Des travaux menés au laboratoire sur la biologie des neurofilaments et sur leurs interactions avec les autres constituants du cytosquelette ont montré, sur différents filaments intermédiaires, des sites de fixation de la tubuline libre TBS (« tubulin-binding site »). Parmi les peptides synthétisés correspondants à ces séquences, le peptide NFL-TBS.40-63 issu de la sous-unité légère des neurofilaments (NFL) a révélé in vitro et in vivo des propriétés de ciblage et une action anti-tumorale sur des cellules de glioblastome, tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive, pour laquelle l’efficacité des traitements actuels reste très limitée. L’intérêt thérapeutique de ce peptide est renforcé par le fait qu’il entre peu et qu’il n’a pas d’effet cytotoxique dans des cellules saines (astrocytes, neurones). Dans cette thèse les travaux décrivent les mécanismes d’entrée du peptide NFL-TBS.40-63 dans les cellules de glioblastome, pour mieux comprendre sa sélectivité. Sa spécificité d’action dans ces cellules a été complétée en analysant les effets du peptide sur l’organisation et la fonction mitochondriales. Enfin, nous montrons que le peptide cible des cellules souches neurales, qui pourraient être à l’origine du développement des glioblastomes, et qui pourraient servir d’outil thérapeutique dans de nombreuses pathologies cérébrales, telles que des lésions traumatiques et des maladies neurodégénératives. Ces travaux indiquent que le peptide NFL-TBS.40-63 représente un outil prometteur dans la stratégie thérapeutique des glioblastomes. Il peut aussi permettre de cibler les cellules souches neurales pour développer de nouveaux traitements des pathologies cérébrales. / In the laboratory, investigations on neurofilament biology and on their interactions with other cytoskeleton components showed tubulin-binding sites (TBS) on different intermediate filaments. Among the synthesized peptide corresponding to these sequences, the NFLTBS.40-63 peptide derived from the neurofilament light subunit (NFL), revealed in vitro and in vivo targeting properties and anti-tumour effect on glioblastoma cells, the most frequent and aggressive brain tumour, for which current treatments show very limited effects. The therapeutic value of this peptide is reinforced by its lower uptake and the lack of a major cytotoxic effect in healthy cells (astrocytes, neurons). Works in this thesis describe the uptake mechanisms of the NFL-TBS.40-63 peptide in glioblastoma cells, to better understand its selective internalization. Its specificaction on glioblastoma cells has been completed by the analysis of the peptide effects on the mitochondrial organization and function. Finally, we show that the peptide targets neural stem cells, which could be at the origin of glioblastoma, and serve as a therapeutic tool inseveral brain diseases, such as traumatic injuries and neurodegenerative diseases. Altogether these works indicate that this NFL-TBS.40-63 peptide is a promising tool for therapeutic strategies of glioblastoma. It can also target neural stem cells in order to develop new treatments for various brain disorders.

Die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (scanning ion conductance microscopy, SICM) stellt eine kontaktfreie Methode zur Ermittlung sowohl der Topographie als auch lokalen Ionenleitfähigkeit einer Oberfläche dar. Besonders vorteilhaft ist die Vermeidung mechanischer Beeinflussung bei der Untersuchung flexibler Strukturen, z.B. Lipiddoppelschichten wie Zellen oder künstlich erzeugter Lipidmembranen. Porenüberspannende Membranen (pore-suspending membranes, PSMs) verbinden als ein Beispiel für Modellsysteme eine hohe Stabilität mit lateraler Mobilität und dem Vorhandensein wässriger Kompartimente ober- und unterhalb der Doppelschicht, wie sie auch in der Natur gefunden werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet stellt die Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden, besonders zellpenetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides, CPPs), mit Lipiden und anderen Membranbestandteilen dar. Häufig untersuchte Beispiele sind Melittin, Hauptbestandteil des Giftes der Honigbiene Apis mellifera, sowie Penetratin, dritte Helix der Antennapedia Homöodomäne von Drosophila melanogaster. Generalisierte Protokolle zur Herstellung lösungsmittelfreier PSMs werden vorgestellt. Riesige unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUVs) unterschiedlicher Lipidzusammensetzung wurden hierzu auf porösem Siliziumnitrid (Si3N4), welches mit Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3, hydrophob) bzw. Mercaptoethanol (ME, hydrophil) funktionalisiert worden war, gespreitet. Verwendet wurden GUVs aus reinen Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden sowie aus Mischungen von PC-Lipiden mit Cholesterol und PC-Lipiden mit Phosphatidylserin (PS)-Lipiden. Der Erfolg des Spreitvorgangs wurde durch Abbilden mittels konfokaler Rasterlasermikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SICM verifiziert. Der Hauptteil dieser Arbeit behandelte die Entwicklung und Anwendung CLSM- und SICM-basierter CPP-Titrationsassays zur Aufklärung des Einflusses der Substratfunktionalisierung und der Lipidzusammensetzung der Membranen auf die Wechselwirkung zwischen Melittin bzw. Penetratin und den Lipiddoppelschichten. CLSM-Experimente wurden mit Melittin auf allen zur Verfügung stehenden PSMs sowohl auf hydrophob als auch hydrophil funktiona-lisierten Substraten durchgeführt, während Penetratin auf den drei unterschiedlichen PSMs auf hydrophil funktionalisierten Substraten verwendet wurde. Ein Reißen der Membranen wurde im Fall hydrophil funktionalisierter Substrate für beide Peptide im Bereich von 1–3 µM beobachtet. Bei hydrophob funktionalisierten Substraten induzierte eine dreifach geringere Melittinkonzentration die Zerstörung der Membranen. Sowohl auf hydrophob als auch auf hydrophil funktionalisierten Substraten wurde bei einem Cholesterolanteil von 10% eine Erhöhung der zum Reißen notwendigen Melittinkonzentratin erhalten, während bei 20% PS-Anteil eine Verschiebung zu geringeren Konzentrationen evident wurde. SICM-Experimente wurden mit Melittin auf PC/Cholesterol-PSMs auf hydrophob und hydrophil funktionalisierten Substraten und mit reinen PC-PSMs auf hydrophil funktionalisierten Membranen durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede beobachtet; die gefundenen Konzentrationsbereiche jedoch stimmten mit denen der CLSM-Experimente überein. Darüberhinaus wurde vor dem Reißen der Membranen ein Ansteigen der Porentiefe gefunden, das mit einer erhöhten Membranpermeabilität korrespondiert.

La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés initialement issue du venin du scorpionScorpio maurus palmatus, et est considérée comme faisant partie de la famille des CPP(Cell Penetrating Peptides) depuis de nombreuses années déjà. La MCa présente donc un intérêtthérapeutique certain dans le domaine de la délivrance intracellulaire de cargos, et lestravaux exposés ici cherchent à caractériser au mieux les propriétés de pénétration de la moléculenative ainsi que celle de certains de ses variants.Après avoir quantifié l’internalisation de plusieurs variants tronqués (linéaires), j’ai pu mettreen évidence le fait que tous ces analogues testés ont une capacité à être internalisés bien plusélevée que celle des CPP de référence (notamment Tat et la pénétratine). Parmi ces variants,l’analogue MCaUF1−9 présente l’avantage d’un temps de rétention relativement élevé au seindes cellules, ainsi que d’une accumulation légèrement accrue en environnement acide (ce quiadvient lors de la formation tumeurs solides). Ce nouveau CPP possède donc un certain potentielthérapeutique mais l’étude de la MCa native, remarquablement stable in vivo, reste plusque jamais d’actualité. / Maurocalcine (MCa) is a 33-mer toxin originally isolated from the venom of the scorpioScorpio maurus palmatus, and has been considered as a cell-penetrating peptide (CPP) for severalyears. MCa presents a therapeutic interest for the intracellular delivery of cargoes, andthis thesis aims to characterise the cell penetration properties of the native molecule as well assome of its variants’.After quantifying several truncated (linear) variants’ internalisation, I have been able tohighlight the fact that all of those analogs possess a higher internalization ability than those ofstandard CPP (especially Tat and penetratin). Among those variants, the analog MCaUF1−9 hasa relatively high rentention time within cells, as well as a slightly increased accumulation whenin an acidic environment (which occurs during solid tumours formation). This new CPP showsa certain therapeutic potential but the study of nativeMCa, remarkably stable in vivo, remainsa priority.

Les traitements actuels dirigés contre le VIH ne sont que partiellement efficaces en raison de l'apparition de mutations qui confèrent au virus une grande capacité de résistance aux antirétroviraux existants. Un moyen d'améliorer la lutte contre le virus consiste par conséquent à trouver de nouvelles stratégies d'inhibition. Le complexe de reverse transcription est une des principales cibles pour le développement de traitement anti-SIDA, il catalyse une étape obligatoire du cycle de réplication du virus. Cependant, l'ensemble des inhibiteurs de la transcriptase inverse sont limités par l'apparition rapide de souches résistances. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer des inhibiteurs ciblant spécifiquement la reverse transcriptase (RT) du VIH-1, basée sur des fragments d'anticorps dérivés des anticorps chaînes lourdes de dromadaire appelés VHHs ou encore Nanobodies. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, les Nanobodies ont été délivré efficacement dans les cellules et par conséquent ils présentent tous une forte activité antivirale de l'ordre du nanomolaire. L'étude du mécanisme d'action du Nanobody leader NbRT20 montre qu'il agit en tant qu'inhibiteur conformationnel. Il interagit avec la forme intermédiaire inactive de la RT et empêche la mobilité du sous-domaine thumb requis pour le positionnement correct de la matrice/amorce sur la RT et inhibant l'incorporation des nucléotides dans la chaîne d'ADN naissante déstabilisant l'enzyme dans une conformation inactive, non processive. Pris ensemble, ces résultats montrent que la plate-forme Nanobody peut être très efficace pour générer des intracorps extrêmement puissants et sélectifs pour neutraliser la RT et la réplication virale.Mots clés : HIV-1, RT, Nanobodies, peptide vecteur pénétrant / The rapid emergence of drug-resistant viruses against all approved HIV clinical drugs together with inaccessible latent virus reservoirs and side effects of currently used compounds have limited the potency of existing anti-HIV-1 therapeutics. Therefore, there is a critical need for new safer drugs, active against resistant viral strains. Reverse transcriptase (RT) plays an essential role in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and remains a primary target of anti-HIV-1 drugs. To develop specific HIV inhibitors, we have elaborated a new strategy based on short antibody fragments derived from the unique Heavy-chain antibodies present in Camelidae called Nanobodies that targets RT-activation. The immunization of dromedaries with RT has lead to the isolation of a panel of Nanobodies that tightly bind the two subunits of RT and inhibit its DNA-dependent DNA polymerase activity at nanomolar range. From that screen we have elaborated an intrabody (cell penetrating anti-RT Nanobody) NbRT20 that constitutes a potential interesting anti-HIV compound.We demonstrated that NbRT20 inhibits RT polymerase activity and exhibiting a potent antiviral activity with a subnanomolar IC50. NbRT20 binds the thumb subdomain and restricts its flexibility and mobility resulting in an inactive/non processive dimeric conformation of the enzyme. From a mechanistic point of view, we have showed that NbRT20 is a conformational inhibitor. it prevents proper binding of primer/template and of dNTP and destabilizes the enzyme in an inactive/non processive dimeric conformation.Taken together, these results demonstrated that, the Nanobody platform may be highly effective at generating extremely potent and selective intrabody to neutralize RT and HIV proliferation.Key words: HIV-1, RT, Nanobodies, cell penetrating peptide

Chez les eucaryotes supérieurs, la progression ordonnée du cycle cellulaire est régie par une dizaine de kinases Cdk-cyclines. Les altérations génétiques ou épigénétiques impliquant des oncogènes ou des gènes codant pour des suppresseurs de tumeurs sont souvent associées à l'expression ou l'activation aberrante des Cdks, favorisant ainsi la prolifération cellulaire incontrôlée et notamment le développement de cancers. Malgré la pertinence oncogénique et thérapeutique de ces protéines, leur détection est restée jusqu'à présent limitée à des méthodes indirectes et invasives. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer un biosenseur peptidique fluorescent permettant de reconnaître spécifiquement les Cdk-cyclines. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, le biosenseur a été délivré efficacement dans les cellules. La mise au point d'une quantification ratiométrique du signal a par ailleurs permis d'évaluer l'abondance relative des Cdk-cyclines endogènes. Deux variants plus spécifiques de certains complexes ont pu être développés. Enfin, d'autres versions du biosenseur ont quant à elles permis d'évaluer sa biodistribution in vivo et de mettre au point un essai cellulaire en vue d'un criblage de petites molécules ayant un effet sur l'abondance relative des Cdk-cyclines. / Cdk-cyclins represent key regulators of cell cycle progression among superior eukaryotes. Genetic and epigenetic alterations involving oncogenes or tumor suppressor genes are often associated with aberrant expression or activation of Cdks, leading to the sustained proliferation of cells and by the way to the development of cancers. Despite the oncogenic and therapeutic relevance of these proteins, their detection has so far remained limited to indirect and invasive methods. My Ph.D. thesis work aimed in this context at developing peptidic fluorescent biosensors that specifically recognize Cdk-cyclins. Combined to cell-penetrating peptides, the biosensor was efficiently delivered into cells. Following the development of the signal ratiometric quantification, the relative abundance of endogenous Cdk-cyclins was directly evaluated in living cells. Two other variants, that are more specific towards specific Cdk-cyclin complexes, were also designed. Finally, the development of novel versions of the biosensor allowed us to evaluate its biodistribution in vivo and to set up a cell-based assay to screen small molecules having an effect on Cdk-cyclin relative abundance.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20810号 / 医博第4310号 / 新制||医||1025(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 清水 章, 教授 萩原 正敏, 教授 松原 和夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

<p>  </p> <p>The access of ring junction functionalized 5,6-hydrindanone systems has been elusive in the realm of synthetic methodology, and the functionalization of a pre-built ring system rarely explored. These 5,6-hydridanone systems are prevalent in a variety of terpenoid ring systems, especially that of steroidal molecules. Previous synthetic methods to reach these systems using a Diels-Alder cycloaddition proved to be difficult and lacked labile functional groups that would be useful for substitution after the cycloaddition. The design of the α-nitrile cyclopentenone dienophile allows for both post-cyclization adduct functionalization, as well as lowering the energy barrier of the cycloaddition itself. In this work, it is shown that the Lewis acid promoted Diels-Alder reaction with α-nitrile β-methyl cyclopentenone dienophile can be performed under standard temperatures and pressures unlike previously established methods.1 This reaction can generate four chiral centers in a single synthetic step when the starting materials are prochiral. After the generation of 5,6-hydrindanone systems, radical cleavage of the nitrile functionality also allowed for electrophile trapping at the ring junction. This radical cleavage and electrophile trapping pathway allows for functionalization of a quaternary carbon at the ring junction, a method that should be fruitful in the generation of difficult to synthesize steroidal and other terpenoid molecules.</p> <p>In the work on synthetic cell penetrating peptides, camptothecin whilst a notably effective topoisomerase I inhibitor, has never quite reached it’s potential as a therapeutic due to its poor solubility in living systems. Previously, cationic amphiphilic polyproline helices (CAPH) molecules from the Chmielewski lab have been hydrophobically functionalized through O-alkylation of hydroxyprolines at specific regions within the peptide to generate a hydrophobic face. The combination of the cationic faces and the hydrophobic face have made the CAPH molecules notably cell penetrant and tunable. With camptothecin’s notable insolubility in water, it may serve as valuable surrogate to the hydrophobic groups on CAPH molecules and allowing it to be delivered intracellularly. Using an endogenously cleavable linker, we have worked towards a CPP that acts as a drug delivery vehicle. Acting as a replacement of the hydrophobic residue of a CAPH molecule, camptothecin will be chaperoned into the cell and should be released through the action of intracellular esterases.</p>

Genetic mutations can cause a wide range of diseases, e.g. cancer. Gene therapy has the potential to alleviate or even cure these diseases. One of the many gene therapies developed so far is RNA-cleaving deoxyribozymes, short DNA oligonucleotides that specifically bind to and cleave RNA. Since the development of these synthetic catalytic oligonucleotides, the main way of determining their cleavage kinetics has been through the use of a laborious and error prone gel assay to quantify substrate and product at different time-points. We have developed two new methods for this purpose. The first one includes a fluorescent intercalating dye, PicoGreen, which has an increased fluorescence upon binding double-stranded oligonucleotides; during the course of the reaction the fluorescence intensity will decrease as the RNA is cleaved and dissociates from the deoxyribozyme. A second method was developed based on the common denominator of all nucleases, each cleavage event exposes a single phosphate of the oligonucleotide phosphate backbone; the exposed phosphate can simultaneously be released by a phosphatase and directly quantified by a fluorescent phosphate sensor. This method allows for multiple turnover kinetics of diverse types of nucleases, including deoxyribozymes and protein nucleases. The main challenge of gene therapy is often the delivery into the cell. To bypass cellular defenses researchers have used a vast number of methods; one of these are cell-penetrating peptides which can be either covalently coupled to or non-covalently complexed with a cargo to deliver it into a cell. To further evolve cell-penetrating peptides and understand how they work we developed an assay to be able to quickly screen different conditions in a high-throughput manner. A luciferase up- and downregulation experiment was used together with a reduction of the experimental time by 1 day, upscaling from 24- to 96-well plates and the cost was reduced by 95% compared to commercially available assays. In the last paper we evaluated if cell-penetrating peptides could be used to improve the uptake of an LNA oligonucleotide mimic of GRN163L, a telomerase-inhibiting oligonucleotide. The combination of cell-penetrating peptides and our mimic oligonucleotide lead to an IC50 more than 20 times lower than that of GRN163L.

Limitierend für pharmakologische Therapien ist oft die Unfähigkeit des Wirkstoffes, biologische Membranen zu überwinden, weswegen häufig Transportmoleküle wie z.B. zellpenetrierende Peptide (CPPs, cell penetrating peptides) benutzt werden. Von den über 100 beschriebenen CPPs wurde bisher nur eine kleine Anzahl systematisch verglichen, was die Auswahl des „richtigen“ CPPs für eine Anwendung erschwert. Ziel dieser vorliegenden Arbeit war es, das pro-apoptotische Peptid KLA mittels CPPs spezifisch in Krebszellen zu transportieren. Untersucht wurden: (I) Verschiedene CPPs in unterschiedlichen Zelltypen zur Selektion der „besten“ CPPs; (II) Der Einflusses des CPP C-Terminus auf die Internalisierung und zelluläre Verteilung; (III) Der zelluläre KLA-Transport mittels CPPs via einer nicht-kovalenten Administration. 22 verschiedene CPPs wurden in sieben Zelltypen untersucht, wobei Toxizität, Zellaufnahme und zelluläre Lokalisation mittels Fluorescein markierten CPPs in Fluoreszenzspektroskopie und konfokaler Mikroskopie betrachtet wurden. Abhängig von der Zellaufnahme wurden die CPPs in drei Gruppen klassifiziert. Die Untersuchung carboxylierter und carboxyamidierter CPP C-Termini ergab, dass in den meisten Fällen ein Carboxyamid die zelluläre Aufnahme begünstigte. Drei CPPs (MPG, Penetratin und Integrin) wurden ausgewählt, um das pro-apoptotische KLA Peptid in zwei Krebszelllinien (MCF-7 Brustkrebszellen und leukämische RAW264.7 Makrophagen) im Vergleich zu Fibroblasten (Cos-7) nicht-kovalent zu transportieren. Der erfolgreiche KLA-Transport hing vom CPP, dessen C-Terminus und der Zelllinie ab. Die Analyse der Viabilität nach CPP:KLA Administration ergab, dass MPG-CONH2:KLA (1:2) toxisch für Makrophagen und Brustkrebszellen, aber nicht für Fibroblasten war. Die Toxizität konnte der Apoptose zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Informationen über die Auswahl des passenden CPPs für den nicht-kovalenten Transport des pro-apoptotischen KLA-Peptids. / Limitations in a pharmacological therapy are often due to the inability of drugs to overcome the cell membrane and therefore transporting molecules are being used, e.g. cell penetrating peptides (CPPs). Only a few of the over 100 described CPPs have been compared systematically making the choice of “the” CPP for a given application difficult. The goal of the presented work is the CPP mediated delivery of the pro-apoptotic peptide KLA in breast cancer cells as proof of principle for a therapeutical application. Analysed were (I) Different CPPs in various cell types to select the “best” one, (II) The influence of the CPP C-termini on uptake and localisation, (III) The cellular KLA delivery via a non-covalent CPP administration. 22 CPPs were compared in seven cell types thereby looking at toxicity, cellular uptake and subcellular localisation using fluorescein labelled CPPs for fluorescence spectroscopy and confocal microscopy. The resulting uptake information allowed the classification of the CPPs in three main groups. The evaluation of carboxylated and carboxyamidated CPP C-termini revealed that a carboxyamide mostly enhanced the cellular CPP uptake. Three CPPs were selected (MPG, penetratin and integrin) to deliver the pro-apoptotic KLA peptide in two cancer cell lines (breast cancer MCF-7 cells and RAW264.7 macrophages) compared to fibroblasts (Cos-7) via the non-covalent strategy. A successful KLA delivery depended on the applied CPP, its C-terminus and the used cell line. The biological activity of the pro-apoptotic KLA peptide was determined via the cell viability (MTT assay). The co-incubation of MPG-CONH2:KLA (1:2) was able to induce toxicity in breast cancer cells and leukaemic macrophages, but not in fibroblasts. The viability reductions were then assigned to apoptosis. This work provides important information for the choice of an adequate CPP for the pro-apoptotic KLA peptide delivery and presents the advantage of the non-covalent delivery strategy.

La mitochondrie fournit l'énergie nécessaire au fonctionnement cellulaire, grâce au mécanisme de phosphorylation oxydative. Cette fonction nécessite une expression coordonnée des génomes nucléaires et mitochondriaux assurée par la famille de coactivateurs transcriptionnels PGC-1 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ Coactivator-1), sensibles aux signaux endogènes et/ou environnementaux. Une régulation plus fine de la phosphorylation oxydative par des miRNAs est maintenant soupçonnée. Afin de préciser ces différents modes de régulation dans des modèles cellulaires de carcinomes thyroïdiens, nous avons exploré la voie PRC-dépendante (PGC-related coactivator) et les miRNAs spécifiquement exprimés dans ces modèles présentant une richesse en mitochondries et des niveaux de PRC et de PGC-1α différents. Ce travail a permis de mettre en évidence miR-218 comme marqueur clé de régulation de la fonction mitochondriale. Au-delà de la régulation de l'expression génique, une fourniture énergétique adéquate nécessite également une répartition optimale des mitochondries au sein de la cellule, grâce à d'étroites connexions entre le cytosquelette et la mitochondrie. Des peptides issus de la sous-unité légère des neurofilaments, dont le NFL-TBS.40-63, sont capables d'entrer spécifiquement dans les cellules de glioblastomes humains et d'y déstabiliser le réseau microtubulaire, conduisant à la mort cellulaire par apoptose. Pour étudier l'impact de ce peptide sur le réseau de mitochondries et leurs fonctions, nous avons traité le modèle cellulaire de glioblastomes humains T98G, par différentes concentrations de NFL-TBS.40-63. Ce travail révèle une perturbation du réseau de mitochondries et une diminution de la respiration mitochondriale dans les cellules exposées. L'ensemble de ces travaux doit permettre le développement de traitements ciblés de la fonction mitochondriale.