京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24500号 / 医博第4942号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 萩原 正敏, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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An individual’s naïve level of response (LR) to ethanol is predictive of their lifetime likelihood to abuse alcohol. LR is heavily genetically influenced, suggesting that the genes responsible for LR may also be central to the development of abuse disorders. Our laboratory uses the model organism C. elegans to investigate the genetic influences on responses to acute ethanol exposure. We recently found that changes in TAG levels can alter LR. From this result we investigated the role of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) as well enzymes involved in lipid modifications of proteins. We found that LC-PUFAs are necessary for acute functional tolerance and that supplementation of eicosapentaenoic acid is able to rescue AFT. We also identified mutations in several palmitoyltransferases, a thioesterase, and elongases that alter AFT. These novel results highlight the importance of fatty acids in the response to ethanol and suggest exciting new potential therapeutic targets.

4 Abstract Phosphodiesterases (PDEs), enzymes that hydrolyze cyclic nucleotides, are important components of signal transduction pathways in eukaryotic cells. Second messenger 3'-5'- cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is hydrolyzed by specific PDEs. By controlling concentration levels of cAMP in cell, PDEs preserve favorable environment for successful transmission of the cAMP signal. Moreover, PDEs are activated by protein kinase A (PKA) in response to elevated cAMP concentration, which is a feature crucial for signal termination. PDE8A1 is a high-affinity cAMP-specific IBMX insensitive phosphodiesterase, an enzyme important for cAMP signaling. However, mostly due to a lack of specific inhibitor, its role has not been assessed in detail. This thesis reports cloning of PDE8A1, identification of its posttranslational modifications and subcellular localization, as well as an alternative approach to address PDE biology by the use of cyclase toxin from Bordetella pertussis. Keywords: phosphodiesterase, cAMP, posttranslational modification, myristoylation, palmitoylation, adenylate cyclase toxin

La protéine du VIH-1 est une protéine essentielle à la transcription et à la réplication du virus. Elle a donc un rôle crucial dans la cellule infectée. On sait qu'une partie de la Tat cellulaire peut être sécrétée, malgré l'absence de séquence signal. En effet, les 2/3 de la Tat cellulaire sont exportés par la cellule T-primaire infectée. Le mécanisme de sécrétion de Tat est non conventionnel et se produit directement à travers la membrane plasmique où Tat est recrutée grâce à sa très forte affinité pour le phosphatidylinositol(4,5)-biphosphate ou PI(4,5)P2 qui est exclusivement localisé à ce niveau. La Tat extracellulaire a un effet délétère sur de nombreux types cellulaires et agit donc comme une toxine virale. Elle constitue un facteur déterminant de l'évolution vers le SIDA. En accord avec cette efficacité de sécrétion par les cellules T primaires infectées, Tat est essentiellement localisée sur la membrane plasmique des T primaires infectées par le VIH-1. Une fraction importante de Tat est donc résidente à la membrane et nous avons recherché un mécanisme pouvant expliquer cette rétention et mis en évidence la palmitoylation. Nos travaux montrent que Tat est palmitoylée, dans des cellules T ainsi que dans les ‘cibles' comme les neurones et les macrophages. Cette palmitoylation, qui inhibe la sécrétion de Tat, est réalisée sur la cystéine 31 de Tat (qui possède 7 cystéines) par l'enzyme DHHC20 avec comme cofacteurs nécessaires les immunophilines (prolyl-isomérases), Cyclophiline A et FKBP12, qui interagissent avec Tat au niveau de la membrane. Nos résultats indiquent aussi qu'en présence de Gag, la palmitoylation de Tat est inhibée. Nous pensons que l'export de la CypA dû à son encapsidation diminuerait la quantité de CypA disponible pour Tat, inhibant la palmitoylation de Tat et permettant sa sécrétion efficace par les cellules infectées. En effet, le VIH-1 encapside 250 copies de CypA/virion, le taux de CypA régulant la virulence des virions produits. Dans les cellules cibles, Tat serait fortement palmitoylée ce qui induirait sa fixation quasi irréversible au PI(4,5)P2, l'empêchant de ressortir de la cellule et permet ainsi un effet cumulatif des doses reçues par la cellules. Cette accumulation de Tat perturbe des processus membranaires dépendant du PI(4,5)P2 tels que la phagocytose et la neurosécrétion. La palmitoylation de Tat est nécessaire pour ces effets. Ces actions de la Tat extracellulaire pourraient participer au développement des infections opportunistes et des troubles neurologiques observé lors du SIDA. / HIV-1 Tat is a small protein that is required for viral transcription and multiplication. It thus has a crucial role in the infected cell. It was known that Tat can be secreted despite its lack of signal sequence. In fact 2/3 of cellular Tat are exported by infected primary T-cells. The unconventional secretion of Tat relies on its interaction with phosphatidylinositol(4,5)-biphosphate or PI(4,5)P2, a lipid that is concentrated within the inner leaflet of the plasma membrane and is strictly required for Tat secretion. Exogenous Tat has deleterious effects on several cell types, indicating that extracellular Tat is involved in evolution to AIDS. Consistent with this secretion efficiency, Tat is mainly localized at the plasma membrane of primary T-cells infected by HIV-1. A large fraction of Tat is resident at the membrane and we looked for a mechanism that could explain this retention and discovered that Tat is palmitoylated. Our studies show that Tat is palmitoylated, both in T-cells and also in ‘target' cells such as neurons and macrophages. Tat palmitoylation inhibits its secretion and is performed on Tat cysteine 31 (Tat has seven cyteines) by the enzyme DHHC20 using immunophilins (prolyl ismerases), Cyclophilin A (CypA) and FKPB12, as cofactors. Our results also indicate that the presence of Gag inhibits Tat palmitoylation. We believe that the export of CypA due to its encapsidation will make less CypA available for Tat, thereby inhibiting Tat palmitoylation. Indeed, HIV-1 encapsidates 250 copies of CypA/virion and the amount of CypA regulates the virulence of produced virions. In target cells, Tat is strongly palmitoylated and this modification induces its almost irreversible binding to PI(4,5)P2, preventing its secretion and allowing cumulative effect of minute Tat doses.Tat palmitoylation enables Tat to severely inhibit various PI(4,5)P2-dependent processes such as phagocytosis and neurosecretion. These effects of extracellular Tat likely contribute to the development of opportunistic infections and neurological disorders observed during AIDS.

The dynamic S-palmitoylation regulates many intracellular events, including protein trafficking, anchoring, targeting, and protein-protein interactions. Direct detection of S-palmitoylation by conventional liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) methods is challenging because of the tendency of palmitoyl loss during sample preparation and gas phase fragmentation. Additionally, the high hydrophobicity of the palmitoyl group can prevent proper elution of palmitoyl peptides from the commonly used C18 column. Here, we developed a comprehensive strategy tailored for S-palmitoyl detection using three palmitoyl peptide standards. We found that S-palmitoylation was largely preserved in neutral Tris buffer with tris(2-carboxyethyl)phosphine as the reducing agent and that various fragmentation methods provided complementary information for palmitoyl localization. Moreover, S-palmitoyl peptides were efficiently analyzed using a C4 column and the derivatization of free cysteine with a hydrophobic tag allowed relative quantification of palmitoyl peptides and their unmodified counterparts. We further discovered potential complications to S-palmitoylation analysis caused by the use of ProteaseMAXTM, an MS-compatible detergent. The hydrophobic degradation products of ProteaseMAXTM reacted with the free cysteine thiols, generating artifacts that mimic S-acylation and hydroxyfarnesylation. Another MS-compatible detergent, RapiGestTM, did not produce such artifacts, and showed the ability to stabilize S-palmitoylation by preventing thioester hydrolysis and dithiothreitol-induced thioester cleavage. Moreover, we found that the palmitoyl peptide GCpalmLGNAK could undergo intermolecular palmitoyl migration from the cysteine to the peptide N-terminus or the lysine side chain during sample preparation, and this could lead to false discovery of N-palmitoylation. RapiGestTM inhibited such migration, and is thus recommended for S-palmitoyl sample preparation. We then applied the established method to analyze the regulator of G-protein signaling 4 (RGS4) which had been reported to undergo S-palmitoylation by radioactive labeling. It had also been reported that the S-palmitoylation state of RGS4 affects its GTPase activity. With LC-MS/MS analysis, we found that the addition of palmitate to the cell culture medium in metabolic labeling experiments could boost the level of S-palmitoylation, leading to false discovery of new S-palmitoylation site(s). We also noted discrepancies between the S-palmitoylation sites identified by radioactive labeling and by LC-MS/MS analysis. Further studies are needed to evaluate the reliability of S-palmitoyl detection by these two methods.

Humans are approximately 99% similar with inter-individual differences caused in part by single-nucleotide polymorphisms (SNPs), which poses a challenge for the effective treatment of disease. Bioinformatics resources can help to store and analyse gene and protein information to address this challenge, however these resources have limitations, so the collation and biocuration of gene and protein information is required. Using the large conductance calcium- and voltage-activated potassium channel, also known as the Big Potassium (BK) channel as an example, due to its ubiquitous expression and widespread varied role in human physiology, this study aimed to prioritise SNPs with the potential to affect the function of the channel. Using a BK channel resource created with bioinformatics tools and published literature, mSlo SNPs H55Q and G57A, located in the S0-S1 linker, were prioritised and selected for lab-based verification. These SNPs flank three cysteine residues proven to modulate channel cellular distribution via palmitoylation, a reversible process shown to increase protein association with the cell membrane. The SNPs alter the predicted palmitoylation status of C56, one of the cysteine residues located in the S0-S1 linker. The cellular distribution of BK channels incorporating the SNPs was assessed using confocal microscopy and revealed that the direction and magnitude of SNP mimetic cell membrane expression was closely related to the C56 predicted palmitoylation score; a 'C56 palmitoylation pattern' was observed. It was shown that exposure to metabolic substrates glucose, palmitate and oleate modulated SNP-mimetic cellular distribution and could invert the 'C56 palmitoylation pattern', indicating that there is interplay between the metabolic status of the cell and the amino-acid composition of the channel via palmitoylation. The creation of a novel BK channel resource in this thesis highlighted the limitations, and inter-dependency of bioinformatics and lab based experimentation, whilst SNP verification experiments solidified the link between S0-S1 cysteine residues and BK cellular distribution. BK channel function is linked with a number of physiological processes; thus, the potential clinical consequences of the SNPs prioritised in this thesis require further research.

Dans les neurones, la stabilité des microtubules est induite par leur association avec deux protéines associées aux micotubules, les protéines E- et N-STOP (Early and adult neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). L'invalidation du gène stop chez la souris entraîne des défauts de la transmission synaptique associée à une réduction du nombre de vésicules synaptiques. <br />Les neurones matures contiennent également une protéine apparentée à la protéine N-STOP, la protéine SL21 (STOP like protein of 21 kDa) qui possède deux zones homologues aux protéines STOPs : un domaine homologue au domaine de liaison et de stabilisation des microtubules et une région de 35 acides aminés située à l'extrémité amino-terminale. Cette protéine se localise à la fois au niveau de l'appareil de Golgi et des microtubules.<br />La première partie de ce travail est consacrée à la caractérisation fonctionnelle du domaine amino-terminal. Il contient 3 résidus cystéines en position 5, 10 et 11 qui peuvent être palmitoylée (modification permettant l'association des protéines aux membranes). Nous avons montré que les cystéines 5 et 11 de SL21 sont palmitoylables mais que seule la cystéine 5 est suffisante et nécessaire pour localiser SL21 au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons également mis en évidence que la protéine STOP, en plus d'être localisée aux microtubules, s'associe également au Golgi par l'intermédiaire de son domaine amino-terminal homologue à SL21 et qu'elle est aussi palmitoylable.<br />Dans la deuxième partie de ce travail, pour mieux comprendre la fonction de SL21, nous nous sommes intéressées aux partenaires de SL21. Un criblage ciblé en Double-Hybride, utilisant comme protéines cibles des protéines connues comme étant des partenaires de STOP, a été réalisé au laboratoire. Trois partenaires potentiels ont été mis en évidence : la protéine Tctex1, une des chaînes légère du moteur moléculaire dynéine. Nous avons confirmé l'interaction de ces protéines avec SL21 par co-immunoprécipitation après surexpression dans les cellules et aussi, à partir d'un extrait de cerveau pour l'interaction de SL21 et de STOP. Nous avons également déterminé leur site d'interaction au niveau de SL21. La protéine Tctex1 interagit avec SL21 au niveau de son module de liaison aux microtubules, le site de multimérisation de SL21 se localise au niveau du domaine amino-terminal, pouvant impliquer la palmitoylation de ces protéines. <br />L'ensemble de ces résultats permet d'envisager un rôle des protéines STOPs au niveau de la régulation de la relation microtubule-membrane des vésicules synaptique au sein de la synapse

Les interférons (IFNs) de type I sont des cytokines qui jouent un rôle capital dans les défenses immunes, antivirales et antiprolifératives de l'organisme. En se liant à leur récepteur de surface, composé des deux sous-unités IFNAR1 et IFNAR2, ils induisent la cascade de signalisation JAK/STAT qui aboutit à leur effets biologiques. L'objectif de ma thèse était d'identifier des mécanismes de régulation de la signalisation des IFNs. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la palmitoylation du récepteur de l'IFN de type I, une modification lipidique souvent impliquée dans le trafic et la signalisation des protéines. Par marquage métabolique au palmitate tritié, nous avons montré qu'IFNAR1 et IFNAR2 sont palmitoylées. Le domaine cytoplasmique d'IFNAR1 contient deux cystéines, Cys463 et Cys502, qui sont des sites potentiels de palmitoylation. A l'aide de mutants sur chacune de ces cystéines, nous avons montré qu'IFNAR1 est palmitoylée uniquement sur sa cystéine la plus proche de la membrane plasmique, la Cys463. Un mutant non palmitoylé dans lequel cette cystéine a été remplacée par une alanine nous a permis de constater que la palmitoylation d'IFNAR1 n'est pas impliquée dans son trafic intracellulaire, dans son endocytose ni dans sa stabilité, mais qu'en revanche elle joue un rôle crucial dans l'activation de la voie de signalisation JAK/STAT. De façon concordante, la palmitoylation d'IFNAR1 est requise pour l'activation transcriptionnelle des gènes induits spécifiquement par l'IFN-a. Par contre, un défaut de palmitoylation n'influence nullement l'activité antiproliférative de l'IFN-a, en dépit du rôle de cette modification dans la signalisation.

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic positive-sense RNA virus of the Flaviviridae virus family and is a major cause of chronic liver disease worldwide. Like all obligate parasites, HCV relies on host pathways to enable its pathogenesis. HCV, in particular, has a clear link with hepatic lipid metabolism, promoting a lipid-rich environment for its proliferation. This manifests as liver steatosis in many patients harboring chronic HCV infection. Based on our recent findings regarding an immunometabolic and HCV antiviral microRNA (miRNA), miRNA-185 targeting and down regulating serine hydrolases (SH) involved in lipid and endocannabinoid metabolism, here we investigate HCV and its dependency on certain metabolic serine hydrolases involved in lipid and endocannabinoid metabolism. Serine hydrolases are one of the largest and most diverse enzyme families. This enzyme family has emerged as a center of therapeutic potential due to its implications in many metabolic roles. Here, we demonstrate that pharmacological inhibition of metabolic serine hydrolases alpha-beta hydrolyzing domain 6 (ABHD6), carboxylesterase 1 (CES1), and monoacylglycerol lipase (MGLL), enzymes involved in the hydrolysis of the endogenous cannabinoid receptor 1 (CB1) agonist 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) are potently antiviral against HCV. Serine hydrolase inhibition with the MGLL inhibitor MJN110 paired with endocannabinoid signaling antagonization led to additive antiviral effects against HCV and has revealed modulation of the viral pathogenic phenotype to be its key course of action. MGLL inhibitor MJN110 transcriptomic characterization revealed modulations in humoral immunity and phagocytosis and acts antiviraly against HCV independent of CB1 antagonization. This provides an avenue for future investigation, assessing the viability of CB1 antagonization, and MGLL as a key host targeted antiviral factor in affecting HCV viral life cycle.