Pseudorrwnas aeruginosa (PA) est un pathogène opportuniste responsable de pneumonies nosocomiales chez les patients immunodéprimés. L'émergence des souches multirésistantes rend les traitements antibiotiques inefficaces nécessitant la mise en place de thérapeutiques alternatives. Les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) constituent la première barrière physique que rencontre PA et ces cellules jouent un rôle important dans la réponse innée suite à l'infection. L'interleukine(IL)-22 est une cytokine dont l'intérêt thérapeutique est prometteur de par son action de protection des épithéliums. Le renforcement de la barrière épithéliale par le traitement à l'IL-22 a montré des effets protecteurs contre l'infection à PA dans un modèle murin de pneumonie. Nous avons caractérisé l'action in vitro de l'IL-22 au cours de l'infection à PA en utilisant une lignée transformée d' AEC de type II et nous avons démontré que cette cytokine potentialise l'expression d'interférons lambda (IFN°À) connus pour être bénéfiques au cours des infections virales. L'administration in vivo d'IFN-À dans un modèle murin de pneumonie aiguë à PA montre une amélioration significative de la pathologie accompagnée d'une réduction du recrutement de polynucléaires neutrophiles. PA est un pathogène capable d'échappement immunitaire lors de la mise en place de la réponse de l'hôte au cours de l'infection. En développant ex vivo un modèle de granulome à PA, nous avons observé une augmentation d'expression des 1,. molécules PD-Ll sur les monocytes. Ceci suggère une implication de la voie PD-I/PD-Ll dans l'épuisement lymphocytaire au cours de l'infection à PA. / Pseudorrwnas aeruginosa (PA) is an opportunistic pathogen, and a leading cause of nosocomial infections, Emergence of multidrug resistant strains alter antibiotic efficacy and requires the development of alternative therapeutics. Alveolar epithelial cells (AEC) are the first line of defence against PA and play a crucial role in initiating immune response following infection. Interleukin (IL)-22 is cytokine recently discovered acting specifically onto epithelial cells. IL-22 is a promising therapeutic when considering its epithelium protective action during infections. Reinforcement of epithelial barrier by IL-22 treatment showed protective effects against PA in a murine pneumonia model. We here characterized the in vitro IL-22 effects during PA infection by using transformed cell line of AEC type II and showed enhanced Interferons lambda (IFN-À) production, which are known to be protective against viral infection. In vivo IFN-À administration in a murine model of acute PA pneumonia showed significant pathology improvement and dampened neutrophil recruitment. PA is a pathogen able to interfere and to escape the host response during infection. To study the mechanisms of immune escape and subversion of PA during host response, we developed an in vitro granuloma model following PA infection. We showed a significant induction of PD-LI expression in monocytes suggesting a PD- I/PD-LI involvement in T cells exhaustion during PA infection.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un virus herpès oncogène causant la mononucléose infectieuse et est associé à différents types de cancer d'origine épithélial et lymphoïde. Nous avons précédemment démontré que EBV peut infecter et se répliquer dans les monocytes humains. Suite à cette infection, plusieurs fonctions importantes du monocyte s'en trouvent affectées, dont la phagocytose, la biosynthèse de prostaglandine E2 et la production de TNF-oc et d'IFN-a. Il est bien connu que l'IFN de type I (IFN-a/(3) est un puissant médiateur antiviral qui est rapidement sécrété par les cellules infectées lors des stades précoces de l'infection. OBJECTIFS Ce projet vise à caractériser le(s) mécanismes(s) affectant la production d'IFN-a par les monocytes humains infectés par le virus EBV en étudiant notamment la cascade d'activation des protéines JAKs et STATs. MÉTHODES Nous avons évalué l'effet de l'infection des monocytes humains par EBV sur l'activation des facteurs de transcription IRF-3 et IRF-7, sur les protéines de la cascade des JAKs-STATs Qakl, Tyk2, Statl et Stat2) ainsi que sur les protéines SOCS. RÉSULTATS L'activation des protéines IRF-3 et IRF-7 n'est pas affectée, puisqu'il a été possible d'observer une translocation nucléaire de ces facteurs de transcription suite à l'infection par EBV. Cependant, la boucle d'amplification de la voie des JAKs-STATs est supprimée suite à l'inhibition de la phosphorylation de Statl. Le mécanisme d'inhibition de la synthèse d'IFN-a par le virus EBV dans les monocytes humains implique l'activation de la protéine SOCS-3. CONCLUSION Ce projet permet d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes immunosuppresseurs mis en œuvre par EBV afin de supprimer les fonctions monocytaires. / Epstein-Barr virus (EBV) is an oncogenic herpesvirus recognized as the causative agent of infectious mononucleosis and is associated with several human malignancies. We have recently provided evidences that human monocytes were permissive to EBV infection and replication. Following infection, EBV can affect various cellular functions of monocytes, such as phagocytosis, biosynthesis of prostaglandins E2 and production of TNF-a and IFN-a. The type I interferon System (IFN-a/p) represents an important elements of host defence against ail kinds of pathogens, mainly viruses. Following infection, virus-infected cells rapidly produce and secrete IFN-a/p. OBJECTIVES The present work aims to determine the mechanism affecting the IFN-a production by the EBV-infected monocytes, in particular by the study of the JAK-STAT pathway. METHODS We examined the effect of EBV infection in monocytes on IRF-3 and IRF-7 nuclear accumulation, on JAKs and STATs proteins activation (Jakl, Tyk2, Statl and Stat2), and on SOCS proteins expression. RESULTS The IRF-3 and IRF-7 activation is not affected, since it was possible to observe a nuclear translocation of these transcription factors following EBV infection. However, the positive-feedback loop of the JAK-STAT pathway was found to be affected by the inhibition of Statl phosphorylation. The mechanism of IFN-a inhibition in EBV-infected monocytes involves the SOCS-3 protein activation. CONCLUSION Further description of EBV inhibitory mechanisms on monocytes immune functions would certainly improve our understanding of the role of these cells in the early stages of EBV pathogenesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs des cytokines à structure α-hélicoïdale sont pour la plupart composés de deux sous-unités transmembranaires associées aux protéine tyrosine kinases de la famille Janus (Tyk2, Jak1, Jak2 et Jak3). La fixation de la cytokine à son récepteur induit une dimérisation des sous-unités ce qui entraîne l'activation des Jak par transphosphorylation. Les Jaks ainsi activées phosphorylent les facteurs de transcription STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) qui transloquent dans le noyau. Les tyrosine kinases Jak présentent en position N-terminale un domaine FERM (4.1-ezrin-radixin-moesin), suivi par un domaine dit 'SH2-like' et deux domaines kinases: un domaine dit 'kinase-like' (KL) à fonction régulatrice et un domaine catalytique de type tyrosine kinase en position C-terminale. L'association au récepteur se fait par la région N-terminale. Le laboratoire s'intéresse particulièrement au récepteur de l'interféron de type I (IFNα/β) composé de deux chaînes, IFNAR1 et IFNAR2, et aux kinases Tyk2 et Jak1 auxquels elles s'associent respectivement. La première partie de ma thèse a porté sur l'étude d'un nouveau partenaire de Tyk2, la protéine Pot1 (Partner of Tyk2) et de son rôle potentiel dans la voie de signalisation de l'IFNα. Plusieurs ADNc partiels de Pot1 avaient été isolés dans le laboratoire par criblage double-hybride utilisant comme appât le domaine FERM de Tyk2. Un ADNc complet de Pot1 avait été reconstruit donnant lieu à une protéine de 1003 acides aminés (aa). L'interaction entre cette protéine et les domaines FERM de Tyk2 et de Jak1 avait été confirmée par des expériences in vitro. L'analyse par northern blot de Pot1 montre une expression faible dans plusieurs tissus. L'étude de la localisation de la protéine Pot1 surexprimée avait montré une localisation cytoplasmique au niveau de vésicules non identifiées. Un des aspects de mon travail sur Pot1 a été de déterminer si l'ADNc reconstruit dans le laboratoire, appelé 'lab cDNA', correspond à un vrai transcrit. En effet, les banques de données recensent plusieurs autres transcrits issus du gène Pot1, avec une portion 3' commune et identique au 'lab cDNA', mais une région 5' divergente. Ces transcrits donnent lieu à deux isoformes ne possédant pas les 200 aa ou 250 aa en position N-terminale par rapport à la protéine de référence codée par le 'lab cDNA'. De plus, l'unique protéine murine (mPot1) recensée dans les banques de données ne possède pas les 100 aa en N-terminal par rapport à la protéine humaine de référence. Pour analyser l'expression de différents transcrits, j'ai amplifié l'ADNc de cellules humaines HEK293T avec des primers me permettant de 12 distinguer les différents transcrits. Ces expériences ont permis de confirmer l'expression du transcrit correspondant au 'lab cDNA' et codant pour une isoforme de 1003 aa (112 kDa). Par la suite j'ai étudié la localisation de la protéine Pot1 murine dans les cellules surexprimant mPot1. J'ai observé que mPot1 se trouve dans des vésicules cytoplasmiques, tout comme la protéine humaine, et semble être associée à la membrane de ces vésicules. Toutefois, nous ne pouvons pas écarter la possibilité de localisation inadéquate dû à la forte surexpression de mPot1. Il sera nécessaire de confirmer cette observation par l'analyse de la localisation de la protéine endogène. A ce jour les anticorps disponibles ne permettent pas sa détection. Afin d'évaluer le rôle de Pot1 dans la voie de signalisation de l'IFNα, j'ai mesuré la réponse à l'IFNα de cellules déplétées en Pot1 par interférence à l'ARN. J'ai mesuré la phosphorylation des protéines STAT et l'induction d'un gène rapporteur. Ces expériences ont montré que, dans ce système, la diminution de l'expression de Pot1 n'a pas d'effet sur la signalisation par l'IFNα. Afin d'éclairer la fonction de Pot1, de nouveaux interacteurs de Pot1 ont été recherchés par criblage double-hybride. Parmi les 14 protéines identifiées à haut niveau de confiance, nous nous sommes particulièrement intéressés à GIT1 (G protein-coupled receptor kinase interactor), une protéine adaptatrice impliquée dans de nombreux processus cellulaires, tels que l'internalisation de récepteurs, la signalisation induite par l'EGF (epidermal growth factor) et l'angiotensine II ainsi que la migration cellulaire. Afin d'analyser le rôle éventuel de GIT1 dans la signalisation par l'IFNα, j'ai mesuré plusieurs paramètres (internalisation des sous-unités du récepteur, phosphorylation des STAT, induction d'un gène rapporteur) dans des cellules surexprimant ou déplétées en GIT1. Les résultats obtenus ont écarté l'hypothèse d'une implication de GIT1 dans la réponse transcriptionnelle à l'IFNα. La deuxième partie de mon travail a porté sur l'étude de la mutation V678F introduite dans la protéine Tyk2.Cette substitution est située dans le domaine KL et correspond à la mutation V617F de Jak2, décrite comme étant à l'origine de la Polycythemia vera. La P. vera, ou maladie de Vaquez, est une maladie myéloproliférative caractérisée par une hyperproduction d'érythrocytes et leur hypersensibilité à l'érythropoiétine (Epo). Il a été montré que la mutation V617F induit une augmentation de l'activité kinase de base de Jak2. De même, Jak2V617F induit une prolifération indépendante de facteurs de croissance des cellules murines BaF3, confirmant son potentiel transformant. Toutefois, il a été montré que 13 Jak2V617F nécessite la coexpression d'un récepteur homodimérique, tel que récepteur à l'Epo, pour exercer une activité transformante maximale. Les questions que nous nous sommes posées sont les suivantes: 1) quel est l'effet de la substitution V678F sur l'activité catalytique de Tyk2? 2) quel est l'effet du mutant Tyk2V678F sur la signalisation par l'IFNα? 3) le mutant Tyk2V678F aurait-il un effet plus marquant ou délétère s'il est placé dans un contexte de récepteur homodimérique? A cet effet, nous avons établi, à partir de cellules Tyk2-déficientes, des clones stables exprimant la protéine sauvage ou mutante. Nos résultats montrent que la mutation V678F augmente in vivo et in vitro la capacité de Tyk2 à s'auto-phosphoryler. Par la suite, j'ai mesuré la phosphorylation sur tyrosine des protéines STAT en réponse à l'IFNα. Aucune différence de niveau de phosphorylation de STAT1/2/5 n'a pu être décélée entre les cellules exprimant la protéine sauvage et les cellules exprimant le mutant Tyk2V678F. Par contre, j'ai mis en évidence une phosphorylation basale de STAT3 augmentée en présence de Tyk2V678F. Pour déterminer si cette phosphorylation basale de STAT3 corrèle avec une augmentation de son activité transcriptionnelle, j'ai analysé l'activité transcriptionelle de STAT3 à l'aide d'un gène rapporteur. Les résultats montrent que, dans les cellules exprimant le mutant Tyk2V678F, STAT3 possède une activité transcriptionelle augmentée. Afin d'étudier l'effet du mutant Tyk2V678F placé dans un contexte de récepteur homodimérique, j'ai utilisé des cellules exprimant un récepteur chimérique comprenant l'ectodomaine du récepteur à l'Epo fusionné aux régions transmembranaire et cytoplasmique de la chaîne IFNAR1 (EpoR/R1). A l'aide de ces cellules, j'ai pu confirmer que l'expression du mutant Tyk2V678F engendre une phosphorylation basale de STAT3. De plus, dans ce contexte de récepteur homodimérique, suite à stimulation par le ligand Epo, le mutant Tyk2V678F induit une augmentation ultérieure de la phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5. Nous avons aussi voulu comparer directement le niveau de phosphorylation de Tyk2V678F et de STAT3 dans différents contextes de récepteurs. Les résultats obtenus montrent que la protéine Tyk2V678F est plus phosphorylée basalement dans les cellules exprimant le récepteur homodimérique EpoR/R1. Ceci est probablement la conséquence d'une transphosphorylation plus efficace de deux kinases mutantes juxtaposées. Par contre, la phosphorylation de STAT3 ne corrèle pas directement avec le niveau d'expression du mutant Tyk2V678F, ce qui suggère une absence de corrélation linéaire entre l'activation de Tyk2 et et de STAT3. 14 En conclusion, nous avons montré que la mutation V678F augmente l'activité catalytique de Tyk2. De plus, le mutant acquiert la capacité de phosphoryler STAT3 et ceci en absence du ligand. Cependant, le mutant Tyk2V678F n'affecte pas la réponse à l'IFNα en terme de phosphorylation de Jak1, STAT1 et STAT2. Ces résultats démontrent une interaction fonctionnelle étroite entre Tyk2 et STAT3. Etant donné que STAT3 constitutivement actif exerce des propriétés oncogéniques et que STAT3 est phosphorylé dans de nombreux cancers, il est possible de prédire aussi un rôle oncogénique pour Tyk2 constitutivement active. Récemment, il a été suggéré qu'un polymorphisme de Tyk2, P1104A, pourrait être associé à la présence de tumeurs. Cette substitution est située dans le domaine tyrosine kinase au sein d'une hélice α présente uniquement dans les membres de la famille Jak. Nous avons introduit cette mutation dans Tyk2 et analysé son effet sur l'activité kinase. Les résultats montrent que le mutant Tyk2P1104A est incapable de s'autophosphoryler in vitro. Toutefois, en réponse à l'IFNα, aucune différence du niveau de phosphorylation de STAT1/2 /3 n'est décélée dans les cellules exprimant Tyk2P1104A par rapport aux cellules exprimant la protéine sauvage. Ces résultats suggèrent que la mutation P1104A abolit la capacité autophosphorylante de l'enzyme, mais n'affecte pas l'activité enzymatique induite par l' l'IFNα envers d'autres substrats in vivo. Ces résultats préliminaires devront être renforcés par des études plus approfondies de l'effet de la mutation P1104A sur la fonction que Tyk2 exerce au sein du récepteur de l'IFNα/β ainsi qu'au sein d'autres récepteurs de cytokines de la réponse immune.

Le virus humain Herpès-8 (HHV-8) est un virus oncogene étroitement associé au développement du sarcome de Kaposi, au lymphome primitif des séreuses (PEL) et à la maladie de Castleman multicentrique. OBJECTIFS II est bien décrit que HHV-8 dérègle l'homéostasie cellulaire en affectant l'apoptose, le cycle cellulaire et les mécanismes d'activation du système immunitaire. De plus, ce virus est latent dans la majorité des cellules infectées. Les travaux présentés visent à étudier le rôle des protéines de latence de HHV-8 dans la mise en place de l'immunité innée via la synthèse d'interféron (IFN) de type I. METHODES Le rôle individuel de chacune des protéines de latence (vFLIP, vCyclin et LANA-1) sur la synthèse d'IFN de type I a été étudié par des expressions transitoires dans des cellules HEK-293T. L'étude synergique des trois protéines de latence sur la synthèse d'IFN de type I a été réalisée dans des cellules issues de lymphomes PELs exprimant des ARNs interférants contre ces gènes. RESULTATS Tout d'abord, les résultats obtenus démontrent, qu'en présence d'un activateur de la voie IFN, la protéine vFLIP active synergiquement le promoteur IFNB. Cette activation est strictement dépendante de l'activation de NF-KB par vFLIP et est médiée par la région de régulation PRD-II du promoteur IFNB (région de liaison de NF-KB). Ensuite, les résultats suggèrent que, lors d'une reconnaissance d'ADN étranger dans une cellule, LANA-1 inhibe la synthèse d'IFNB. Cette inhibition est générée par la liaison de LANA-1 au promoteur IFNB sur la région PRD-I-III (région de fixation des IRFs) empêchant ainsi la fixation du facteur de transcription IRF3 sur cette région. Puisque LANA-1 inhibe la transcription et l'expression de la protéine CBP, cette dernière ne peut également plus se fixer au promoteur IFNB. Ainsi, la formation du complexe enhanceosome sur le promoteur d'IFNB est altérée par la protéine LANA-1 et l'expression d'IFNB est fortement réduite. La région centrale répétée de la protéine LANA-1 a été démontrée comme majeure dans l'inhibition de la synthèse d'IFN-p. Ensuite, les résultats démontrent que la protéine vCyclin inhibe l'activation des promoteurs IFNB et NF-KB en présence d'un activateur de la voie IFN et ainsi, réduit l'expression d'IFNB. La protéine vCyclin réduit l'expression des facteurs de transcription IRF3 et p50, importants dans la formation du complexe enhanceosome sur le Ul promoteur IFNB, réduisant ainsi son activation. Enfin, puisque ces trois gènes sont transcrits par un même promoteur sous un transcrit tricistronique (vFLIP, vCyclin et LANA-1) épissé en transcrit bicistronique (vFLIP et vCyclin), le rôle synergique de ces protéines dans la synthèse d'IFN de type I a été étudié. Des lymphocytes B issues de PELs inductibles pour la production d'ARNs interférant avec le transcrit bicistronique, le transcrit polycistronique et la combinaison des deux transcrits ont été générés. Ces cellules expriment davantage d'IFNB suite à la réactivation du cycle de replication lytique ou lors d'une infection opportuniste. CONCLUSIONS Cette étude suggère que, par des expressions individuelles, seules les protéines vCyclin et LANA-1 agissent dans le but commun de réduire la synthèse d'IFN. Par contre, dans le cadre de cellules infectées, les trois protéines de latence agissent de concert pour inhiber la synthèse d'IFN. Un modèle murin a été généré pour étudier la pathogénèse induite par HHV-8 en injectant des cellules portant le génome de HHV-8 introduit dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) dans des souris immunodéficientes. Le BAC pourrait être utile pour générer des cellules portant des virus mutants pour chacun des gènes latents. Ces cellules pourraient être injectées dans des souris afin d'étudier leur rôle dans la synthèse d'IFN-P dans un contexte d'infection in vivo.

L'interféron-y est une cytokine produite entre autres par les lymphocytes T effecteurs et est impliquée dans la réponse immunitaire ainsi que dans les maladies inflammatoires de type Thl. Les intégrines liant le collagène ont été récemment impliquées dans les maladies inflammatoires de type Thl. Puisque les lymphocytes T effecteurs expriment ces intégrines, nous avons émis l'hypothèse que l'adhésion des lymphocytes T au collagène peut être impliquée dans la régulation de l'expression de l'interféron-y. Nous avons déterminé que le collagène de type I, par l'intermédiaire de son récepteur, l'intégrine oc2pi, augmentait significativement l'expression et la production de l'interféron-y induite par le TCR. Des expériences d'inhibition ont démontré que les MAP kinases ERK et JNK, mais pas p38 sont nécessaires pour la production d'interféron-y et que le collagène de type I augmentait significativement l'activation de ces deux MAP kinases. Le collagène de type I augmente également l'activation de la voie PI-3 kinase/AKT qui est aussi nécessaire à l'expression de l'interféron-y. Par contre, le collagène de type IV, liant l'intégrine al pi, n'augmente pas l'expression d'interféron-y, probablement dû au fait qu'il n'augmente pas l'activation de JNK induite par le TCR. Nos résultats suggèrent que l'intégrine oc2pi exprimée chez les lymphocytes T effecteurs peut contribuer au développement des maladies Thl en augmentant l'expression de l'interféron-y. Ainsi l'intégrine a2pi pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des maladies inflammatoires de type Thl. / Interferon-y is a cytokine produced by Thl cells and is involved in cell-mediated immune response and Thl inflammatory diseases. Collagen binding integrins have recently been involved in the development of Thl inflammatory diseases. Since Thl cells express these integrins, we hypothesized that adhesion of T cells to collagens could be involved in regulating the expression of interferon-y. We demonstrated that collagen type I, through its receptor the integrin a2pi, augmented significantly the expression and production of interferon-y induced by the T cell receptor (TCR). Inhibition studies demonstrated that the MAP kinases ERK and JNK but not p38 were necessary for interferon-y production and that collagen type I augmented significantly the TCR-dependant activation of these two MAP kinases. Similarly, collagen type I also augmented the activation of the PI-3 kinase/AKT pathway which is also required for the expression of interferon-y. Our results indicate that the a2|31 integrin expressed on effector T cells can participate in development of Thl diseases by augmenting the expression of interferon-y through the ERK, JNK and PI-3 kinase/AKT pathways. In contrast, collagen type IV, which binds to a l (31 integrin, does not increase interferon-y expression probably because it does not increase TCR-dependant activation of JNK. Our study suggests that a2(31 integrin could contribute to Thl diseases by increasing the production of interferon-y and therefore could be a potential target in the treatment of Thl inflammatory diseases.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de l’épiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L’EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L’EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d’EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l’interféron gamma (IFN-γ) ont été réalisés afin de stimuler la production de la K15. Les résultats ont révélé que l’IFN-γ réduit l’expression et la production de la K15 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s’expliquer par un effet « régulateur » de l’IFN-γ sur la K15 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l’augmentation de l’expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l’IFN-γ ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l’EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Pas de résumé français / Pas de résumé anglais