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Us3, a serine/threonine kinase encoded by all alphaherpesviruses, plays diverse roles during virus infection. Recently, work done in our laboratory determined that Us3 orthologues from herpes simplex type 2 (HSV-2) and pseudorabies virus (PRV) are capable of disrupting promyelocytic leukaemia (PML) protein nuclear bodies (-NBs). PML-NBs are discrete, dynamic nuclear bodies named for PML, their essential structural component and one that plays a key role in diverse cellular processes, including transcriptional regulation, apoptosis, and cellular antiviral defense. In infected cells, PML-NBs exert transcriptional silencing on the viral genome to prevent viral gene expression and virus replication. Based on this finding, my studies were aimed to understand the mechanism and physiological function of Us3-mediated PML-NB disruption. The degradation of one or more cellular proteins seems necessary for this Us3 activity, as the proteasome inhibitor, MG132, dramatically reduced Us3-mediated PML-NB disruption. The target of this proteasome activity is not likely PML protein, as Us3 expression did not lead to detectable PML protein degradation. Nonetheless, the involvement of proteasome activity suggests that Us3 may utilize the host ubiquitylation pathway to disrupt PML-NBs. Supporting this hypothesis, PRV and HSV-2 Us3 orthologues were shown to interact with KLHL21, a substrate adaptor protein for cullin-3 ubiquitin ligase. PRV and HSV-2 Us3 were re-localized to PML-NBs when co-expressed with KLHL21, and knock-down of KLHL21 prevented Us3-mediated PML-NB disruption. Taken together, these findings suggest that Us3-KLHL21 complex recruits the cullin-3 ubiquitin ligase to PML-NBs, where subsequent ubiquitylation of unknown target(s) leads to PML-NB disassembly. Since it is well established that PML is an important antiviral effector induced by interferon (IFN), Us3 may contribute to viral resistance to IFN by disrupting PML-NBs. Favoring this hypothesis, virus yield and viral gene transcription were dramatically reduced in IFN-exposed cells in the absence of Us3. These reductions were associated with an increased number of PML-NBs in the absence of Us3, and were partially recovered in cells knocked down for PML. Therefore, by disrupting PML-NBs, Us3 may alleviate IFN-induced, host-mediated transcriptional silencing of the viral genome, allowing efficient viral gene transcription and replication in cells exposed to IFN. / Thesis (Ph.D, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2014-04-28 16:36:54.079

L'acoustique a un intérêt certain pour des applications de sécurité et de défense puisqu'elle permet une surveillance passive, omnidirectionnelle et sans ligne de vue directe. Dans le contexte militaire, des antennes de microphones sont par exemple utilisées pour détecter, localiser et classifier des explosions, des tirs d'artillerie ou des tirs d'armes de poing. Les signatures temporelles enregistrées à quelques centaines de mètres de la source peuvent cependant présenter une grande sensibilité aux conditions environnementales, et notamment, en milieu ouvert, au sol et à la micrométéorologie. Des effets de propagation importants liés à la stratification moyenne de l'atmosphère, la turbulence, la topographie ou l'impédance du sol sont en effet attendus. L'influence combinée de ces effets reste peu documentée, et peut se traduire par une dégradation des performances des systèmes militaires. La simulation numérique est une alternative intéressante et complémentaire à l'approche expérimentale pour mieux comprendre ces interactions, puisqu'elle permet le contrôle des paramètres d'entrée. L'acoustique du champ de bataille fait cependant intervenir des sons à caractère impulsionnel et de grande amplitude, qui se propagent sur de relativement longues distances et présentent de petites échelles spatiales ; la prise en compte des effets de turbulence ou de topologie imposent de plus une modélisation volumique tridimensionnelle. Ces aspects sont très contraignants en terme de coûts de calcul, même avec les capacités de calcul modernes. Un premier objectif de cette thèse consiste à développer une nouvelle version du modèle de différences finies dans le domaine temporel (FDTD) initialement disponible pour permettre de répondre à ces spécifications. Les simulations temporelles en trois dimensions étant relativement peu répandues, un certain nombre d'avancées scientifiques ont été requises par rapport aux travaux antérieurs, concernant la prise en compte des sources, la modélisation des sols ou l'efficacité des conditions denon-réflexion (PML).La confrontation avec l'expérience s'avère toutefois indispensable pour s'assurer de la qualité des prédictions numériques en conditions réalistes. Des mesures acoustiques originales ont ainsi été réalisées en Allemagne pendant plusieurs jours et pour différentes conditions atmosphériques afin de documenter la variabilité des sons impulsionnels, pour des distances de propagation de plusieurs centaines de mètres. Un excellent accord est obtenu avec des simulations numériques déterministes pour toutes les configurations considérées. Ces résultats ouvrent la voie vers l'étude des pertes de cohérences spatiales et temporelles et leur influence sur les performances des antennes microphoniques. / Acoustics is of interest for applications pertaining to defence and security since it can provide a passive, omnidirectional and non-line-of-sight survey. In a military context, microphone arrays are for instance used to detect, localize and classify explosions, artillery fire or gunshots. However, time signatures recorded a few hundred meters from the source may be very sensitive to the environmental conditions since significant propagation effects related to the mean stratification of the atmosphere, turbulence, topography or ground impedance are expected. The combined impact of these effects is as yet little documented, and this lack of knowledge can degrade the performance of military systems.Numerical simulations are an interesting and complementary alternative to experiments to better understand these interactions since the input parameters can be controlled. Battlefield acoustics, however, typically involves very loud, impulse sounds, which propagate with short wavelengths over relatively long distances. Combined with the three-dimensional volume modeling required for turbulence or topology effects, such numerical predictions are very challenging in terms of computational cost even with currently available computing capabilities. One of the purposes of this work is to develop a new version of the in-house finite-difference time-domain solver (FDTD) in order to match these specifications. Time-domain 3D simulations being relatively new, a number of scientific advances were achieved regarding ground and source modeling in the time domain or the effectiveness of non-reflecting boundary conditions (PML).Still, comparison with measurements is necessary to ensure the accuracy of numerical predictions in realistic conditions. Acoustic measurements were thus carried out in Germany for several days in various meteorological conditions. The formed database provides original insights into the propagation effects on impulse sounds over up to several hundreds of meters. An excellent agreement is obtained with deterministic simulations for all considered configurations. These results pave the way for further assessment of spatial and temporal coherence losses, and their influence on the performance of microphone arrays.

La SUMOylation est une modification post-traductionnelle qui gouverne divers processus cellulaires incluant immunité innée et défense antivirale. Des effecteurs de la synthèse d’IFN, de son signal de transduction ainsi que des facteurs de restriction sont modifiés par SUMO (Small Ubiquitin Modifier). Par ailleurs, certains virus exploitent la machinerie SUMO afin de contrecarrer les mécanismes de défense antivirale suggérant l’implication de SUMO dans l’interface virus et défense antivirale. A l’aide d’un modèle cellulaire exprimant les différents paralogues SUMO1, SUMO2 ou SUMO3 ou en diminuant l’expression de l’unique enzyme de conjugaison à SUMO, Ubc9, nous avons montré un effet différentiel de SUMO sur deux virus de la famille des Rhabdoviridae (virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus de la rage) et sur la réponse aux IFN alpha et IFN gamma. Le premier axe de recherche a permis de montrer que l’expression de SUMO inhibe la synthèse de l’IFN suite à l’infection par le VSV et le virus de la rage, rendant les cellules plus sensibles à l’infection par le virus de la rage. IRF3 est conjuguée à SUMO, ce qui corrèle avec l’inhibition de sa phosphorylation et l’inhibition de la synthèse d’IFN beta. En revanche, bien que la synthèse de l'IFN soit diminuée, l’expression de SUMO confère la résistance au VSV et inhibe sa transcription primaire. L’activité anti-VSV de SUMO est abolie par la déplétion de MxA. L’effet de SUMO est médié par sa capacité à augmenter l’oligomérisation et la stabilité de MxA. Par ailleurs, ce travail a permis d’identifier MxA comme nouvelle cible de la machinerie SUMO. MxA interagit avec SUMO de manière covalente sur la lysine K48 et de manière non covalente avec SUMO1. Le second axe de recherche a permis d’identifier SUMO comme un nouveau régulateur de la réponse aux IFN. La SUMOylation de STAT1 inhibe sa phosphorylation, régulant négativement le signal de transduction et par conséquent la transcription et la réponse biologique en réponse à l’IFN gamma. En revanche, l’expression de SUMO n’altère ni le signal de transduction ni la transcription en réponse à l’IFN alpha.Par ailleurs, dans les cellules exprimant SUMO3, l’IFN gamma et l’IFN alpha induisent la SUMOylation de PML par SUMO3 ce qui entraîne sa dégradation via le protéasome et inhibe les réponses biologiques médiées par PML. Ce travail a permis de montrer un rôle central de SUMO dans l’immunité intrinsèque et innée, médié par la SUMOylation de protéines cellulaires telles qu’IRF3, MxA, STAT1 ou PML. / SUMOylation modulates several cellular process including innate immunity and antiviral defense. Many key regulators involved in IFN induction, IFN signaling as well as various restriction factors are SUMOylated. Using cells stably expressing the different paralogs of SUMO; SUMO1, SUMO2 or SUMO3 and cells depleted of the only known SUMO conjugating enzyme, Ubc9, we show a differential effect on two viruses from Rhabdoviridae family (Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and rabies virus) and on the response to IFN alpha and IFN gamma. First, we report that SUMO expression inhibits VSV- and rabies virus-induced IFN synthesis. Consequently, SUMO expression renders cells more sensitive to rabies virus infection. Overexpression of SUMO leads to IRF3 SUMOylation correlating rabies viral infection with both the inhibition of IRF3 activation and IFN beta synthesis. However, although SUMO inhibits VSV-induced IFN, SUMO confers resistance to VSV by inhibiting VSV primary transcription. Furthermore, the anti-VSV effect of SUMO is abolished in MxA depleted cells. Mechanistically, SUMO enhances MxA oligomerization resulting in the stabilization of the MxA protein. We also identified MxA as a new target of SUMO machinery. MxA interacts covalently with SUMO2/3 on lysine K48 and non-covalently with SUMO1. We then investigated the various roles of SUMO at different steps of the JAK/STAT pathway, including STAT activation, transcriptional response and IFN-induced biological effects, identifying SUMO as a new regulator of IFN response. The overexpression of SUMO leads to STAT1 SUMOylation and to a decrease in IFN-induced STAT1 phosphorylation resulting in an inhibition of IFN-gamma-induced transcription and biological responses. In contrast, SUMO expression does not alter IFN alpha signaling and transcriptional response. In addition, in SUMO3 expressing, IFN gamma;and IFN alpha induce SUMOylation of PML by SUMO3 inducing its degradation via the proteasome and inhibition of biological responses mediated by PML. Taken together our results show that SUMO plays a crucial role in innate and intrinsic immunity mediated by SUMOylated proteins such as IRF3, MxA, STAT1 or PML.

La sénescence cellulaire est une réponse aux stresses selon laquelle des cellules pouvant proliférer optent pour entrer dans un arrêt du cycle cellulaire en réponse à une variété de stimulations intrinsèques et extrinsèques telle que, par exemple, le raccourcissement des télomères, un stress oxydatif, des dommages à l’ADN ou l’activation constitutive d’oncogènes. Toutes ces stimulations ont en commun le potentiel d’initier ou de promouvoir une transformation néoplasique qui peut dégénérer en cancer. En fait, la sénescence est maintenant acceptée comme un mécanisme cellulaire autonome pour empêcher le développement du cancer et elle est reconnue, particulièrement dans les cellules humaines, pour s’établir et se maintenir à l’aide d’au moins deux voies de suppression tumorale majeures : les voies de p53/p21CIP et de p16INK4A/pRB. Ces deux voies sont capables d’activer et d’augmenter l’expression d’un autre suppresseur tumoral : la protéine PML. En tant que suppresseur de tumeur, PML est suffisant pour induire la sénescence dans des cellules normales, mais il n’arrive généralement pas à activer une réponse complète de sénescence dans les cellules cancéreuses. Considérant ces faits, le premier objectif de cette thèse était d’étudier le mécanisme de résistance des cellules cancéreuses contre la sénescence induite par PML. Nous avons trouvé que, dans des cellules normales, la surexpression de CDK4 ou de CDK6 (CDK4/6) est suffisante pour contourner la sénescence induite par PML. De même dans les cellules cancéreuses, l’expression de ces kinases, souvent retrouvées augmentées dans de nombreux cancers, prévient probablement l’induction d’une sénescence par PML. Effectivement, grâce à l’inhibition de l’expression et/ou de la fonction kinase des CDK4/6, nous avons réussi à restaurer un programme de sénescence dans des cellules cancéreuses. En fait, l’utilisation de palbociclib, un inhibiteur spécifique de CDK4/6 maintenant en essais cliniques, permet d’augmenter l’habileté de PML à induire un arrêt de croissance plus fort et plus durable dans des cellules en cultures ainsi qu’une meilleure réduction de la progression de tumeurs dans des souris. Cette sénescence plus complète corrèle avec une augmentation de la présence de marqueurs d’autophagie, une meilleure répression des gènes cibles des E2F et une signature d’expression de gènes correspondant à l’inhibition de la méthylation de l’ADN. Ce dernier point découle du fait que l’inhibition de CDK4/6 par le palbociclib promeut une dégradation par autophagie de la DNA méthyltransférase DNMT1. Nous avons aussi démontré que CDK4 est capable d’interagir avec DNMT1 et de le phosphoryler in vitro. Ces résultats soulignent la valeur potentielle des inhibiteurs de CDK4/6 en tant que modulateurs épigénétiques pour faciliter l’activation de la sénescence dans des cellules cancéreuses. La sénescence induite par PML est fortement liée aux modifications post-traductionnelles. Parmi ces dernières, la SUMOylation joue un rôle important dans la fonction d’échafaudeur de PML et dans la formation des corps de PML. Les corps de PML sont des structures nucléaires dynamiques stimulées par des stresses, comme l’activation d’oncogènes menant à la sénescence, et dont la formation permet la séquestration de protéines spécifiques pour leur régulation et/ou pour leur modification post-traductionnelle. À travers le recrutement de protéines, les corps de PML régulent de nombreuses fonctions cellulaires telles que la sénescence, l’apoptose, la réponse antivirale, la réponse aux dommages à l’ADN et la régulation de l’expression de gènes. Compte tenu de cela, le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser le rôle de la SUMOylation dans la sénescence induite par un oncogène, soit par l’expression de l’oncogène RAS. À l’aide d’une analyse du protéome de SUMO3 dans les cellules sénescentes versus des cellules en croissances, nous avons pu identifier 25 sites de SUMOylation dans 23 protéines dont l’incidence était significativement régulée par la sénescence. Il est à noter que la plupart de ces protéines (un tiers) sont connues pour être associées au corps de PML. Curieusement, UBC9 (la seule enzyme E2 pour la SUMOylation) a été retrouvée plus SUMOylée dans la sénescence sur sa Lys-49. Des études fonctionnelles d’un mutant d’UBC9 pour la Lys-49 ont démontré une diminution de son association aux corps de PML et la perte de la capacité d’UBC9 surexprimé à retarder la sénescence. De plus, la localisation forcée d’UBC9 dans les corps de PML gêne la sénescence induite par PML ou RAS. Ces résultats nous permettent de proposer des fonctions pro- et anti-sénescence de la SUMOylation des protéines, particulièrement pour UBC9. Mots-clés : Sénescence, PML, CDK4 et CDK6 (CDK4/6), méthylation de l’ADN, palbociclib, corps de PML, SUMOylation, UBC9 / Cellular senescence is a stress response wherein proliferating competent cells undergo a stable cell cycle arrest in response to a variety of intrinsic and extrinsic stimuli, including telomere shortening, oxidative stress, DNA damage or the constitutive activation of oncogenes among others. All these stimuli have in common the potential to initiate or promote neoplastic transformation that can degenerate in cancer. Senescence, particularly in human cells, is established and maintained by at least two major tumor suppressor pathways: the p53/p21CIP and p16INK4A/pRB pathways and is now accepted as a potent cell-autonomous mechanism for suppressing the development of cancer. Both pathways are able to activate and increase the expression of the tumor suppressor protein PML. As a tumor suppressor, PML is sufficient to induce senescence in normal cells; however, upon the same stimuli, cancer cells fail to engage a complete senescence response. Given this, the first aim of this thesis is to investigate the resistance mechanisms of cancer cells to PML-induced senescence. We found that overexpression of the CDK4 and CDK6 (which are often up-regulated in cancer) are sufficient to bypass PML-induced senescence in normal cells. In cancer cells the expression of these kinases impairs the PML-induced senescence. By inhibiting the expression and/or function of CDK4/6 we were able to restore the senescence program in cancer cells. Also, the specific CDK4/6 inhibitor palbociclib (currently used in clinical trials) increased the ability of PML to regulate a stronger and more permanent growth inhibition in cell culture and decreased tumor progression in mice. This complete senescence response correlated with an increase in autophagy markers, repression of E2F target genes and a gene expression signature of blocked DNA methylation. Furthermore, CDK4/6 inhibition by palbociclib promotes autophagy-dependant degradation of the DNA methyltransferase DNMT1. More important, we were able to demonstrate that CDK4 directly interacts and phosphorylates DNMT1 in vitro. These results highlight the potential value of CDK4/6 inhibitors as epigenetic modulators to facilitate activation of cellular senescence in cancer cells. PML-induced senescence is tightly regulated by post-translational modifications (PTMs). Among these PTMs, SUMOylation plays an important role in the scaffold function of PML and the formation of the PML-NBs (PML-Nuclear Bodies). PML-NBs are dynamic structures triggered by stress such as oncogene-induced senescence, and its formation allows the sequestration of target proteins for their regulation and/or its post-translational modification. By protein recruitment, PML-NBs regulate several cellular functions such as senescence, apoptosis, antiviral response, DNA repair and gene regulation. Given this; the second aim of this thesis is to characterize the role of SUMOylation in oncogene mediated cellular senescence, specifically by the expression of the oncogene RAS. By a SUMO3 proteome analysis of senescent cells we were able to identify 25 SUMO sites in 23 proteins that were significantly regulated during senescence. Importantly, most of these proteins were PML-NB associated. Interestingly, UBC9 (the only SUMO E2 enzyme), was found more SUMOylated in senescence on its Lys-49. Functional studies of a UBC9 mutant in Lys-49 showed a decreased association to PML-NBs and the loss of UBC9’s ability to delay senescence. Moreover, forced localization of UBC9 into PML-NBs counteracted RAS and PML-induced senescence. These results allowed us to propose a pro- and an anti-senescence function of protein SUMOylation, specifically for UBC9. Keywords: Senescence, PML, CDK4/6, DNA methylation, palbociclib, PML-NBs, SUMOylation, UBC9

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Early region 1A (E1A) protein is the first protein expressed following viral infection. E1A proteins initiate the cell cycle in infected cell by altering cellular gene expression and also activate expression of other viral genes enabling viral replication. The C-terminus of E1A is the least-characterized region of the protein, with few known binding partners, however DREF has been identified as a novel binding partner. My studies have determined that DREF directly binds to E1A and has a role in the virus life cycle. DREF is a restriction factor for virus growth and is a component of viral replication centres. DREF is SUMOylated and SUMOylation appears to affect localization to viral replication centres. DREF co-localizes with PML bodies and subcellular distribution of DREF is altered by the presence of E1A. This work provides a platform to study the role of DREF in uninfected cells, and in HAdV biology and its possible role in antiviral response. / October 2015

Death domain-associated protein 6 (DAXX) is a multifunctional protein involved in diverse cellular processes. It acts as a histone chaperone or regulator of transcription and apoptosis, in which is its role quite controversial. DAXX also participates in regulation of cell DNA damage response (DDR). DAXX co-creates and stabilizes complex with Mdm2, which negatively regulates the stability of p53, an important tumor suppressor, which is a part of signalling node in the DDR. If DNA damage is not lethal for the cell and unables it to proliferate, the irreversible state of cell cycle called cellular senescence takes place. Under physiological conditions, induction of senescence can prevent the development of tumorigenesis. Therefore, the description of mechanisms involved in the induction of senescence has potential clinical significance. In my thesis, I aimed to determine changes in the level of DAXX protein in senescent cells and to characterize the manner of its regulation. In tumor cells MCF-7 and primary BJ fibroblasts, I observed decrease in DAXX protein level and its regulation. I tested the hypothesis according to which an increase in DAXX level before DNA damage canprevent induction of cellular senescence, or increase in its expression during senescence can cause recovery of cell proliferation....

Dans cette thèse, nous nous intéressons à la discrétisation par des schémas aux différences finies de problèmes faiblement bien posés. Nous donnons de nouvelles définitions qui prennent en compte la perte de régularité apparaissant dans les problèmes faiblement bien posés et nous étendons la condition nécessaire et suffisante de convergence de Lax-Richtmyer. En utilisant la théorie des perturbations et le développement en série de Puiseux, nous calculons le taux de convergence des schémas faisant partie d'une certaine classe. Nous illustrons numériquement nos résultats. Dans un deuxième temps, nous nous intéressons à un cas particulier de problèmes faiblement bien posés: les couches parfaitement adaptées de Bérenger ou PML. Nous donnons des estimations d'énergie pour les équations de Maxwell que nous étendons au schéma de Yee. Enfin, nous étudions le comportement asymptotique en temps de la solution d'une équation PML en utilisant l'approximation de l'optique géométrique.

The presence of wave motion is the defining feature in many fields of application,such as electro-magnetics, seismics, acoustics, aerodynamics,oceanography and optics. In these fields, accurate numerical simulation of wave phenomena is important for the enhanced understanding of basic phenomenon, but also in design and development of various engineering applications. In general, numerical simulations must be confined to truncated domains, much smaller than the physical space were the wave phenomena takes place. To truncate the physical space, artificial boundaries, and corresponding boundary conditions, are introduced. There are four main classes of methods that can be used to truncate problems on unbounded or large domains: boundary integral methods, infinite element methods, non-reflecting boundary condition methods and absorbing layer methods. In this thesis, we consider different aspects of non-reflecting boundary conditions and absorbing layers. In paper I, we construct discretely non-reflecting boundary conditions for a high order centered finite difference scheme. This is done by separating the numerical solution into spurious and physical waves, using the discrete dispersion relation. In paper II-IV, we focus on the perfectly matched layer method, which is a particular absorbing layer method. An open issue is whether stable perfectly matched layers can be constructed for a general hyperbolic system. In paper II, we present a stable perfectly matched layer formulation for 2 x 2 symmetric hyperbolic systems in (2 + 1) dimensions. We also show how to choose the layer parameters as functions of the coefficient matrices to guarantee stability. In paper III, we construct a new perfectly matched layer for the simulation of elastic waves in an anisotropic media. We present theoretical and numerical results, showing that the stability properties of the present layer are better than previously suggested layers. In paper IV, we develop general tools for constructing PMLs for first order hyperbolic systems. We present a model with many parameters which is applicable to all hyperbolic systems, and which we prove is well-posed and perfectly matched. We also use an automatic method, derived in paper V, for analyzing the stability of the model and establishing energy inequalities. We illustrate our techniques with applications to Maxwell s equations, the linearized Euler equations, as well as arbitrary 2 x 2 systems in (2 + 1) dimensions. In paper V, we use the method of Sturm sequences for bounding the real parts of roots of polynomials, to construct an automatic method for checking Petrowsky well-posedness of a general Cauchy problem. We prove that this method can be adapted to automatically symmetrize any well-posed problem, producing an energy estimate involving only local quantities. / QC 20100830