CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) à uma planta nativa do Brasil com grande valor comercial. Isso contribui com a geraÃÃo de milhares de empregos diretos e indiretos, especialmente na RegiÃo Nordeste, em Ãpoca de estiagem. Programas de melhoramento genÃtico vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente semiÃrido a fim de colocÃ-lo em um mercado cada vez mais competitivo. Entre os tipos de proteÃnas de sementes vÃrias tÃm funÃÃo de reserva, estrutural ou metabÃlica. AlÃm disso, as plantas sÃo dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o ataque de patÃgenos. Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito à expressÃo de proteÃnas relacionadas com a patogÃnese nas quais se inclui o grupo das quitinases. A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polÃmero de quitina para a N-acetil glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligaÃÃo β (1-4). As respostas moleculares nos perfis das plantas a nÃvel transcricional tÃm demonstrado serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto de mecanismos de defesa contra patÃgenos invasores. Usando ferramentas de bioinformÃtica foram identificados, no transcriptoma de cajueiro CCP076, dez contigs apresentando alto grau de semelhanÃa com quitinases, endoquitinases, e quitinases-like das famÃlias GH18 e GH 19 de Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus, Vitis vinifera, Aegilops tauschii e Hevea brasiliensis. Os ensaios enzimÃticos das proteÃnas da castanha confirmaram a presenÃa quitinases em seu proteoma. Ainda revelaram uma atividade catalÃtica Ãtima em pH 5. Um perfil de proteÃnas com sitio de ligaÃÃo à quitina tambÃm foi encontrado. Dessa forma, à demonstrado um grande potencial biotecnolÃgico nas quitinases provenientes da castanha de cajueiro CCP76. / The cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant native to Brazil with high market value. This contributes to the generation of thousands of direct and indirect jobs, especially in the Northeast, in the dry season. Breeding program has been selecting the best cashew cultivars adapted to semi-arid environment in order to put it in an increasingly competitive market. Among the types of seed proteins have several reservation function, structural or metabolic. Furthermore, plants are arranged in an array of defense mechanisms against pathogen attack. One of the most studied defense response with respect to the expression of pathogenesis related proteins which are included in the group of chitinases. The enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyse the polymer chitin to N-acetyl glucosamine by either endo or exo cleavage of β connection (1-4). The molecular profiles of responses in plants transcriptional level have been shown to be crucial for the establishment of a set of defense mechanisms against invading pathogens. Using bioinformatics tools were identified in the transcriptome cashew CCP076 ten contigs having high degree of similarity with chitinases, endoquitinases and chitinase-like the GH18 family and GH 19 of Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus , Vitis vinifera, Aegilops tauschii and Hevea brasiliensis. The enzyme assays of chestnut chitinase protein confirmed the presence in their proteome. Also revealed a great catalytic activity at pH 5. A protein profile with chitin-binding site was also found. Of these, it is demonstrated great potential in biotechnological chitinase from CCP76 cashew nuts.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Colletotrichum gloeosporioides à um importante patÃgeno hemibiotrÃfico com uma ampla gama de hospedeiros que causa perdas substanciais de colheitas. Dados recentes mostraram que a resposta hipersensitiva (HR) à um evento envolvido na resistÃncia do feijÃo-de-corda (V.unguiculata) genÃtipo BR-3 contra C.gloeosporioides (isolado LPVD-1). VÃrios estudos tÃm sido realizados sobre os mecanismos de defesa de plantas a patÃgenos hemibiotrÃficos, mas em geral eles continuam a ser mal compreendidos. Anteriormente, comparamos mudanÃas na expressÃo de proteÃnas induzidas em genÃtipos resistentes de feijÃo-de-corda apÃs a infecÃÃo com C. gloeosporioides utilizando uma abordagem proteÃmica. Com base nesses resultados, no presente estudo, avaliamos as respostas de defesa induzidas por C.gloeosporioides em V.unguiculata associadas com a explosÃo oxidativa, o acÃmulo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs), como o Ãnion superÃxido (O2â-), e o perÃxido de hidrogÃnio (H2O2), bem como a expressÃo de genes antioxidantes, utilizando anÃlise por RT-qPCR. Ao mesmo tempo foi analisada a cinÃtica de infecÃÃo de C.gloeosporioides por microscopia Ãptica (MO) e microscopia eletrÃnica de varredura (MEV). O aumento de O2â- e H2O2 foi detectado em feijÃo-de-corda, 2 horas apÃs a inoculaÃÃo (hai) utilizando coloraÃÃo por NBT e DAB, respectivamente. A quantificaÃÃo espectrofotomÃtrica demonstrou dois picos de produÃÃo de H2O2, 2 e 12 hai, mostrando uma cinÃtica bifÃsica. O aumento de H2O2 foi acompanhado por peroxidaÃÃo lipÃdica 2 e 48 hai. As anÃlises de MO e MEV mostraram que C.gloeosporioides foi capaz de gerar estruturas tais como tubos germinativos e apressÃrios e se desenvolver sob a superfÃcie das folhas. No entanto, apesar do desenvolvimento e tentativa de infecÃÃo, alteraÃÃes ultra-estruturais foram observadas na superfÃcie de conÃdios e hifas 8 hai levando a nÃo infecÃÃo de cÃlulas hospedeiras. AnÃlise por RT-qPCR demonstrou que os genes VuFeSODI e VuCuZnSODII apresentaram aumento de expressÃo 4 hai, enquanto que o gene VuCuZnSODI foi bem expresso 12 hai. Em relaÃÃo aos genes associados à regulaÃÃo de H2O2, VuPrxIIBCD mostrou uma forte aumento de transcristos em 2 hai enquanto que, VuAPXI mostrou aumento de expressÃo apenas 12 hai. VuCATI e VuCATII mostram aumento de expressÃo quantitativa dos transcritos 12 hai, indicando que eles sÃo associados a manutenÃÃo de H2O2 em peroxissomos. Contrariamente, a expressÃo dos transcritos de VuPrxIIE foi reprimida nas primeiras horas apÃs a inoculaÃÃo, contudo, apresentaram nÃveis aumentados de expressÃo em 48 hai, sugerindo participar na regulaÃÃo de H2O2 nos cloroplastos. O presente estudo indica que H2O2 tem um papel importante nas estratÃgias de defesa iniciais de feijÃo-de-corda, agindo contra C.gloeosporioides e funcionando como uma molÃcula sinalizadora. AlÃm disso, os genes associados com defesas antioxidantes estudados parecem estar envolvidos, em combinaÃÃo com outras molÃculas, na regulaÃÃo dos nÃveis de H2O2 para prevenir a morte celular e regular a homeostase redox, eventos importantes nos mecanismos de resistÃncia de plantas a patÃgenos. / Colletotrichum gloeosporioides is an important hemibiotrophic pathogen with a broad host range that causes substantial crop losses. Recent data have shown that the hypersensitive response (HR) is one event involved in the resistance of cowpea (V.unguiculata) genotype BR-3 against C.gloeosporioides (LPVD-1 isolate). Several studies have been undertaken on the defense mechanism of plant to hemibiotrophic pathogen, but overall they remain poorly understood. Previously, we have compared changes in protein expression induced in resistant cowpea genotype after infection with C.gloeosporioides using a proteomic approach. Based on these results, in the present study, we evaluated the defense responses induced by C.gloeosporioides in V.unguiculata associated with oxidative burst, accumulation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion (O2â-), hydrogen peroxide (H2O2) as well expression of antioxidant genes using RT-qPCR analysis. At the same time, we analyzed the C.gloeosporioides infection kinetics by optical microscopy (OM) and scanning electron microscopy (SEM). Increased O2â- and H2O2 was detected in cowpea 2 hours after inoculation (hai) using NBT and DAB staining, respectively. Spectrophotometric measurements showed two peaks H2O2 production, 2 and 12 hai, showing a biphasic kinetics. The increase of H2O2 was accompanied by lipid peroxidation 2 and 48 hai. OM and SEM analyzes showed that C.gloeosporioides was able to generate germ tubes and structures such as apressoria and develop under the surface of the leaves. However, despite of the development and attempt to infection, ultra-structural changes were observed on the surface of conidia and hyphae, 8 hai led to no infection of host cells. Analysis by RT-qPCR demonstrated that the genes VuFeSODI and VuCuZnSODII are up- regulated in chloroplasts at 4 hai, while the gene VuCuZnSODI was well up-regulated 12 hai. In relation to genes associated to scavenging of H2O2, VuPrxIIBCD showed a strong up-regulated of transcript at 2 hai while that VuAPXI showed up-regulated only 12 hai. VuCATI and VuCATII showed that the quantitative level of transcript expression was up- regulated 12 hai, indicating that they are important in the maintenance of H2O2 in peroxisomes. Contrarily, VuPrxIIE transcript was down-regulated in the early hours after inoculation, but showed increased expression levels at 48 hai suggesting participate in the regulation of H2O2 in chloroplasts. The present study indicates that H2O2 has an important role in the initial defense strategies of cowpea acting against C.gloeosporioides and functioning as a signaling molecule. Furthermore, genes associated with antioxidant defenses studied here seem to be involved, in combination with other molecules, in the regulation of H2O2 levels toward preventing cell death and regulating the cell redox homeostasis, important events in the resistance mechanisms of plants to pathogens.