a5e185a6f89d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:45:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaPalomaBarros.pdf: 8071319 bytes, checksum: 0b3f7f14ac7d15cf16b3a5e185a6f89d (MD5) Previous issue date: 2012-09-14 / A peste é uma doença que permanece enraizada em inúmeros focos naturais por todo o mundo. Embora o Brasil passe por um período de silenciamento epidemiológico, anticorpos antipestosos são detectados nas atividades de vigilância, sugerindo que estes focos permanecem ativos. A Yersinia pestis, agente causador da peste, apresenta uma história evolutiva recente e é considerada uma espécie, geneticamente, muito homogênea. Diante da necessidade de estudos mais aprofundados sobre as características moleculares e evolutivas dos isolados de Y. pestis dos focos do Brasil, realizamos neste trabalho uma caracterização de cepas da coleção biológica (Fiocruz-CYP) de Yersinia, provenientes de cinco focos de peste do Brasil, com a finalidade de compreender a adaptação da bactéria no ambiente. Realizamos a padronização e a análise de macrorestrição (PFGE) em 22 cepas de Y. pestis, 17 de um surto ocorrido em 1986 e cinco isoladas da atividade de vigilância. O PFGE não separou os isolados da rotina e do surto, entretanto foi capaz de revelar diversidade genética entre as cepas. As técnicas MLVA e CRISPR também foram utilizadas na genotipagem das cepas de Y. pestis. Doze locos VNTR (MLVA) analisados em 37 cepas, pertencentes a dois eventos epidemiológicos distintos, permitiram observar a separação dos grupos por evento e estabelecer uma relação epidemiológica. Três locos CRISPR (YPa, YPb e YPc) foram analisados em 146 cepas, apenas dois (YPa e YPb) se mostraram polimórficos. A análise desta região permitiu realizar uma caracterização intraespecífica e microevolutiva dos isolados de peste dos focos brasileiros. O MLVA e o CRISPR demonstraram uma melhor relação entre os dados epidemiológicos e moleculares, enquanto o PFGE apenas diferenciou os isolados de Y. pestis. Os dados gerados pelas três técnicas estudadas permitiram confirmar que houve apenas a entrada de um clone de Y. pestis no Brasil e observar que alguns processos adaptativos foram necessários para sua interiorização e fixação nos focos do país. / Plague disease remains present in numerous natural foci worldwide. Although Brazil goes through a period of epidemiological silence antiplague antibodies are detected in the surveillance activities, suggesting that Brazilians foci remain active. Yersinia pestis, causative agent of plague, has a recent evolutionary history and is considered a very genetically homogeneous species. Given the need for further studies on the molecular and evolutionary characteristics of the isolates of Y. pestis of the Brazilian plague areas, we perform in this work a characterization of strains biological collection (Fiocruz-CYP) of Yersinia, from five outbreaks of plague in Brazil, with the aim of understanding the adaptation of bacteria to the environment. We carried out the standardization and macrorestriction analysis (PFGE) in 22 Y. pestis strains, 17 from an outbreak occurred in 1986 and five from surveillance activity. PFGE did not separate the isolates from surveillance and from outbreak, but it was able to reveal genetic diversity among strains. MLVA and CRISPR techniques were also used in genotyping Y. pestis strains. Analysis of 12 VNTR loci (MLVA) in 37 Y. pestisstrains, of two different epidemiological events, allowed observing the separation of groups establish an epidemiological link among the isolates. Three CRISPR loci (YPa, YPb and YPc) were analyzed in 146 Y. pestis strains, only two loci (YPa and YPb) were polymorphic. The analysis of this region allowed an intraspecific characterization and microevolutionary of the plague isolates in the Brazilian foci. The CRISPR and MLVA showed a better relationship between the epidemiological and molecular data, while PFGE differ only the Y. pestis strains. The data generated by the three techniques studied confirmed that there was only one entry clone Y. pestis in Brazil and observed that some adaptive processes were necessary for its internalization and fixation of these foci in our country.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T18:11:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:11:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste. / Plague, a zoonosis caused by the bacterium Yersinia pestis, remains as a global threat. As other poverty related diseases, plague is considered a neglected disease in tropical countries, including Brazil, where serological activity is still detected in sentinel animals in the natural foci. The lack of safe/effective vaccine and the rise of multiresistant strains and the possibility of its use as a biological weapon increased the interest in genetic/epidemiological studies of this pathogen. This work aimed (1) to compare two molecular typing methods to identify which offers better temporal and geographical correlation among Brazilian Y. pestis isolates; and (2) to further understand the pathogenicity mechanisms of the bacteria. 25 Brazilian strains of Y. pestis were typed by analysis of multiple loci with variable number of tandem repeats (MLVA) and by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Association between these techniques demonstrated for the first time genetic diversity among Brazilian Y. pestis strains. However, only MLVA allowed establishing a correlation between isolates from different epidemiological events, proving to be more efficient for Y. pestis typing than PFGE. Four avirulent strains P.CE 882/1R and 32R, P.Exu 369 and 390, and a highly virulent Indian control strain (195P) were compared at phenotypic, genotypic, transcriptional and proteomic level in order to identify possible causes of virulence loss. No phenotypic and genotypic difference was found among the five isolates, which detected the genes irp2, psn, ybtE (from the High Pathogenicity Island - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (chromosomal) and pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidial). However, the transcriptional analysis indicated different transcription levels of the HPI genes, although no structural change on sequence being detected. Probably the presence of free iron in the culture medium activated the protein Fur, a negative HPI transcriptional regulator. Quantitative analysis revealed higher than expected transcription levels of P.Exu 369 and 390 HPI genes, suggesting possible alteration in the iron uptake regulation mechanism. The proteomic analysis of the subcultive P.CE 882/1R suggests that metabolic disturbances resulting from the subculture and/or storage may be associated with avirulence phenotype. Those findings about mechanisms of virulence of Y. pestis may contribute to identify important targets for development of new vaccines and therapies against plague.