<p>Antimicrobial resistant bacteria pose a serious threat to global public health. With the development of antibioticresistance far outpacing the discovery of new antibiotics, there is a need to  develop  alternative  strategies  to  control  bacterial  infections without increasing  antibiotic resistance. This study focused on developing bacteriophage therapy as a non-antibiotic means to control colibacillosis in poultry. Avian colibacillosis causes significant mortality and economic loss to poultry industries around the world. The etiological agent is Avian Pathogenic<em> E.  coli</em> (APEC), with serotypes are O78, O1, O2 and O5 most often associated with infections. Here, seven bacteriophages (AHP, MP1, MP2, AKA, MKA, AHC and MIA) were isolated from human and poultry wastewater samples to target these four APEC serotypes.</p> <p>The host-spectrum analysis of these phages revealed that all seven phages lysed at least two different APEC strains, with four phages lysing four or more distinct APEC serotypes. Taken together, the isolated phages covered 90% (9/10) of O-serotyped APEC strains targeted in our study. When co-cultured with the targeted APEC strain, bacterial concentrations in phage treated APEC cultures (average OD₆₀₀= 0.09) were significantly (P < 0.05) lower than those of untreated cultures  (average  OD₆₀₀=  1.22)  after  4  hr  incubation.  However,  exposure  of  the  phages  to simulated gastric fluid (pH 2.2–2.5) reduced viability of three of the seven phages by 2.35 –4.01 log PFU/mL after 90 min and to undetectable levels after 5 min for other four phages. In contrast, phage viability was not impacted by simulated intestinal fluid (SIF) with no reductions in phage concentrations after exposure to SIF for 3 hr. All seven bacteriophages were encapsulated in sodium  alginate  microcapsules  with  encapsulation  efficiencies  between  94.4%  to  98.9%.  In contrast to unprotected phages, viability of encapsulated phages was reduced by only0.74 –1.21  log PFU/mL when exposed to SGF for 90 min. Incubating the encapsulated phages sequentially in SGF (1 hr) and SIF (3 hr) indicated that 85% -90% of phages were released from the microcapsules after1 hr incubation in SIF with the maximum release of phages from the microcapsules occurring after 3 hr of incubation in SIF. To assess the in vivoefficacy of the phage treatment, broiler chicks were challenged with APEC and treated with a mixture of unprotected and encapsulated phages. Concentrations of the APEC in the ceca of phage treated birds (2.79 log CFU/g) were significantly lower (P < 0.05) than those of untreated birds (6.18 log CFU/g) by 4 d post-challenge. Additionally, in  most  cases,  APEC  was  not  recovered  from  the  lungs  of  phage  treated  birds  whereas concentrations of APEC in lungs of untreated birds was 4.81 log CFU/g. Hence, these results indicate that phage treatmenteffectively controlled APEC colonization and replication in the ceca and lungs of APEC-challenged chickens and provide further evidence of the viability of phage-based treatments as a non-antibiotic means of controlling bacterial infections in chickens.</p>

Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis. APEC causes significant economic losses to the poultry industry. In this study, 66 E. coli isolates were collected from broiler flocks across Mississippi and categorized as clinical and non-clinical isolates. Genotypic and phenotypic characterization of virulence factors and antimicrobial resistance profiles of these E. coli were examined. The data disclosed a higher prevalence of virulence genes in clinical isolates than in non-clinical isolates. High differences on the genotypic and phenotypic antimicrobial resistance among clinical and non-clinical isolates were observed. Whole genome sequences of avian E. coli elaborated a diverse range in genetic composition, phylogenic relationship, antimicrobial resistance, and virulence gene profiles. Collectively, the results showed that the virulence factors and phenotypic characteristics of APEC may play a role in the pathogenesis of avian colibacillosis. Therefore, this study provides insight to understand the epidemiological background, microbial behavior, and pathogenesis of APEC.

Avian pathogenic Escherichia. coli (APEC) and Campylobacter are pathogenic threats to poultry and human health, respectively. In this study, the prevalence of these pathogens in Mississippi broilers and their antimicrobial resistance (AMR) properties were investigated, and a multidrug-resistant APEC strain (APEC-O2-MS1170) was further explored by whole-genome sequencing (WGS). The efficacy of in ovo injection of Lactobacillus in reducing the APEC in broilers was evaluated. Results revealed a high prevalence of APEC and Campylobacter in broilers and broiler products. A lot of isolates were resistant to antibiotics of different sorts. Moreover, the in ovo administration of Lactobacillus did not reduce the incidence of APEC. The WGS of APEC-O2-MS1170 revealed its detailed AMR and virulence properties and alerted a potential zoonotic risk. In conclusion, the Lactobacillus did not reduce the incidence of APEC in broilers, and the prevalence and AMR of APEC and Campylobacter are still challenges faced by the poultry industry.

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Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

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Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.