Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-29 / O Papilomavírus Bovino infecta epitélios, ocasionando tanto lesões cutâneas, geralmente benignas, como também cânceres no trato digestivo e urinário. Objetivos: Neste trabalho, foram estabelecidas culturas primárias obtidas de lesões de animais infectados por BPV com diferentes características clínicas e avaliadas as diferenças morfológicas, citogenéticas e moleculares dessas células primárias em relação às células de cultivo de animais sadios e alguns parâmetros comparado com células de cultivos temporários de linfócitos de sangue periférico. Métodos: Foram coletadas amostras de sangue e biópsias de 9 animais avaliados clinicamente como sadios, com papilomatose cutânea, papilomatose esofágica e hematúria enzoótica. Tais amostras foram analisadas histopatologicamente, citogeneticamente e submetidas à investigação de presença de sequências de DNA viral. Foram estabelecidos cultivos primários de cada grupo de amostras e realizada a caracterização morfológica, curva de crescimento e senescência, marcação de proteínas de citoesqueleto (vimentinas, citoqueratinas e actinas), adesão focal (paxilina e vinculina) e proteína do capsídeo viral L1. Resultados: Detectou-se a presença do DNA viral nas primeiras passagens dos cultivos estabelecidos assim como se observou maior número de células com alterações cromossômicas nos três grupos de animais clinicamente afetados em relação aos sadios, tanto nos cultivos primários quanto nos cultivos temporários de linfócitos de sangue periférico, destacando-se rearranjos com adições e deleções, seguidos das quebras cromatídicas e fragmentos acêntricos. As células dos grupos clinicamente afetados por BPV apresentaram marcação dupla de vimentina e citoqueratina, sugerindo um fenômeno chamado transição epitelial-mesenquimal já visto em alguns casos de cânceres. Nesses cultivos, as marcações das fibras de actina e das proteínas de adesão focal mostraram desarranjo, retração das fibras e formação de lamelipodia, provavelmente fruto da ação das proteínas virais. Também foi detectada por imunofluorescência a presença de proteína do capsídeo viral na região nuclear e perinuclear. Conclusões: A presença do DNA do vírus através das passagens, as alterações cromossômicas e a expressão da proteína viral são evidências pela primeira vez apresentadas de que os vírus mantém alguma atividade in vitro. Alterações tanto das proteínas do citoesqueleto como de adesão focal apontam para que essas mesmas células já estejam sofrendo as primeiras mudanças para um processo neoplásico. / The bovine papillomavirus is responsible for infecting epithelia causing skin lesions, usually benign, but also cancers of the digestive and urinary tract. Objectives: In this study, we evaluated the morphological, cytogenetic and molecular aspects of primary cells cultures presenting BPV DNA sequences, collected from animals with diffe rent clinical features and compared to cells from healthy animals. Methods: We collected blood samples and biopsies from healthy animals, bovines with cutaneous papillomatosis, esophageal papillomatosis, and enzootic hematuria, which were analyzed by histopathology, cytogenetics and viral DNA sequence detectio n. We established primary cultures of samples collected from each group and made the cell characterization by morphology, growth and senescence patterns, protein cytoskelet on (vimentin, cytokeratin and actin), focal adhesion (paxillin and vinculin) and vir al capsid L1 protein detection. Results: We detected the presence of viral DNA sequences in the early passages of primary cell cultures and observed a greater number o f cells with chromosomal alterations in the three groups presenting BPV DNA sequences, when compared to healthy animals, both in primary cells and blood lymphocyte cultures, being the most evident alterations the rearrangements with additions or deletions of segments, followed by the chromatid breaks and Acentric Fragments. Th e cells of the groups obtained from BPV infected lesions had showed a concomitant vimentin and cytokeratin labeling, suggesting a phenomenon identified as epithelial-m esenchymal transition often described in cancers. In these cell lines infected, the actin fibers and focal adhesion proteins showed disarray, retraction of actin fibers and a lamella r formation, probably resulting from the viral proteins action. It was also detected by immunofluorescence the presence of viral capsid L1 protein in the nuclear a nd perinuclear region. Conclusions: The presence of the virus DNA sequences through the passages, chromosomal alterations and expression of viral protein indicate, for the first time, that the virus maintains some activity in vitro . Alterations in cytoskeleton and focal adhesion proteins pointed out that these cells cultures are already suffe ring the early changes to a malign process. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Rodrigo Franco de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T18:01:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Modolo_DiegoGrando_D.pdf: 3351414 bytes, checksum: 2f6c8310f0efbb6e6f3d2e48e34de879 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Brasil é conhecido por ter o segundo maior efetivo bovino e por ser o maior exportador de carne bovina no mundo. Dentre os problemas que afetam a pecuária nacional está a papilomatose bovina, uma doença infecto contagiosa causada pelo papilomavírus bovino (BPV). Diversas doenças de alto impacto econômico não só na pecuária nacional mas também mundial estão associadas ao BPV, sendo que ainda não existe uma vacina que possa prevenir o alastramento da doença e nem métodos eficázes de tramento. A proteína L1 do capsideo do BPV tipo 1 é uma forte candidata para ser utilizada na formulação vacinal por ser altamente imunogênica e ter a capacidade de formar, sozinha, partículas "virus-like" (VLPs). Devido a incapacidade de se multiplicar papilomavírus "in vitro", a utilização de sistemas de produção de proteínas recombinantes é a melhor estratégia para produção de proteínas virais em larga escala que possam ser utilizadas em formulações vacinais ou em testes de diagnósticos. Neste trabalho desenvolvemos uma plataforma de produção e purificação da proteína recombinante L1 em bactéria. A proteína L1 recombinante foi purificada por cromatografia de troca iônica e foi possível obter frações em alto nível de pureza. Também produzimos plantas transgênicas visando a produção da proteína L1. A transformação genética de plantas foi confirmada por PCR e RT-PCR, mas devido a inespecificidade dos anticorpos comerciais disponíveis e a uma possível baixa expressão do gene L1 em plantas, não foi possível confirmar a expressão da proteína recombinante. A proteína L1 obtida em bactérias poderá ser analisada como vacina e bem como na obtenção de anticorpos mais específicos e na produção de testes de diagnósticos. O conhecimento obtido neste trabalho poderá ser adaptado no desenvolvimento de outras vacinas de importância socio-econômica. / Abstract: Brazil is known as the largest exporter of beef and for having the second largest cattle herd in the world. Several illness that affect the national cattle industry are associated to the bovine papillomatosis, an infectious disease caused by Bovine Papillomavirus (BPV). Althought the economic impacts of these diseases affect the livestock at a global scale, there is no BPV vaccine or effective treatment methods available yet. The L1 capsid protein of BPV type 1 is a good candidate to be used in a vaccine formulation due its high immunogenicity and the ability to form virus-like particles (VLPs). Due to the inability to multiply papillomavirus in vitro, the use of recombinant protein production systems is the best strategy to produce viral proteins in large scale that can be used in vaccine formulations or for diagnosis testing. In this work, we developed a bacteria expression system to produce the recombinant L1 protein. The recombinant L1 protein was purified by ion exchange chromatography and highly purified fractions of L1 were obtained. We also obtained transgenic plants to produce the L1 protein. The genetic transformation of plants was confirmed by PCR and RT-PCR. Due to lack of specificity of commercial antibodies used in this study and a possible low expression of the L1 gene in plants, it was not possible to confirm the accumulation of the recombinant protein. The protein obtained in bacteria can be evaluated as vaccine as well as in the production of more specific antibodies and diagnosis tests. The knowledge obtained in this work can be adapted in the development of vaccines for other important socio-economic diseases / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular