El estrés ejerce sus efectos sobre el organismo, no sólo a través de las vías de respuesta fisiológica, sino también a través de vías genéticas y epigenéticas. Muchos autores sostienen que el estrés es un factor clave para explicar el papel evolutivo del sexo en los organismos de modo reproductivo facultativo. Por lo tanto, es esperable que los mismos se crucen más frecuentemente bajo situaciones de estrés, facilitando la adaptación a ambientes cambiantes. Eragrostis curvula es un complejo polimórfico donde la mayoría de sus miembros se reproducen por apomixis, reproducción asexual a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. El objetivo de esta tesis fue determinar el efecto de diferentes factores que generan estreses genómicos sobre la expresión de la apomixis en pasto llorón, como el estrés hídrico, el cultivo in vitro, la poliploidización y la hibridación intraespecífica. Para ello, se analizaron sacos embrionarios de plantas de distintos genotipos de pasto llorón luego de haber sido sometidas a dichas condiciones. Además, se realizaron pruebas de progenie con marcadores moleculares y se analizó el nivel de metilación de los genomas luego de los diferentes tratamientos. Antes de evaluar el efecto de situaciones estresantes sobre el modo reproductivo fue necesario analizar la estabilidad del carácter a lo largo del periodo de floración, hallándose que el cv. Tanganyika INTA presenta una sexualidad promedio menor al 2 % en condiciones de invernáculo. Plantas del cv. Tanganyika INTA bajo condiciones de estrés por déficit hídrico mostraron un 14 % de sacos sexuales, indicando un incremento de expresión de la sexualidad respecto de las plantas control. Luego de un periodo de rehidratación mostraron una sexualidad residual del 5,3 %, indicando una disminución significativa de la misma, siendo, sin embargo, significativamente diferente del control. Se realizaron pruebas de progenie con marcadores RAPDs y se detectaron polimorfismos solamente en las plantas sometidas a estrés hídrico, aunque en una proporción menor a la esperada de acuerdo a los análisis citoembriológicos, indicando que no todos los sacos embrionarios sexuales producidos dan lugar a plantas viables. El cv. Tanganyika USDA no evidenció en ningún momento la capacidad de generar sacos sexuales, clasificándoselo como apomíctico obligado. El genotipo facultativo UNST1131 presentó una proporción de procesos sexuales del 18,5 % bajo condiciones de estrés hídrico. Sin embargo este valor no fue significativamente distinto al control (10 %), debido principalmente a la gran variabilidad observada. Para evaluar efectos mediados por ABA se realizaron ensayos de aplicación foliar en plantas del cv. Tanganyika INTA normalmente regadas. El análisis citoembriológico no permitió detectar diferencias significativas en el número de sacos sexuales en relación con el control, descartándose momentáneamente a la concentración de esta hormona como mediadora del efecto generado por estrés. También se analizó el efecto del cultivo in vitro realizando diferentes ensayos en los que se varió el tipo de explanto, el medio de cultivo y la duración de los mismos. Se evaluaron los cultivares Tanganyika USDA y Tanganyika INTA. Solo uno de los ensayos (exposición a medios selectivos) generó un efecto significativo sobre el número de sacos sexuales producidos, que incrementaron, demostrando una cierta plasticidad del carácter en situaciones de estrés. Estos resultados indicarían que situaciones de estrés previas y durante la etapa de floración podrían estar regulando la expresión de la sexualidad en genotipos apomícticos facultativos de pasto llorón. Es evidente que en los cvs. Tanganyika USDA, Tanganyika INTA y UNS1131 expresan diferentes niveles de apomixis/sexualidad, desde cero a 33%. Por otro lado, este estudio permitió demostrar que no solo las condiciones externas promueven estreses genómicos que alteran la expresión de la apomixis en pasto llorón. Condiciones como la poliploidización y la hibridación intraespecífica también afectan al modo reproductivo. El análisis de la expresión de la apomixis a través del tiempo en dos híbridos (105 y 60) obtenidos a partir de la cruza entre materiales contrastantes para el modo reproductivo mostró diferencias en la expresión del carácter. El primero (105) mostró un comportamiento errático en las proporciones de procesos apomíctico/sexuales, con estabilización del carácter tendiente a una relación 1:1 mientras que el otro, (60) presentó solo sacos sexuales en las dos primeras floraciones y una pequeña proporción de sacos apomícticos en la tercera. Los resultados obtenidos en las pruebas de progenie mostraron correlación con los observados por estudios citoembriológicos. Dada la relación entre la apomixis y el ambiente, podría especularse que los genes involucrados en el modo reproductivo son controlados por factores epigenéticos como la metilación del ADN. Se realizaron análisis comparativos sobre los genomas (AFLP) y epigenomas (MSAP) de varios grupos de plantas con el fin de establecer el efecto de estreses genómicos sobre el genoma y epigenoma. Los grupos de plantas comparadas fueron: 1) tratadas por estrés hídrico y plantas control del cv. Tanganyika INTA y 2) plantas híbridas del primer año de análisis y luego de tres años. En el primer caso, no se hallaron cambios genéticos en el tiempo en las plantas sometidas a estrés hídrico y control, mientras que las comparaciones con marcadores MSAP permitieron evidenciar un gran número de marcadores polimórficos debidos a procesos de metilación y desmetilación del ADN entre los dos tiempos de muestreo. Si bien no existe una diferencia estadística entre la suma de cambios ocurridos en el tiempo entre el grupo de plantas control y tratadas, se observó un alto grado de correlación (R2= 0,7949) entre los porcentajes de cambios ocurridos en el tiempo y los porcentajes de sexualidad calculados a través del análisis citoembriológico para cada individuo. En el híbrido 60 no se hallaron cambios genéticos en el tiempo, pero si se hallaron en el híbrido 105. En el análisis de los perfiles epigenéticos, el híbrido 60 mostró una mayor proporción de procesos de metilación, mientras que el 105 reveló una tendencia mayoritaria hacia la desmetilación del ADN. Esto podría atribuirse a una mayor inestabilidad genómica, que podría asociarse a un comportamiento más errático del modo reproductivo. La secuenciación de una muestra de los polimorfismos obtenidos por AFLP y MSAP mostró una alta proporción (55 %) de secuencias sin homología con regiones conocidas del genoma, pudiendo tratarse de metilaciones y desmetilaciones en regiones no codificantes o en secuencias del genoma aún no informadas. Las secuencias que mostraron homología con secuencias previamente anotadas fueron principalmente elementos transponibles. Los resultados aquí presentados y los previos obtenidos por el grupo de trabajo nos permiten hipotetizar que existe una región determinante de la apomixis, que estaría ausente en las plantas tetraploides sexuales. La misma podría contener regiones repetitivas y con redundancia génica que estarían silenciando la sexualidad en plantas apomícticas. Existen numerosas evidencias sobre el control mediado por pequeños ARNs en el silenciamiento de regiones repetitivas y elementos transponibles. Ante determinadas circunstancias, como condiciones de estrés prolongado, en esta región podría estar ocurriendo un efecto de des-represión epigenética, permitiendo un aumento en la proporción de procesos sexuales. Si bien aún resta trabajo experimental para comprobar esta hipótesis, los procesos de metilación y desmetilación observados y los elementos transponibles secuenciados serían evidencias preliminares a considerar. / Stress affects the organisms generating physiological, genetic and epigenetic responses. Many authors argue that stress is a key factor to explain the evolutionary role of sex in organisms with facultative reproductive mode. Therefore, it is expected that facultative organisms will cross more frequently under stress, facilitating the adaptation to changing environments. Eragrostis curvula constitutes a polymorphic complex where most of its members reproduce by apomixis, asexual reproduction through seeds, which leads to the generation of progenies genetically identical to the mother plant. The aim of this work was to study the effect of different factors that generate genomic stress on the expression of apomixis in weeping lovegrass, such as water stress, in vitro culture, polyploidization and intraspecific hybridization. For this purpose, embryo sacs of different weeping lovegrass genotypes were observed after being the plants subjected to these stress conditions. Moreover, progeny tests were conducted by using molecular markers and the genome methylation status after different treatments was also assessed. Before evaluating the effect of the mentioned stressors on the reproductive mode it was necessary to analyze the stability of the trait throughout the flowering period, finding that plants of the cv. Tanganyika INTA growing in the greenhouse exhibited an average of sexuality less than 2 %. Plants of this cultivar subjected to water stress showed an average of 14% of sexual embryo sacs, indicating an increased expression of sexuality compared to control plants. After a rehydration period these plants showed an average of sexuality of 5.3 %, indicating a significant reduction in the number of sexual embryo sacs, being, however, significantly different from control plants. Progeny tests were performed with RAPDs markers detecting polymorphisms only in plants subjected to water stress, although in a less ratio than the expected according to the cyto-embryological analysis, indicating that not all the sexual embryo sacs produced develop into viable plants. Plants of the cv. Tanganyika USDA did not show at any time the ability to generate sexual embryo sacs and being classified as full apomictic one. The facultative genotype UNST1131 showed an expression of sexual processes of 18.5 % under water stress conditions, however this value was not significantly different to the control (10%), mainly due to the large variability exhibited by this material. To assess effects mediated by ABA, foliar application were performed on normally watered cv. Tanganyika INTA plants. The cyto-embryologic analysis was unable to detect significant differences in the number of sexual embryo sacs compared to the control, dismissing for the moment the hormone concentration as a mediator of the effect generated by stress. The effect of in vitro culture was also analyzed performing different tests in which the explant type, culture media and time under culture were changed. Tanganyika USDA and Tanganyika INTA cultivars were evaluated. In only one of the trials (exposure to selective media) a significant effect on the number of sexual embryo sacs was observed, which increased, showing a certain plasticity of the trait when the plants were growing under stress conditions. These results indicate that stress situations before and during the flowering stage might be regulating the expression of sexuality in facultative apomictic genotypes of weeping lovegrass. It is evident that Tanganyika USDA, Tanganyika INTA and UNS1131 cultivars express different levels of apomixis/sexuality ratios, from zero to 33%. This study also demonstrated that not only external conditions promote genomic stresses that alter the expression of apomixis in weeping lovegrass. Conditions such as intraspecific hybridization and polyploidization also affect the reproductive mode. The analysis of the expression of apomixis over time in two hybrids (#105 and #60) obtained from crosses between sexual X apomictic materials showed differences in the expression of the trait. The first one (#105) showed an erratic behavior in the ratio of apomictic/sexual processes, ending after two years with a ratio of 1/1, while the other (#60), only showed sexual embryo sacs on the two first blooms and a small proportion of apomictic embryo sacs during the third one. The results of progeny tests correlated very well with the cytoembryological observations. Given the close relationship between apomixis and environment, it might be speculated that the genes involved in the control of the reproductive mode could be subjected to epigenetic regulation, involving DNA methylation in some way. Comparative analyses at genomic (AFLP) and epigenetic (MSAP) levels were performed on different groups of plants in order to analyze the effect of genomic stresses. The groups compared were: 1) plants under water stress and normally watered plants (control) belonging to cv. Tanganyika INTA; 2) recently hybridized plants (first blooming) and the same plants in the third blooming period. In the first case (water stressed vs. control plants), no genetic changes over time were observed while comparisons with MSAP showed a large number of polymorphic markers due to processes of DNA methylations and de-methylations, showing a high correlation level (R2 = 0.7949) between the percentages of changes over time and the number of sexual embryo sacs. In the hybrid #60 no genetic changes were detected as it was in the #105. However, the analysis of epigenetics profiles showed a higher proportion of methylation processes in the hybrid #60 than in #105, while DNA demethylation levels were in the opposite direction. This could be associated with a higher genomic instability in #105 than in #60 that could be correlated with an increased erratic behavior of the reproductive mode. The sequencing of a sample of the polymorphic AFLP and MSAP bands showed a high proportion (55 %) of sequences without homology to previously annotated sequences, being probably noncoding regions or unknown genes. The other sequences were mainly transposable elements. The results presented here and those previously reported by our group allow us to hypothesize that there is a critical region conditioning apomixis, which would be absent in sexual tetraploid plants. This region could contain repetitive elements and gene redundancy that might be silencing sexuality in apomictic plants. Under certain circumstances, such as long stress periods, the control could be relaxed, allowing an increase in the proportion of sexual processes.

La apomixis es una forma de reproducción clonal, donde no ocurre ni meiosis ni fecundación para la formación de la semilla. Existe una estrecha relación entre la apomixis y el nivel de ploidía, dado que en la mayoría de las especies que presentan el carácter los genotipos diploides son sexuales y los poliploides son apomícticos y con un grado variable de sexualidad (facultativos). Aunque se sabe que el carácter es regulado por una o más regiones del genoma, se han hallado numerosas evidencias de mecanismos epigenéticos que regulan su expresión. Conocer los factores que determinan la apomixis tendría un gran impacto en la agricultura. Eragrostis curvula (“pasto llorón”) es una gramínea forrajera originaria de Sudáfrica, que incluye genotipos con diferentes niveles de ploidía (2X hasta 8X, con X = 10), que pueden ser sexuales o apomícticos (facultativos u obligados). Nuestro grupo de trabajo realizó numerosos estudios, sobre todo en el carácter apomixis, tanto a nivel de genética estructural como funcional. El objetivo de esta tesis fue contribuir a la dilucidación de las bases genéticas y epigenéticas que regulan uno de los componentes de la apomixis (apomeiosis) en E. curvula. Se desarrolló una población de mapeo segregante para el carácter apomixis a partir del cruzamiento entre dos genotipos tetraploides, uno sexual (OTA-S) y otro apomíctico facultativo (Don Walter). La genotipificación se realizó con marcadores DArT-SNP y el fenotipado mediante citoembriología y un marcador molecular dominante. El mapa de ligamiento quedó conformado por 20 grupos de ligamiento (GL), con el posicionamiento del APO locus en el GL1, donde también se ubicaron tres marcadores SNP 100 % ligados al carácter apomeiosis. La secuencia de los SNP 100 % ligados tienen homología con proteínas anotadas en bases de datos, que podrían estar relacionadas al modo reproductivo. Se realizó un análisis de sintenia entre los GLs del mapa consenso y el genoma de referencia de la especie (cv. Victoria) que permitió asociar todos los GLs a alguno de los contigs y hallar los GLs que corresponderían potencialmente a cada uno de los genomas del alotetraploide (homeólogos). Para la validación de los marcadores se diseñaron y evaluaron cinco primers KASP que permitieron discriminar entre los alelos de los individuos sexuales y apomícticos. En el segundo capítulo se analizaron diferentes resultados obtenidos por el grupo de trabajo que evidencian la influencia de la epigenética sobre el carácter apomixis en plantas de E. curvula. Para analizar la participación de mecanismos de metilación del ADN en la regulación de la apomixis bajo condiciones de estrés hídrico, se realizó un ensayo en el cual muestras de ADN de inflorescencias fueron evaluadas mediante la “Estimación del contenido de metilación por doble corte con enzimas de restricción sensibles” (MCSeEd). En las regiones diferencialmente metiladas se lograron encontrar genes vinculados al modo reproductivo, como BABYBOOM, ubiquitinas, FBox y subtilisinas. Podría afirmarse que tanto el estrés interno como externo ejerce una gran influencia sobre el modo reproductivo de E. curvula, modificando la expresión del carácter apomixis en plantas apomícticas facultativas. / Apomixis is a type of clonal reproduction, where neither meiosis nor fertilization occurs in seed formation. There is a close relationship between apomixis and ploidy level, since in most of the apomictic species diploid genotypes are sexuals and polyploids are apomictics. Usually, apomictic plants are facultative, being some of the seeds sexuals in origin. Although it is known that this trait is regulated by one or more genomic regions, numerous evidences of epigenetic mechanisms that regulate its expression have been found. Knowing the factors that determine apomixis could have a great impact on agriculture. Eragrostis curvula, commonly known as weeping lovegrass, is a forage grass native to southern Africa, which includes genotypes with different ploidy levels (from 2X to 8X, with X = 10) and that can be sexuals or apomictics (facultative or obligate). Our work group carried out several studies on this model species, especially related with the apomixis character, both at the structural and functional genetic level. The objective of this thesis was to contribute to the elucidation of the genetic and epigenetic bases that regulate one of the components of apomixis (apomeiosis) in E. curvula. A segregating mapping population was generated for the apomixis trait from the cross between two tetraploid genotypes, one sexual (OTA-S) and the other one facultative apomictic (Don Walter). Genotyping was performed with DArT-SNP markers and phenotyping using cytoembryological techniques and a dominant molecular marker. The linkage map was made up of 20 linkage groups (LGs), with the apomeisis locus (APO locus) located on GL1, where three SNP markers 100 % linked to the APO locus were also located. All of this 100 % linked SNPs have homology with proteins, two of these annotated in databases. A synteny analysis was performed between the GLs of the consensus map and the E. curvula reference genome (cv. Victoria), which allowed all the GLs to be associated to any of the contigs and to find the GLs that would potentially correspond to each allotetraploid genome (homeologs). For the validation of the markers, five KASP primers were design and performed, allowing to discriminate between the sexual or apomictic alleles of the ndividuals of the mapping population. Furthermore, in a second chapter, several results obtained by the work group were evaluated, demonstrating an influence of epigenetic regulation on the apomixis trait in E. curvula. To analyze the involvement of DNA methylation mechanisms in the regulation of apomixis under water stress conditions, DNA samples of inflorescences under different stress conditions were evaluated, using the “Methylation content sensitive enzime double-digest restriction-site-associated DNA” (MCSeEd) method. Some of the genes identified in the differentially methylated regions were found to be related to the reproductive mode, such as BABYBOOM, ubiquitin, F-box and subtilisin genes. It could be proposed that stress, both internal and external, has a significant influence in the reproductive mode of E. curvula, modifying the expression of the trait in facultative apomicts.

E. curvula (Schrad.) Nees “pasto llorón”, es una gramínea perenne que constituye un importante recurso forrajero para regiones semiáridas. El objetivo general de este trabajo de tesis fue contribuir al mejoramiento del pasto llorón a partir de dos estrategias. La primera consistió en la obtención de nuevos materiales híbridos a partir de cruzamientos entre materiales sexuales y apomícticos y evaluar sus características moleculares y agronómicas. Por otro lado, se intentó poner a punto un protocolo de transformación genética, basado en Agrobacterium tumefaciens, que permita contribuir al mejoramiento de la calidad del forraje por regulación negativa de la biosíntesis de lignina y que sea una herramienta para la validación de genes relacionados con el modo reproductivo. En este trabajo se realizaron 15 cruzamientos entre OTA-S USDA y Tanganyika USDA, ambos tetraploides, siendo el primero sexual y el segundo apomíctico. De estas cruzas se obtuvo un total de 2063 semillas de las cuales solo germinó el 39,31% y de este, solo se obtuvo un 15,85% de plantas normales. Se extrajo ADN de las plantas normales a fin de proceder a determinar la naturaleza híbrida de las mismas. Se utilizaron AFLPs y EST-SSR. Se obtuvieron 691 marcadores de AFLP de los cuales 317 fueron polimórficos. Con estos análisis se determinó que de las 232 plantas analizadas, solo seis resultaron de origen híbrido, es decir que portaban bandas paternas. El resto de las plantas obtenidas provenían de autofecundación del progenitor femenino OTA USDA por efecto mentor del polen del material apomíctico. Esto fue un resultado inesperado, dada la autoincompatibilidad de este genotipo. El segundo análisis con marcadores moleculares, fue realizado con el objetivo de buscar variabilidad dentro del complejo de plantas no hibridas obtenidas. En este caso se analizaron seis combinaciones de primers de marcadores de AFLPs, con los cuales se obtuvieron 376 marcadores en total, de los cuales 46 resultaron ser polimórficos. Se observó variabilidad a nivel molecular y en caracteres morfológicos y agronómicos; el progenitor masculino se diferenció a ambos niveles de las demás plantas; las plantas hijas fueron más similares a la madre aunque algunas la superaron en caracteres de interés. La distancia genética observada entre el progenitor femenino y el masculino pudo haber afectado la obtención de plantas híbridas. El bajo porcentaje de germinación (39%) observado y la elevada mortalidad de plántulas, podría también atribuirse a este factor, correspondiendo las semillas no germinadas y las plantas anómalas a híbridos no viables. Por último, se realizaron 23 ensayos para la transformación de pasto llorón utilizando dos cepas de Agrobacterium tumefaciens que difieren en su capacidad de virulencia, AGL0 y AGL1, ambas conteniendo el vector binario (Ppzp201BUGI). Se inoculó un total de 8428 semillas maduras bajo diferentes condiciones experimentales. Se obtuvo un protocolo de transformación transiente para pasto llorón a partir de semillas maduras. Deberán ajustarse algunas variables a fin de obtener un protocolo de transformación estable. / E. curvula (Schrad.) Nees "weeping lovegrass", is a perennial grass that is an important forage resource for semiarid regions. The overall objective of this thesis was to contribute to the improvement of weeping lovegrass from two strategies. The first involved the development of new hybrid materials from crosses between sexual and apomictic materials and to assess its molecular and agronomic characteristics. On the other hand, we tried to develop a protocol for genetic transformation, based on Agrobacterium tumefaciens, that could contribute to improve forage quality through downregulation of lignin biosynthesis and as a tool for validation of genes related to the reproductive mode. In this work 15 crosses between OTA-S and Tanganyika, both apomictic tetraploid materials, were perform and 2063 seeds were obtained. After two months only the 39.31% of these seeds geminated and 15.85% of these seeds gave origin to viable plants. DNA of these plants was isolated in order to assess the hybrid origin of these plants and also to analyze the variability present in the obtained plant population. EST-SSR and AFLP markers were used with this purpose and 691 AFLP markers were amplified, of which 317 were polymorphic. With these markers it could be established that from 232 analyzed plants, only six were true hybrids. This would indicate that the remaining plants were obtained by self-fertilization of the female parent OTA-S. This was an unexpected result, given the self-incompatibility of this genotype. The second analysis was performed in order to assess the variability within the obtained plant population. Six AFLPs primer combinations allowed to amplify 376 markers of which 46 were polymorphic. A high level of variation was observed at molecular, morphological and agronomic traits; the male parent differed significantly from the other plants at all levels being the offspring plants very variable and similar to the maternal plant and, is some instances superior to this plant in different interesting traits. These results also allowed to assess that the genetic distance between the female and the male parents may have affected the production of hybrid plants. The low percentage of germination (39%) and the high seedlings mortality could also be attributed to this factor.. Finally, 23 transformation assays were performed in order to establish a plant transformation protocol for weeping lovegrass using two Agrobacterium tumefaciens strains differing in its virulence (AGL1 and AGL0) and containing the binary vector Ppzp201BUGI. A total of 8428 mature seeds were inoculated and different treatments were performed changing different parameters in order to establish the best conditions for inoculation and plant regeneration. It was not possible to obtain a protocol for stable transformation but a transient transformation protocol was obtained from mature seeds. Some variables should be adjusted in order to obtain a stable and reliable transformation protocol for weeping lovegrass.

Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, conocida vulgarmente como pasto llorón, es una gramínea forrajera, de origen sudafricano, extensamente cultivada en la zona semiárida templada de Argentina. Es una especie morfológicamente diversa y posee un amplio potencial genético para mejorar las características de resistencia a sequía, frío, productividad y palatabilidad. Desde el punto de vista citogenético se trata de un complejo polimórfico, ya que es un grupo poliploide donde la mayoría de sus miembros se reproducen en forma apomí-ctica. La apomixis es una forma de reproducción asexual (agámica) a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Ha sido descripta en más de 400 especies de angiospermas. La apomixis gametofítica ocurre generalmente en grupos poliploi-des y se cree que ésta probablemente se originó a través de mutaciones en genes de la vía sexual. En el Laboratorio de Biotecnología y Genética Vegetal (CERZOS-Departamento de Agronomía, UNS) se obtuvo, por cultivo in vitro de inflores-cencias de un cultivar tetraploide de pasto llorón, Tanganyika (T), una planta diploide (UNST1122, D). Semillas de esta plan-ta se trataron con colchicina y se obtuvieron dos plantas tetraploides (colchiploides) con un alto grado de sexualidad [UNST1131 (C) y UNST1112 (M)]. Esta serie de plantas per-mite estudiar tanto variaciones producidas por cambio de ploidía como por cambios en el modo reproductivo. El objetivo planteado para esta tesis fue realizar un análisis global del transcriptoma derivado de ovarios diplospóricos y meióticos de esta serie isogénica de pasto llorón, y también del tejido de hoja, de manera de aislar los transcriptos diferenciales por mo-do reproductivo y por cambios de ploidía, y así poder realizar asociaciones genéticas y funcionales sobre los factores deter-minantes de la diplosporía en la especie, especialmente el factor ploidía. A fin de lograr este objetivo se realizó la construcción de bibliotecas de ADNc de la serie euploide isogé-nica (tres bibliotecas de inflorescencias inmaduras pertene-cientes a los genotipos T, D y C, y una biblioteca de hoja del genotipo T), se secuenciaron ESTs de dichas bibliotecas y se hicieron análisis de las ESTs. Además se realizaron estudios de Display Diferencial (DD) de inflorescencias y hojas de la misma serie de plantas, y se secuenciaron y analizaron los transcrip-tos diferenciales por ploidía y modo reproductivo para comple-mentar el estudio de las bibliotecas. De la secuenciación de las bibliotecas se obtuvieron 12.295 ESTs de buena calidad. Luego del ensamblado y agrupamiento, se obtuvieron 8.884 unigenes, incluyendo 1.490 contiguos y 7.394 singletons. El algoritmo BLASTX fue utilizado para el análisis de homología de los unigenes de E. curvula contra la base de datos de Swiss-Prot. Cuarenta y tres por ciento de los genes de Eragrostis encontraron homología con secuencias de trigo (391.939 genes anotados) y cebada (50.423 genes anotados), 49,25% con genes de avena (89.147 genes anotados) y 46,48% con genes de maíz (58.582 genes anotados). Además se detec-taron 254 microsatélites (EST-SSRs) que facilitarán el mapeo utilizando poblaciones segregantes para el carácter apomixis u otros caracteres de calidad forrajera. En los ensayos de DD de inflorescencias inmaduras se generaron en total 4.242 transcriptos y para los experimentos de hoja 7.622. Del total de transcriptos, aproximadamente un 14% de inflorescencias y un 10% de hojas fueron diferenciales entre los distintos genotipos. Estos transcriptos diferenciales integraron tres grupos: los diferenciales por modo reproductivo, los diferen-ciales por ploidía y un grupo particular, los inesperados, que estaban integrados por transcriptos en los que el patrón de expresión era el mismo entre la planta apomíctica tetraploide y diploide sexual, pero distinto en la planta tetraploide sexual. Sesenta (60) bandas de inflorescencias y 42 de hoja fueron clonadas y secuenciadas con éxito. Este número representa un 10,83% y 5,68% del total de bandas diferenciales de inflorescencias y hojas, respectivamente. De los 60 transcrip-tos secuenciados a partir de inflorescencias, 39 (65%) mostraron homología significativa con genes de función conocida. De los 42 transcriptos secuenciados a partir de hojas, 14 (33,33%) mostraron homología con genes de función conocida. Tanto en el análisis de las ESTs como en los DD se mostró que los patrones de expresión de las plantas tetraploides están muy relacionados, mientras que la expresión del genotipo diploide fue significativamente diferente, mostrando que el perfil de expresión, al menos para un gran número de genes, depende del nivel de ploidía. Este comportamiento en la expresión de genes se correlaciona muy bien con la estructura genética y epigenética de la serie en la prueba clásica y parcial de Mantel. Durante la conversión tetraploide-diploide se produce una proporción significativa de modificaciones genéticas y epigenéticas que revierten durante la conversión diploide-tetraploide, lo cual sugiere que algunos loci mantienen una secuencia particular y/o una cierta condición de metilación dependiente del nivel de ploidía. Estas variaciones genéticas y epigenéticas ocurren en un escenario particular de expresión que depende del nivel de ploidía. Sin embargo, un grupo particular de genes mostraron un comportamiento curioso. Ellos se encontraron principalmente silenciados en los genotipos 2x sex. y 4x apo. Este grupo de genes se detectó tanto en los análisis de ESTs como en los realizados mediante la técnica de DD. Ya que las plantas 2x sex. y 4x apo. presentan diferente ploidía y modo reproduc-tivo, el patrón de expresión de estos genes es intrigante. Estos genes candidatos fueron denominados de patrón inesperado o inesperados. La mayoría de los genes de este grupo están sobreexpresados en la planta 4x sex, mientras que están reprimidos en los genotipos 4x apo. y 2x sex. Para explicar la existencia de este grupo de genes inesperados y la relación que podrían llegar a tener con la apomixis y la poliploidía, se plantea que para mantener la sexualidad a nivel tetraploide se requiere de la activación de un grupo de genes en la conversión 2x a 4x, y que esta activación estaría bloqueada (o silenciada) en el genotipo 4x apo, lo que explicaría el grupo de genes silenciados que comparten este genotipo y el diploide sexual. / Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, commonly known as "weeping lovegrass" is a forage grass native from South Africa and widely cultivated in temperate semiarid regions of Argentina. It is a morphologically diverse species and has a large genetic potential for improving the characteristics of drought and cold resistance, productivity and palatability. Cytogenetically it constitutes a polymorphic complex, since it is a polyploid group where most members reproduce by apomixis. Apomixis is an asexual reproduction mode through seeds, which leads to the generation of progeny genetically identical to the maternal plant. Apomixis was described in over 400 species of angiosperms. Gametophytic apomixis generally occurs in polyploid groups and probably was origi-nated through mutations of genes from the sexual pathway. In the Laboratory of Plant Genetics and Biotech-nology (CERZOS-Department of Agronomy, UNS), a diploid plant (UNST1122, D) was obtained by in vitro culture of inflores-cences from plants of the tetraploid cultivar Tanganyika (T). Seeds of the diploid plant were treated with colchicine and DMSO and two plants were obtained, both tetraploids (colchi-ploids), with a high level of sexual reproduction [UNST1131 (C) and UNST1112 (M)]. This series of plants allowed the study of genetic and epigenetic variations caused by changes of ploidy and/or by changes in the reproductive mode. The aim of this thesis was to conduct a comprehensive transcrip-tome analysis of meiotic diplosporous ovaries and leaf tissue of the isogenic series, and to isolate the transcripts that are differential by the reproductive mode and/or by ploidy in order to find out the genetic and functional associations on diplos-pory determinant factors in the species, especially ploidy. To achieve this goal the cDNA libraries of the isogenic euploid series were constructed (three of them from immature inflores-cences belonging to the genotypes T, D and C, and one library of leaves of genotype T), ESTs were sequenced and analysed. Studies of Differential Display (DD) of inflorescences and leaves of the same series of plants were also carried out and differential transcripts related to ploidy and the reproduc-tive mode were sequenced and analyzed in order to comple-ment the study of the libraries. A relatively high number of good quality ESTs (12,295) was obtained. After assembly and clustering, 8,884 unigenes were obtained, including 1,490 contigs and 7,394 singletons. Blastx was used for the analysis of homology of the E. curvula unigenes against SwissProt database. Forty-three percent of the Eragrostis genes found homology with sequences of wheat (391,939 annotated genes) and barley (50,423 annotated genes), 49.25% with oat genes (89,147 genes annotated) and 46.48% with Maize genes (58,582 annotated genes). In addition 254 microsa-tellites (EST-SSRs) were detected that will facilitate the mapping for apomixis or other traits like forage quality using segregating populations. In DD experiments 4,242 transcripts of immature inflorescences and 7,622 from leaf were gene-rated. From these transcripts, approximately 14% from inflo-rescences and 10% from leaves were differentials between genotypes. These differential transcripts were divided into three groups: differential related to the reproductive mode, differential between ploidy levels and unexpected, a particular group which were composed of transcripts in which the expression pattern was similar in the tetraploid apomictic and in the diploid sex plant, but different in the sexual tetraploid plant. Sixty (60) bands from inflorescences and 42 from leaves were successfully cloned and sequenced. This number represents a 10.83% and 5.68% of the total differential bands from flowers and leaves, respectively. Thirty nine (39, 65%) out of 60 sequenced transcripts from inflorescences showed significant homology with genes of known function. Fourteen (14, 33.33%) out of 42 sequenced transcripts from leaves showed homology with genes of known function. ESTs and DD analysis showed that the expression patterns of tetraploid plants are closely related, whereas the expression of the diploid genotype was significantly different, showing that the expression profile, at least for a large number genes, depends on the ploidy level. This behavior in gene expression correla-tes well with the genetic and epigenetic structure of the series in classical and partial Mantel test. During the conver-sion tetraploid-diploid a significant proportion of genetic and epigenetic changes are produced that revert during the convertion diploid-tetraploid, suggesting that some loci have a particular sequence and / or a certain condition of methy-lation-dependent on the ploidy level. These genetic and epigenetic changes occur in a particular stage of expression that depends on the ploidy level. However, a particular group of genes showed a curious behavior. They were mainly silenced in the 2x sex and 4x apo genotypes. This group of genes was detected in both ESTs and DD analysis. Since 2x sex and 4x apo plants have different ploidy level and different reproductive mode, the expression pattern of these genes is intriguing. These candidate genes were called "unexpected". Most genes in this group are overexpressed in the 4x sex plant, while being repressed in the 4x apo and 2x sex genoty-pes. To explain the existence of this group of "unexpected" genes and the relationship that might have with apomixis and polyploidy, we suggest that to maintain active the sexual reproduction at the tetraploid level the activation of a gene cluster is required, and that this activation would be blocked (or silenced) in the 4x apo genotype, explaining the silenced group of genes found in these genotype. The candidates genes were in silico mapped onto the rice and maize chromosomes.

Eragrostis curvula (Schrad.) Nees, pasto llorón, es una gramínea forrajera, de origen sudafricano, extensamente cultivada en la zona semiárida templada de Argentina. El pasto llorón es un complejo polimórfico donde la mayoría de sus miembros se reproducen por apomixis diplospórica, tipo de reproducción asexual a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Los pasos de la apomixis implican evitar la meiosis para generar un saco embrionario no reducido (apomeiosis), desarrollo del embrión sin fecundación de la ovocélula (partenogénesis) y formación de endospermo viable de una manera dependiente o independiente de la fertilización de los núcleos polares. El objetivo general de esta tesis es estudiar la herencia de la diplosporía en Eragrostis curvula y localizar la/s región/nes condicionantes de la misma a través de la obtención de una población de mapeo a nivel tetraploide, segregante para el modo reproductivo, y de la construcción de un mapa genético de alta densidad, basado en marcadores moleculares. El primer paso de trabajo de esta tesis fue obtener una población de mapeo tetraploide proveniente del cruzamiento entre un genotipo sexual (OTA-S, accesión PI574506 del USDA) con un genotipo apomíctico facultativo (cv. Don Walter-INTA). La caracterización fenotípica de los híbridos F1, realizada mediante análisis citoembrológicos, dio como resultado una proporción 1:1 de plantas apomícticas vs. sexuales (34:27, Chi2 = 0,37), lo que concuerda con un modelo de herencia genética de un solo factor dominante. La población segregante para este carácter permitió construir el primer mapa de ligamiento saturado de E. curvula a nivel tetraploide utilizando marcadores moleculares tradicionales (AFLP y SSR) y derivados de secuenciación (GBS-SNP) en el cual se identificó el locus que controla la diplosporía. Se construyeron mapas de ligamiento para cada uno de los parentales por separado con 1.114 marcadores para OTA-S y 2.019 para Don Walter, construyendo en ambos 40 grupos de ligamiento, lo que concuerda con el número de cromosomas al nivel tetraploide. El largo total del mapa de OTA-S fue de 1.335 cM, con una densidad promedio de marcadores 1,22 cM/marcador. La longitud del mapa de Don Walter fue de 1.976,2 cM, con una densidad de promedio de marcadores de 0,98 cM/marcador. El locus responsable de la diplosporía fue mapeado en el grupo de ligamiento 3 de Don Walter. Mediante análisis de sintenia, comparando las secuencias de los marcadores GBS-SNP con genomas completos de especies relacionadas (Oropetium thomaeum, Cenchrus americanus, Setaria italica, Zea mays, Panicum hallii y Oryza sativa) se logró establecer cuáles de los grupos de ligamiento de cada parental corresponderían a los grupos de homólogos / homeólogos. El mapa de ligamiento genético que se logró alcanzar en esta tesis es el primer mapa de este tipo para E. curvula, es el mapa más saturado para el género Eragrostis y uno de los mapas más saturados para entre las gramíneas poliploides forrajeras. / Eragrostis curvula (Schrad.) Nees (weeping lovegrass) is an apomictic species native to Southern Africa that is used as forage grass in semiarid regions of Argentina. Apomixis is a mechanism for clonal propagation through seeds that involves the avoidance of meiosis to generate an unreduced embryo sac (apomeiosis), parthenogenesis, and viable endosperm formation by in a fertilization-dependent or -independent manner. In this thesis, the first saturated linkage map of tetraploid E. curvula is informed, using both traditional (AFLP and SSR) and high-throughput molecular markers (GBS-SNP), and the locus controlling diplospory is identified. Also syntenic relationships with genomes of other grass species are established to identify homologs/homeologs groups. A tetraploid mapping population was obtained from the cross between a sexual genotype (OTA-S) with a facultative apomictic individual of cv. Don Walter. Phenotypic characterization of F1 hybrids by cytoembryological analysis yielded a 1:1 ratio of apomictic vs. sexual plants (34:27, Chi2 = 0.37), which agrees with the model of inheritance of a single dominant genetic factor. The final number of markers was 1,114 for OTA-S and 2,019 for Don Walter. These markers were distributed into 40 linkage groups per parental genotype, which is consistent with the number of E. curvula chromosomes (containing 2 to 123 markers per linkage group). The total length of the OTA-S map was 1,335 cM, with an average marker density of 1.22 cM per marker. The Don Walter map was 1,976.2 cM, with an average marker density of 0.98 cM/marker. The locus responsible for diplospory was mapped on Don Walter linkage group 3. Syntenic analysis , comparing GBS-SNP markers sequences with complete genomes of related species (Oropetium thomaeum, Cenchrus americanus, Setaria italica, Zea mays, Panicum hallii y Oryza sativa) allowed to establish the homologs/homeologs groups for each linkage map and the relationships between both linkage maps. The genetic linkage maps reported in this study, the first such map for E. curvula, is the most saturated map for the genus Eragrostis and one of the most saturated maps for a polyploid forage grass species.