A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma. / Fish oil (FO) is rich in n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA), which have been suggested to be anti-inflammatory and are associated with improvement of several inflammatory diseases. In this study, we investigated the influence of FO on allergen-induced lung inflammation and airway hyperreactivity in mice. Male A/J mice were fed either a standard-chow (SC) or a FO diet (FO) for 8 weeks. After 4 weeks, each group was further randomized for ovalbumin (SC-OVA and FO-OVA) or saline (SC-SAL and FO-SAL) challenge. Resistance and elastance were measured at baseline and after aerosolized methacholine, 24h after the last challenge. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed for leukocyte counts and eotaxin-2 quantification. Lung tissue mucus deposition, peribronchiolar matrix deposition and eosinophil infiltration were quantified. Interleukin-13 expression was evaluated by immunohistochemistry and nuclear factor kappa B (NFκB), GATA-3 and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) expression was measured by Western blot. OVA challenge resulted in increased eosinophil infiltration, increased inflammatory cytokine production, peribronchiolar matrix and mucus deposition and airway hyperreactivity to aerosolized methacholine. Elevated lung NFκB and GATA-3 expression was noted in OVA-challenged mice, which was attenuated in FO diet-fed mice. Higher PPARγ expression was also detected in the lungs from the FO-fed groups. In conclusion, FO intake attenuated classical asthma features by reducing inflammatory mediator production via GATA-3 and NFκB down-regulation and PPARγ up-regulation. Thus, FO might be an alternative therapy for asthma prevention and control.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma. / Fish oil (FO) is rich in n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA), which have been suggested to be anti-inflammatory and are associated with improvement of several inflammatory diseases. In this study, we investigated the influence of FO on allergen-induced lung inflammation and airway hyperreactivity in mice. Male A/J mice were fed either a standard-chow (SC) or a FO diet (FO) for 8 weeks. After 4 weeks, each group was further randomized for ovalbumin (SC-OVA and FO-OVA) or saline (SC-SAL and FO-SAL) challenge. Resistance and elastance were measured at baseline and after aerosolized methacholine, 24h after the last challenge. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed for leukocyte counts and eotaxin-2 quantification. Lung tissue mucus deposition, peribronchiolar matrix deposition and eosinophil infiltration were quantified. Interleukin-13 expression was evaluated by immunohistochemistry and nuclear factor kappa B (NFκB), GATA-3 and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) expression was measured by Western blot. OVA challenge resulted in increased eosinophil infiltration, increased inflammatory cytokine production, peribronchiolar matrix and mucus deposition and airway hyperreactivity to aerosolized methacholine. Elevated lung NFκB and GATA-3 expression was noted in OVA-challenged mice, which was attenuated in FO diet-fed mice. Higher PPARγ expression was also detected in the lungs from the FO-fed groups. In conclusion, FO intake attenuated classical asthma features by reducing inflammatory mediator production via GATA-3 and NFκB down-regulation and PPARγ up-regulation. Thus, FO might be an alternative therapy for asthma prevention and control.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente estudo foi avaliar se o Bezafibrato, um agonista PAN-PPAR, é capaz de aliviar a doença não alcoólica do fígado gorduroso (NAFLD) na prole de machos de mães C57BL/6 obesas. Fêmeas virgens foram alimentadas com uma dieta HL (hiperlipídica, 49% de lipídios) ou uma dieta C (controle, 10% de lipídios) por oito semanas antes do acasalamento e durante os períodos de gestação e lactação. A prole de machos foi subdividida em quatro grupos: C (dieta controle para as mães e filhotes); C/BZ (dieta controle para as mães e filhotes com tratamento com Bezafibrato[100mg/Kg]); HL (dieta HL para as mães e dieta controle para os filhotes); e HL/BZ (dieta HL para as mães e dieta controle para os filhotes com tratamento com Bezafibrato [100mg/Kg]). O tratamento com Bezafibrato começou na 12 semana e se manteve por três semanas. Análise do metabolismo, bioquímica, estereológica e por western-blotting foram realizadas. A dieta HL causou um fenótipo de sobrepeso nas mães e acarretou em uma intolerância oral à glicose com aumento da glicemia de jejum. A prole HL apresentou hiperfagia, ganho de massa corporal, altos níveis de triglicerídeo hepático e plasmático, esteatose hepática e aumento da expressão de proteínas lipogênicas concomitante com diminuição do receptor ativador de proliferação peroxissomal alfa (PPARα), que é responsável pela β-oxidação e aumento do receptor ativador de proliferação peroxissomal gama (PPARγ) e do elemento regulador de esterol ligante da proteína 1 (SREBP-1c) proteínas envolvidas na lipogênese hepática. Por outro lado, o tratamento com o Bezafibrato reverteu o quadro da programação metabólica no fígado, com uma melhora dos parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares do fígado dos animais, com um aumento da ativação de PPARα em associação a uma diminuição do PPARγ e não alterando a expressão de SREBP-1c. Em conclusão, nós demonstramos que o tratamento com Bezafibrato melhora a NAFLD causada pela obesidade materna. / The aim of the present study was to evaluate whether Bezafibrate , a PAN-PPAR agonist, could attenuate non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) of male offspring from obese C57BL/6 dams. Dams were fed on a HF (high-fat, 49% lipids) diet or SC (standard chow; 10% lipids) diet for 8 weeks before mating and during gestation and lactation periods. Male offspring were subdivided into 4 groups: SC (standard-chow for dams and offspring); SC/BZ [standard-chow for dams and offspring with treatment with BZ (100mg/Kg)]; HF (high-fat diet for dams and standard-chow for offspring); HF/BZ [high-fat diet for dams and standard-show for offspring with treatment with Bezafibrate (100mg/Kg)]. Treatment with Bezafibrate started at 12th week and was maintained for 3 weeks. Metabolic measurements, biochemical analysis, stereological tools and western-blotting were performed. The HF diet yielded an overweight phenotype and an increase in oral glucose tolerance and fasting glucose of dams. The HF offspring presented hyperphagia, body mass gain, high levels of plasmatic and hepatic triglycerides, impairment of glucose metabolism, hepatic steatosis and high expression of lipogenic proteins concomitant to decreased expression of PPARα, which is responsible for β-oxidation. On the other hand, treatment with Bezafibrate reverted hepatic outcomes of metabolic programming, with an improvement of morphological, biochemical and molecular parameters of animals livers, with an increase of PPARα activation in association with a decrease of PPARγ expression and no changes in SREBP-1c expression. In conclusion, we demonstrated that treatment with Bezafibrate improved NAFLD caused by maternal obesity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente estudo foi avaliar se o Bezafibrato, um agonista PAN-PPAR, é capaz de aliviar a doença não alcoólica do fígado gorduroso (NAFLD) na prole de machos de mães C57BL/6 obesas. Fêmeas virgens foram alimentadas com uma dieta HL (hiperlipídica, 49% de lipídios) ou uma dieta C (controle, 10% de lipídios) por oito semanas antes do acasalamento e durante os períodos de gestação e lactação. A prole de machos foi subdividida em quatro grupos: C (dieta controle para as mães e filhotes); C/BZ (dieta controle para as mães e filhotes com tratamento com Bezafibrato[100mg/Kg]); HL (dieta HL para as mães e dieta controle para os filhotes); e HL/BZ (dieta HL para as mães e dieta controle para os filhotes com tratamento com Bezafibrato [100mg/Kg]). O tratamento com Bezafibrato começou na 12 semana e se manteve por três semanas. Análise do metabolismo, bioquímica, estereológica e por western-blotting foram realizadas. A dieta HL causou um fenótipo de sobrepeso nas mães e acarretou em uma intolerância oral à glicose com aumento da glicemia de jejum. A prole HL apresentou hiperfagia, ganho de massa corporal, altos níveis de triglicerídeo hepático e plasmático, esteatose hepática e aumento da expressão de proteínas lipogênicas concomitante com diminuição do receptor ativador de proliferação peroxissomal alfa (PPARα), que é responsável pela β-oxidação e aumento do receptor ativador de proliferação peroxissomal gama (PPARγ) e do elemento regulador de esterol ligante da proteína 1 (SREBP-1c) proteínas envolvidas na lipogênese hepática. Por outro lado, o tratamento com o Bezafibrato reverteu o quadro da programação metabólica no fígado, com uma melhora dos parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares do fígado dos animais, com um aumento da ativação de PPARα em associação a uma diminuição do PPARγ e não alterando a expressão de SREBP-1c. Em conclusão, nós demonstramos que o tratamento com Bezafibrato melhora a NAFLD causada pela obesidade materna. / The aim of the present study was to evaluate whether Bezafibrate , a PAN-PPAR agonist, could attenuate non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) of male offspring from obese C57BL/6 dams. Dams were fed on a HF (high-fat, 49% lipids) diet or SC (standard chow; 10% lipids) diet for 8 weeks before mating and during gestation and lactation periods. Male offspring were subdivided into 4 groups: SC (standard-chow for dams and offspring); SC/BZ [standard-chow for dams and offspring with treatment with BZ (100mg/Kg)]; HF (high-fat diet for dams and standard-chow for offspring); HF/BZ [high-fat diet for dams and standard-show for offspring with treatment with Bezafibrate (100mg/Kg)]. Treatment with Bezafibrate started at 12th week and was maintained for 3 weeks. Metabolic measurements, biochemical analysis, stereological tools and western-blotting were performed. The HF diet yielded an overweight phenotype and an increase in oral glucose tolerance and fasting glucose of dams. The HF offspring presented hyperphagia, body mass gain, high levels of plasmatic and hepatic triglycerides, impairment of glucose metabolism, hepatic steatosis and high expression of lipogenic proteins concomitant to decreased expression of PPARα, which is responsible for β-oxidation. On the other hand, treatment with Bezafibrate reverted hepatic outcomes of metabolic programming, with an improvement of morphological, biochemical and molecular parameters of animals livers, with an increase of PPARα activation in association with a decrease of PPARγ expression and no changes in SREBP-1c expression. In conclusion, we demonstrated that treatment with Bezafibrate improved NAFLD caused by maternal obesity.